蘭州大學(xué) 第4章 蛋白質(zhì)的共價結(jié)構(gòu)

第四章蛋白質(zhì)的共價結(jié)構(gòu)一、蛋白質(zhì)通論一、蛋白質(zhì)的化學(xué)組成和分類蛋白質(zhì)的元素組成：主要由C、H、O、N、S組成，其中含N平均為16%，這一數(shù)據(jù)可用于蛋白質(zhì)的含量測定，是凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)含量=蛋白氮/16%=蛋白氮×6.25蛋白質(zhì)按化學(xué)組成分類

單純蛋白質(zhì)：完全由氨基酸組成，不含非蛋白成分。根據(jù)溶解性的不同，可將簡單蛋白分為7類：清蛋白（溶于水）球蛋白（溶于稀鹽溶液）谷蛋白（溶于稀酸或稀堿）醇溶蛋白（溶于70%-80%的乙醇）組蛋白（溶于水或稀酸，可用稀氨水沉淀）精蛋白（溶于水或稀酸，不溶于氨水）硬蛋白（只能溶于強酸）。

（二）綴合蛋白由蛋白質(zhì)和非蛋白成分組成，后者稱為輔基。根據(jù)輔基的不同，可將結(jié)合蛋白分為以下7類：核蛋白、脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白、血紅素蛋白、黃素蛋白和金屬蛋白。（三）按蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能分類1．酶生物體內(nèi)的酶都是由蛋白質(zhì)構(gòu)成的，沒有酶，生物體內(nèi)的各種化學(xué)反應(yīng)就無法正常進行。2．調(diào)節(jié)蛋白某些激素、一切激素受體和許多其他調(diào)節(jié)因子都是蛋白質(zhì)。3．轉(zhuǎn)運蛋白脊椎動物的血紅蛋白和無脊椎動物的血藍蛋白起著運輸氧氣的作用；血液中的載脂蛋白可運輸脂肪，轉(zhuǎn)鐵蛋白可轉(zhuǎn)運鐵；一些脂溶性激素的運輸也需要蛋白，如甲狀腺素要與甲狀腺素結(jié)合球蛋白結(jié)合才能在血液中運輸。4．貯存蛋白某些蛋白質(zhì)的作用是貯存氨基酸作為生物體的養(yǎng)料和胚胎或幼兒生長發(fā)育的原料。此類蛋白質(zhì)包括蛋類中的卵清蛋白、奶類中的酪蛋白和小麥種子中的麥醇溶蛋白等。肝臟中的鐵蛋白可將血液中多余的鐵儲存起來，供缺鐵時使用。5．收縮和游動蛋白肌肉中的肌球蛋白和肌動蛋白是運動系統(tǒng)的必要成分，它們構(gòu)像的改變引起肌肉的收縮，帶動機體運動。細菌中的鞭毛蛋白有類似的作用，它的收縮引起鞭毛的擺動，從而使細菌在水中游動。6．結(jié)構(gòu)蛋白蛋白質(zhì)可以作為生物體的結(jié)構(gòu)成分。高等動物的膠原蛋白是主要的細胞外結(jié)構(gòu)蛋白，占蛋白總量的1/4；細胞膜、線粒體、葉綠體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等膜系統(tǒng)都是由蛋白質(zhì)與脂類組成的；動物的毛發(fā)和指甲都是由角蛋白構(gòu)成的。7.支架蛋白這一類蛋白質(zhì)主要起到支架作用，并且在這種蛋白上能完成某些蛋白的裝配。如錨定蛋白就屬于支架蛋白。8．保護和開發(fā)蛋白高等動物的免疫反應(yīng)是機體的一種防御機能，它主要也是通過蛋白質(zhì)（抗體）來實現(xiàn)的。凝血與纖溶系統(tǒng)的蛋白因子、溶菌酶、干擾素等，也擔(dān)負著防御和保護功能。某些生物能合成有毒的蛋白質(zhì)，用以攻擊或自衛(wèi)。白喉毒素可抑制真核生物的蛋白質(zhì)合成。9．異常蛋白除具有上述功能蛋白質(zhì)以外的一類蛋白質(zhì)。二、蛋白質(zhì)的形狀和大小按蛋白質(zhì)的形狀和溶解度可將蛋白質(zhì)分為：纖維狀蛋白質(zhì)、球狀蛋白質(zhì)和膜蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量差別很大。三、蛋白質(zhì)構(gòu)像和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的

