食品微生物檢驗(yàn)

食品微生物檢驗(yàn)微生物定義微生物是一群個(gè)體微小，結(jié)構(gòu)簡單，用肉眼難以看到，必須借助光學(xué)顯微鏡才能看清的低等微小生物的總稱。

微生物的特點(diǎn)個(gè)體小,面積大：小于0.1mm。肉眼不可見。分布廣,種類多（10萬多種）：自然界中到處都有，如水、空氣、土壤等,

土壤中的數(shù)量最多。代謝強(qiáng)，轉(zhuǎn)化快：發(fā)酵乳糖的細(xì)菌在1小時(shí)內(nèi)可分解其自重1000～10000倍的乳糖；產(chǎn)朊假絲酵母合成蛋白質(zhì)的能力比食用公牛強(qiáng)10萬倍生長旺，繁殖快：微生物有驚人的繁殖速度，大多數(shù)微生物幾十分鐘內(nèi)就可以繁殖一代適應(yīng)性強(qiáng)，易變異（耐藥性產(chǎn)生的原因）微生物學(xué)定義微生物學(xué)是研究微生物在一定條件下的形態(tài)與結(jié)構(gòu)、營養(yǎng)與代謝、遺傳與變異、生態(tài)與進(jìn)化、分類與鑒定等問題的一門科學(xué)，是生物學(xué)中一個(gè)重要分支。分類1、按研究對象不同分為：細(xì)菌學(xué)、病毒學(xué)、真菌學(xué)等2、按應(yīng)用領(lǐng)域不同分為：農(nóng)業(yè)微生物學(xué)、工業(yè)微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)微生物學(xué)、獸醫(yī)微生物學(xué)、海洋微生物學(xué)、食品微生物學(xué)

食品微生物檢驗(yàn)定義食品微生物檢驗(yàn)是應(yīng)用微生物學(xué)的理論與方法，研究外界環(huán)境和食品微生物種類、數(shù)量、性質(zhì)、活動(dòng)規(guī)律及其對人和動(dòng)物健康的影響。目的是為生產(chǎn)出安全、衛(wèi)生、符合標(biāo)準(zhǔn)的食品提供科學(xué)依據(jù)。要是生產(chǎn)工序的各個(gè)環(huán)節(jié)得到及時(shí)控制，不合格的食品原料不能投入生產(chǎn)，不合格的成品不能投放市場，更不能被消費(fèi)者接受，因而對食品進(jìn)行微生物檢驗(yàn)至關(guān)重要。內(nèi)容1、從食品加工過程角度看包括食品生產(chǎn)環(huán)境、原料、加工過程、成品運(yùn)輸和保存全過程的微生物檢驗(yàn)2、從面向微生物的對象看，描述了各種指標(biāo)菌的微生物特性和常規(guī)檢驗(yàn)方法，有的補(bǔ)充了一些特殊檢驗(yàn)方法3、從面向食品的對象看，分別描述了每種食品的常見的微生物，樣品的采集、處理、檢驗(yàn)的方法和程序以及有關(guān)材料和用品4、從學(xué)科的邏輯結(jié)構(gòu)看，食品微生物檢驗(yàn)分為食品微生物學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)、微生物學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)、食品中常見的微生物檢驗(yàn)、常見食品的微生物學(xué)檢驗(yàn)意義首先是衡量食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，也是判定被檢食品能否食用的科學(xué)依據(jù)之一。其次通過食品微生物檢驗(yàn)，可以判斷食品加工環(huán)境及食品衛(wèi)生情況，能夠?qū)κ称繁患?xì)菌污染的程度做出正確的評價(jià)，為各項(xiàng)衛(wèi)生管理工作提供科學(xué)依據(jù)，提供傳染病和人類、動(dòng)物的食物中毒的預(yù)防措施。再次食品微生物檢驗(yàn)是一貫徹“預(yù)防為主”的衛(wèi)生方針，可以有效地防止或者減少食物中毒和人畜共患病的發(fā)生，保障人民的身體健康；同時(shí)它對提高產(chǎn)品質(zhì)量，避免經(jīng)濟(jì)損失，保證出口等方面有政治和經(jīng)濟(jì)上的重大意義有害微生物對人類和生產(chǎn)的影響引起食物變質(zhì)引起食物中毒導(dǎo)致人體患病食品微生物檢驗(yàn)的范圍生產(chǎn)環(huán)境的檢驗(yàn)原輔料的檢驗(yàn)食品加工、儲(chǔ)藏、銷售儲(chǔ)環(huán)節(jié)的檢驗(yàn)食品的檢驗(yàn)微生物檢驗(yàn)的指標(biāo)菌落總數(shù)菌落總數(shù)是指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后所得1g或1ml檢樣中所含細(xì)菌菌落的總數(shù)。它可以反應(yīng)食品的新鮮度、被細(xì)菌污染的程度、生產(chǎn)過程中食品是否變質(zhì)和食品生產(chǎn)的一般衛(wèi)生狀況等。因此它是判斷食品衛(wèi)生的重要依據(jù)之一。大腸菌群包括大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌的一些中間類型的細(xì)菌。這些細(xì)菌是寄居于人及溫血?jiǎng)游锬c道的常居菌，它隨著大便的排出體外。食品中如果大腸菌群數(shù)越多，說明食品受糞便污染的程度越大。故以大腸菌群作為糞便污染食品的衛(wèi)生指標(biāo)來評價(jià)食品的質(zhì)量，具有廣泛的意義。致病菌致病菌即能夠引起人們發(fā)病的細(xì)菌。對不同的食品和不同的場合，應(yīng)選擇一定得參考菌群進(jìn)行檢驗(yàn)。霉菌及其毒素我國還沒有制定出霉菌的具體指標(biāo),鑒于有很多霉菌能夠產(chǎn)生毒素,引起疾病,故應(yīng)該對產(chǎn)毒霉菌進(jìn)行檢驗(yàn).其他指標(biāo)指標(biāo)還應(yīng)包括病毒,肝炎病毒,豬瘟病毒,雞新城疫病毒,馬立克氏病毒,口蹄疫病毒,狂犬病病毒,豬水泡病毒等;另外,從食品檢驗(yàn)的角度考慮,寄生蟲也被很多學(xué)者列為微生物食品中微生物的污染途徑通過水污染通過空氣污染通過人及動(dòng)物污染通過工具及雜物污染微生物檢驗(yàn)室微生物檢驗(yàn)室基本條件微生物檢驗(yàn)室通常包括實(shí)驗(yàn)室和無菌室（包括無菌室外的緩沖間）。各室的共同要求是高度的清潔衛(wèi)生，也就是要盡可能地創(chuàng)造無菌條件微生物檢驗(yàn)室必須具備保證顯微鏡工作、微生物分離培養(yǎng)及基本化學(xué)工作順利進(jìn)行的基本條件，如（1）光線明亮，但避免陽光直射室內(nèi)（2）潔凈無菌，地面與四壁平滑，便于清潔和消毒

