細胞生物學(xué)設(shè)計型

實驗項目：動物細胞融合細胞生物學(xué)設(shè)計型實驗演講人：李2014年12月2日目錄實驗?zāi)康膶嶒炘韺嶒灢襟E實驗預(yù)期結(jié)果融合率的計算實驗試劑及材料注意事項一、實驗?zāi)康牧私鈩游锛毎娜诤鲜煜EG誘導(dǎo)細胞的方法掌握動物細胞融合的基本原理及方法培養(yǎng)學(xué)生自主設(shè)計實驗，發(fā)現(xiàn)問題和解決問題的能力二、實驗原理一、動物細胞融合1、概念：細胞融合：又稱細胞雜交，由兩個或多個細胞相互接觸后，其細胞膜發(fā)生發(fā)生分子重排，導(dǎo)致細胞合并、染色體等遺傳物質(zhì)重組的過程稱為細胞融合。分為細胞自發(fā)融合和誘導(dǎo)細胞融合。誘導(dǎo)細胞融合：指在人為誘導(dǎo)條件下所發(fā)生的細胞融合現(xiàn)象自發(fā)細胞融合：指在未施加任何條件的情況下所發(fā)生的細胞融合現(xiàn)象。人工合成形成的融合細胞有兩類同核體異核體由同一親本細胞融合而來有不同親本細胞融合而來2、動物細胞融合的基本原理與植物原生質(zhì)體融合的基本原理相同，即細胞膜的流動性3、誘導(dǎo)方式物理法：電激、振動、離心化學(xué)法：聚乙二醇（PEG）生物法:滅活病毒（如：仙臺病毒）4、動物細胞融合的意義打破生殖隔離，使遠緣雜交成為可能；廣泛應(yīng)用于多個學(xué)科領(lǐng)域；重要途徑：制備單克隆抗體。三、實驗步驟（一）、50%PEG液的制備：取一定量的得PEG（MV=4000）放入刻度離心管內(nèi)，在酒精燈上加熱，使其融化，冷卻至50℃時，加入等體積的Hanks液混勻，置之37℃水浴箱中保溫待用。（二）、融合方法：取肝素抗凝的棄血清雞血0.1ml（本實驗是進行同種細胞融合）。將懸液移入離心管中，以800r/min離心7~8min，棄上清液，加入8~10mlHanks液，再次懸浮細胞，離心洗滌二次，棄去上清液后將離心管倒置在濾紙上，盡量流盡剩余液體（這一步很重要，因為殘余液體會改變PEG的濃度）。用手指輕彈離心管底壁，使沉淀物松散，然后吸取制備好的50%PEG4ml，在37℃水浴中，于90s內(nèi)逐滴加入離心管中，邊加邊震蕩離心管，使之與細胞混勻，然后加入8~10Hanks液，輕輕吸打混勻，在37℃水浴中靜置5min以稀釋PEG。離心棄去上清液后，加2~3mlHanks液，在37℃水浴中溫育30min。實驗操作流程（一）50%PEG液的制備取一定量PEG放入刻度離心管內(nèi)在酒精燈上加熱使其融化待降至50℃時加入等體積預(yù)熱的等體積Hanks液混勻置于37℃水浴箱中保溫待用（二）、融合方法取肝素抗凝雞血0.1ml制細胞懸液離心管中800r/min離心7~8min傾去上清液加入8~10mlHanks將懸液移入傾去上清液，將離心管倒置于濾紙上離心管用手輕彈吸取50%PEG0.4ml再次懸浮細胞離心洗滌二次在37℃水浴中加入7~8mlHanks于90s內(nèi)逐滴入離心管在水浴中靜置5min稀釋PEG棄去上清液在37℃水浴中溫育3min在5min10min15min20min30min取懸液制片用0.2%甲基藍染色觀察加2~3mlHanks四、預(yù)期結(jié)果融合過程觀察：分別于溫育5min10min15min20min30min取細胞懸液一滴制成臨時裝片，以0.2%次甲基藍染液染色，在顯微鏡下觀察細胞融合的不同階段，通?？砂讶诤线^程大致分為五個階段。兩個細胞的膜相互接觸，粘連。相接的兩細胞膜破口粘合形成細胞膜通道。兩細胞之間的細胞質(zhì)相遇，形成細胞質(zhì)通道。通道擴大，兩細胞連成一體。細胞合并完成，形成一個含有兩個或多個核的圓形細胞。五、融合率的計算融合率：是指在顯微鏡視野內(nèi)，已發(fā)生融合的細胞，其細胞核的總數(shù)與視野內(nèi)所有細胞（包括已融合和未融合細胞）的細胞核總數(shù)之比。

對孵育30min時制備的臨時裝片計算融合率，通常以百分數(shù)表示，進行多個視野測定值得平均統(tǒng)計更加準確。

融合率=（融合的細胞核數(shù)/總細胞核數(shù)）*100%六、實驗試劑及材料1、材料：雞紅細胞2、試劑：聚乙二醇（PEG，MV=4000）、Hanks液、0.2%次甲基藍染液。3、儀器設(shè)備：顯微鏡、水浴箱、離心機、離心管、載玻片、蓋玻片、酒精燈、試管、吸管，天平、濾紙。實驗試劑表名稱規(guī)格用量說明聚乙二醇0.5ml使細胞膜重排Hanks液10ml洗滌營養(yǎng)細胞0.2%甲基藍染色液適量染色實驗儀器、設(shè)備、器具表名稱規(guī)格、型號數(shù)量說明顯微鏡1觀察細胞融合水浴箱1加熱有利細胞融合離心機1使細胞分離離心管2裝離心液載玻片5制作裝片蓋玻片5制作裝片吸管4吸收細胞液試管3裝液酒精燈1加熱PEG天平1配平濾紙1吸水七、注意事項制備的50%PEG一定要保存于37℃水浴中，