組織層次蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，可分為不同的結(jié)構(gòu)層次：一級結(jié)構(gòu)：多肽鏈的氨基酸序列。二級結(jié)構(gòu)：多肽鏈借助氫鍵形成的有規(guī)則的局部結(jié)構(gòu)，如α螺旋、β折疊等。三級結(jié)構(gòu)：多肽鏈借助各種非共價鍵彎曲折疊具有特定走向的緊密球狀構(gòu)象。四級結(jié)構(gòu)：指寡聚蛋白質(zhì)中個亞基之間在空間上的相互關(guān)系和結(jié)合方式。四、蛋白質(zhì)功能的多樣性

蛋白質(zhì)序列的多樣性(P160)決定了其功能的多樣性。如：20種蛋白質(zhì)形成的二十肽（每種氨基酸只用1次）可以形成的異構(gòu)體為：20！=2×1018。又如：相對分子質(zhì)量為34000的蛋白質(zhì)含12種氨基酸，假定在肽鏈的任一位置，12種氨基酸出現(xiàn)的概率相等，則34000/120=283，12283=10305。催化：大多數(shù)酶是蛋白質(zhì)。調(diào)節(jié)：如激素和反式作用因子。轉(zhuǎn)運：如血紅蛋白、血清蛋白、載酯蛋白、膜轉(zhuǎn)運蛋白等。貯存：如種子蛋白和卵清蛋白。運動：如肌肉、微管蛋白等。結(jié)構(gòu)成分：如角蛋白、膠原蛋白等。結(jié)構(gòu)成分：如角蛋白、膠原蛋白等。支架作用：如錨定蛋白、連接蛋白等。防御和進攻：如抗體、毒蛋白等。異常功能：如甜蛋白、膠質(zhì)蛋白等。第二節(jié)肽一、肽和肽鍵的結(jié)構(gòu)肽鍵的C和N均為sp2雜化，有部分雙鍵的性質(zhì)，相關(guān)的6個原子處于共平面，稱作肽平面，肽平面內(nèi)兩個Cα多處于反式構(gòu)型。

二、肽的物理和化學(xué)性質(zhì)肽的等電點計算需先分別判斷各解離基團的帶電荷情況，再統(tǒng)計凈電荷的量。肽的化學(xué)反應(yīng)與氨基酸類似，同時，由于肽鍵的存在，肽可以進行雙縮脲反應(yīng)。三、天然存在的活性肽均為9肽，僅2個氨基酸有差別，生理功能差別極大。+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-Met-腦啡肽+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Leu-腦啡肽由細菌分泌的多肽，含有D-氨基酸和一些不常見氨基酸，如鳥氨酸（Ornithine，縮寫為Orn）第三節(jié)蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定一、蛋白質(zhì)測序的策略

確定蛋白質(zhì)的純度在97%以上。測定多肽鏈的數(shù)目。拆分多肽鏈。分析每一條多肽鏈的氨基酸組成。鑒定多肽鏈的N—末端和C—末端氨基酸殘基。用兩種以上方法裂解多肽鏈成較小的肽段。測定各肽段的氨基酸序列。拼接各肽段成完整的多肽鏈。確定二硫鍵的位置。二、N-末端和C-末端氨基酸殘基的鑒定

（一）N-末端的測定二硝基氟苯(DNFB)法(Sanger法)：2，4-二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與肽鏈N-端的游離氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性條件下水解，得到黃色DNP-氨基酸。該產(chǎn)物能夠用乙醚抽提分離。不同的DNP-氨基酸可以用色譜法進行鑒定。

丹磺酰氯法：在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以與N-端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的優(yōu)點是丹磺酰-氨基酸有很強的熒光吸收，檢測靈敏度可以達到1×10-9mol，比DNFB法靈敏100倍。異硫氰酸苯酯(PITC)法：N末端氨基酸生成相應(yīng)的PTH（苯乙內(nèi)酰硫脲）–AA，并脫離肽鏈，可連續(xù)測定N末端氨基酸，廣泛應(yīng)用于肽鏈的氨基酸序列測定。氨肽酶法：氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐個水解肽鏈，釋放氨基酸。根據(jù)不同的反應(yīng)時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，按反應(yīng)時間和氨基酸殘基釋放量作動力學(xué)曲線，可以確定蛋白質(zhì)的N-末端殘基。（二）C-末端的測定

還原法：C末端氨基酸可用硼氫化鋰還原生成相應(yīng)的α氨基醇。肽鏈水解后，再用層析法鑒定。

肼解法：多肽與肼在無水條件下加熱，可斷裂所有的肽鍵，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的酰肼化合物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離，C末端氨基酸可用紙層析鑒定。但精氨酸會變成鳥氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破壞。