（3）空氣清新，應(yīng)有防風(fēng)、防塵設(shè)備（4）要有安全、適宜的電源和充足的水源（5）具備整潔、穩(wěn)固、適用的試驗(yàn)臺(tái)，臺(tái)面最好有耐酸堿、防腐蝕的黑膠板（6）顯微鏡及實(shí)驗(yàn)室常用的工具、藥品應(yīng)設(shè)有相應(yīng)的存放櫥柜

食品微生物檢驗(yàn)的一般程序

一、檢驗(yàn)前準(zhǔn)備

(1)準(zhǔn)備好所需的各種儀器，如冰箱、恒溫水浴箱、顯微鏡等。

(2)各種玻璃儀器，如吸管、平皿、廣口瓶、試管等均需刷洗干凈(121℃20min)或干法(160℃一170℃，2h)滅菌，冷卻后送無菌室備用

(3)準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)所需的各種試劑、藥品，做好普通瓊脂培養(yǎng)基或其他選擇性培養(yǎng)基，根據(jù)需要分裝試管或滅菌后傾注平板或保存在46℃的水浴中或保存在4℃的冰箱中備用。

(4)無菌室滅菌；如用紫外燈法滅菌，時(shí)間不應(yīng)少于45mln，關(guān)燈半小時(shí)后方可進(jìn)入工作；如用超凈工作臺(tái)，需提前半小時(shí)開機(jī)。必要時(shí)進(jìn)行無菌室的空氣檢驗(yàn)，把瓊脂平板暴露在空氣中15min，培養(yǎng)后每個(gè)平板上不得超過15個(gè)菌落。