羧肽酶法：將蛋白質(zhì)在pH8.0，30℃與羧肽酶一起保溫，按一定時間間隔取樣，用紙層析測定釋放出來的氨基酸，根據(jù)氨基酸的量與時間的關(guān)系，就可以知道C末端氨基酸的排列順序。目前常用的羧肽酶有四種：A，B，C和Y；A和B來自胰臟；C來自柑桔葉；Y來自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro，Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸殘基；B只能水解Arg和Lys為C-末端殘基的肽鍵。通常將二者混合使用。羧肽酶Y可作用于任何氨基酸，因而，除用來測定C末端氨基酸外，還可以用來測定氨基酸的排列順序。三、二硫橋的斷裂

四、氨基酸組成的分析

一般用酸水解，得到氨基酸混合物，再分離測定氨基酸。目前用氨基酸自動分析儀，2－4小時即可完成。蛋白質(zhì)的氨基酸組成，一般用每分子蛋白質(zhì)中所含的氨基酸分子數(shù)表示。不同種類的蛋白質(zhì)，其氨基酸組成相差很大。五、多肽鏈的部分裂解和肽段混合物的分離純化可以用酶水解法或化學(xué)水解法將蛋白質(zhì)水解成肽段。肽段的分離純化可用層析法或電泳法。溴化氰斷裂法：羥胺斷裂法：斷裂Asn-Gly之間的肽鍵，但專一性不強，也可以斷裂Asn-Leu和Asn-Ala之間的鍵。六、肽段氨基酸序列的測定（一）Edman化學(xué)降解法

用此原理已制成蛋白質(zhì)序列分析儀。若每次循環(huán)的準(zhǔn)確度為99%，經(jīng)60次循環(huán)，準(zhǔn)確度為：0.9960=0.54。（二）降解法

可用氨肽酶和羧肽酶，只能測出末端的幾個氨基酸。羧肽酶Y可作用于任何氨基酸，有可能以此為基礎(chǔ)開發(fā)出新的氨基酸的順序測定儀。（三）根據(jù)核苷酸序列推定法分離mRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄測定cDNA的核苷酸序列，再用遺傳密碼推定氨基酸序列。（四）質(zhì)譜法可分析微量的肽鏈，短肽在第一臺質(zhì)譜儀中經(jīng)電噴射電離，按荷質(zhì)比分離，依次在經(jīng)碰撞池被裂解成離子碎片，在第二臺質(zhì)譜儀中測出各個離子碎片的譜線，推算出短肽的氨基酸序列。在蛋白質(zhì)組學(xué)中應(yīng)用廣泛，但不能區(qū)分亮氨酸和異亮氨酸。七、肽段在多肽鏈中次序的決定肽段A法水解得到四個小肽：A1Ala-PheA2Gly-Lys-Asn-TyrA3Arg-TyrA4His-ValB法水解得到四個小肽：B1Ala-Phe-Gly-LysB2Asn-Tyr-ArgB3Tyr-His-Val重疊法：Ala-Phe-Gly-Lys－Asn-Tyr-Arg－Tyr-His-Val八、二硫橋位置的確定用對角線電泳法：九、蛋白質(zhì)測序舉例（胰島素的序列測定）十、蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫歐洲生物信息中心研究所和瑞士生物信息研究所共同管理的SWISS-PROT有10多萬條肽鏈的信息。美國國家生物醫(yī)學(xué)基金會主持的PIR有近30萬條肽鏈的信息，但多數(shù)由核酸信息翻譯而來，有些未經(jīng)嚴(yán)格檢驗。美國政府支持的GenBank和歐洲的EMBL有大量的基因序列信息，從其閱讀框可以得到蛋白質(zhì)序列的不少信息。第四節(jié)蛋白質(zhì)的氨基酸序列

與生物功能一、同源蛋白質(zhì)的物種差異與生物進化細胞色素C的物種差異。二、同源蛋白質(zhì)具有共同的進化起源血紅素蛋白與肌紅蛋白絲氨酸蛋白酶類:顯示明顯的序列同源性。一些功能差異很大的蛋白質(zhì):如溶菌酶和α-乳清蛋白功能差異很大，但有序列同源性。蛋白質(zhì)家族的形成可能有趨同進化和趨異進化兩種機制。三、血液凝固與氨基酸序列的局