(5)檢驗(yàn)人員的工作衣、帽、鞋、口罩等滅菌后備用。工作人員進(jìn)入無菌室后．實(shí)驗(yàn)沒完成前不得隨便出入無菌室。

二、樣品的采集與處理

在食品的檢驗(yàn)中，樣品的采集是極為重要的一個(gè)步驟。所采集的樣品必須具有代表性，這就要求檢驗(yàn)入員不但要掌握正確的采樣方法，而且要了解食品加工的批號、原料的來源、加工方法、保藏條件、運(yùn)輸、銷售中的各環(huán)節(jié)，以及銷售入員的責(zé)任心和衛(wèi)生知識(shí)水平等。樣品可分為大樣、中樣、小樣三種。大樣指一整批，中樣是從樣品各部分取的混合樣，一般為200g，小樣又稱為檢樣，一般以25g為準(zhǔn)，用于檢驗(yàn)。樣品的種類不同，采樣的數(shù)量及采樣的方法也不一樣。但是，一樣品的采集必須具有代表性，即所取的樣品能夠代表食物的所有成分。如果采集的樣品沒有代表性，即使一系列檢驗(yàn)工作非常精密、淮確，其結(jié)果也毫無價(jià)值，甚至?xí)霈F(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)論。三、樣品的送檢與檢驗(yàn)

(1)采集好的樣品應(yīng)及時(shí)送到食品微生物檢驗(yàn)室，越快越好，一般不應(yīng)超過3h，如果路途遙遠(yuǎn)，可將不需冷凍的樣品保持在1℃一5℃的環(huán)境中，勿使凍結(jié)，以免細(xì)菌遭受破壞；如需保持冷凍狀態(tài)，則需保存在泡沫塑料隔熱箱內(nèi)(箱內(nèi)有干冰可維持在0℃以下)，應(yīng)防止反復(fù)冰涼和溶解。

(2]樣品送檢時(shí)，必須認(rèn)真填寫申請單，以供檢驗(yàn)入員參考。

(3)檢驗(yàn)人員接到送檢單后，應(yīng)立即登記，填寫序號，并按檢驗(yàn)要求放在冰箱或冰盒中，并積極準(zhǔn)備條件進(jìn)行檢驗(yàn)。

(4)食品微生物檢驗(yàn)室必須備有專用冰箱存放樣品，一般陽性樣品發(fā)出報(bào)告后3d(持殊情況可適當(dāng)延長)方能處理樣品；進(jìn)口食品的陽性樣品，需保存六個(gè)月方能處理，每種指標(biāo)都有一種或幾種檢驗(yàn)方法，應(yīng)根據(jù)不同的食品、不同的檢驗(yàn)?zāi)康膩磉x擇恰當(dāng)?shù)臋z驗(yàn)方法。本次重點(diǎn)介紹的是通常所用的常規(guī)檢驗(yàn)方法，主要參考現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)。但除了國標(biāo)外，國內(nèi)尚有行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(如出口食品微生物檢驗(yàn)方法)，國外尚有國際標(biāo)準(zhǔn)(如FAo標(biāo)準(zhǔn)、wHo標(biāo)準(zhǔn)等)和每個(gè)食品進(jìn)口因的標(biāo)準(zhǔn)(如美國FDA標(biāo)準(zhǔn)h日本厚生省標(biāo)準(zhǔn)、歐共體標(biāo)準(zhǔn)等)?？傊畱?yīng)根據(jù)食品的消費(fèi)去向選擇相應(yīng)的檢驗(yàn)方法。

五、結(jié)果報(bào)告

樣品檢驗(yàn)完畢后，檢驗(yàn)人員應(yīng)及時(shí)填寫報(bào)告單，簽名后送主管人核章，以示生效，并立即交給食品衛(wèi)生監(jiān)督人員處理。

接種室、培養(yǎng)室空氣熏蒸消毒甲醛熏蒸消毒法（1）加熱熏蒸按熏蒸空間計(jì)算，量取甲醛溶液，盛在小燒杯或白瓷坩堝內(nèi)，用鐵架支好，點(diǎn)燃酒精燈，關(guān)閉室門。甲醛溶液煮沸揮發(fā)，酒精燈最好能在甲醛蒸完后即自行熄滅。所需酒精的量要加以控制。（2）氧化熏蒸稱取高錳酸鉀（相當(dāng)于甲醛用量的1/2）于一白瓷坩堝或玻璃燒杯內(nèi)，再量取定量的甲醛溶液，準(zhǔn)備妥當(dāng)后，把甲醛溶液倒在盛有高錳酸鉀的器皿內(nèi)，立即關(guān)門。甲醛溶液即沸騰揮發(fā)。高錳酸鉀是一種強(qiáng)氧化劑，當(dāng)它與一部分甲醛溶液作用時(shí)，由氧化作用產(chǎn)生的熱可使其余的甲醛溶液揮發(fā)為氣體。甲醛溶液熏蒸后關(guān)門密閉保持12h以上。硫磺熏蒸法稱好硫磺粉，將其放在墊有幾張廢紙或火柴棍的白瓷坩堝或燒杯內(nèi)，點(diǎn)火燃燒，密閉24h，硫磺燃燒前在室內(nèi)墻壁、桌面、地上噴灑些水，使之產(chǎn)生的H2SO3殺菌力增強(qiáng)。為了防止H2SO3和H2SO4對金屬腐蝕，熏蒸前將金屬制品妥善處理。微生物檢驗(yàn)室技術(shù)操作（一）無菌操作要求（二）無菌室使用要求（一）無菌操作要求：無菌操作目的：防止試驗(yàn)操作中人為污染樣品；保證工作人員安全，防止檢出的致病菌由于操作不當(dāng)造成個(gè)人污染。接種時(shí)必須穿工作服、戴工作帽。進(jìn)行接種食品樣品時(shí)，必須穿專業(yè)工作服、帽及拖鞋，它們應(yīng)放在無菌室緩處間，工作前經(jīng)紫外線消毒后使用。應(yīng)在進(jìn)無菌室前用肥皂洗手，然后用75%酒精棉球?qū)⑹植粮蓛簟＿M(jìn)行接種所用的吸管、平皿及培養(yǎng)基等必須經(jīng)消毒滅菌，打開包裝未使用完的器皿，不能放置后再使用，金屬用具應(yīng)高壓滅菌或用95%酒精點(diǎn)燃燒灼3次后使用。從包裝中取出吸管時(shí)，吸管尖部不能觸及外露部位，使用吸管接種于試管或平皿時(shí)，吸管尖不能觸及試管或平皿邊。接種樣品、轉(zhuǎn)種細(xì)菌必須在酒精燈前操作，接種細(xì)菌或樣品時(shí)，吸管從包裝中取出后及打開試管塞都要通過火焰消毒。接種環(huán)或接種針在接種細(xì)菌前應(yīng)經(jīng)火焰燒灼全部金屬絲，必須時(shí)還要燒到環(huán)和針與桿的連接處。吸管吸取菌液或樣品時(shí)，應(yīng)用相應(yīng)的橡皮頭吸取，不得直接用口吸。（二）無菌室使用要求無菌室通向外面的窗戶應(yīng)為雙層玻璃，并要密封，不得隨意打開，并設(shè)有與無菌間大小相應(yīng)的緩沖間及推拉門，另設(shè)有小窗，以備進(jìn)入無菌間后傳遞物品。無菌室內(nèi)應(yīng)保持清潔，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，拭擦工作臺(tái)面，不得存放與實(shí)驗(yàn)無關(guān)的物品。無菌室使用前后應(yīng)將門關(guān)緊，打開紫外線，如采用室內(nèi)懸吊紫外燈消毒時(shí)，需30W紫外燈，距離在1.0m處，照射時(shí)間不少于30min，使用紫外燈，應(yīng)注意不得直接在紫外線下操作，以免引起損傷，燈管每隔兩周需用酒精棉球輕輕拭擦，除去上面灰塵和油垢，以減少紫外線穿透的影響。處理和接種食品標(biāo)本時(shí)，進(jìn)入無菌室操作，不得隨意出入，如需要傳遞物品，可通過小窗傳遞。在無菌室內(nèi)如需要安裝空調(diào)時(shí)，則應(yīng)有過濾裝置。GB/T4789.2—2008菌落總數(shù)判定主要修改部分提要--培養(yǎng)基有營養(yǎng)瓊脂變?yōu)槠桨逵?jì)數(shù)瓊脂--添加了第二法PetrifilmTM細(xì)菌總數(shù)檢驗(yàn)測試紙發(fā)--菌落計(jì)數(shù)公式進(jìn)行了修改--添加了對拍打式均質(zhì)器或其他等效設(shè)備的要求菌落總數(shù)的意義反應(yīng)食品被細(xì)菌污染的程度預(yù)測食物耐放程度和時(shí)間估測食品腐敗狀況實(shí)際上把致病菌、非致病菌、酵母菌、霉菌都計(jì)算在內(nèi)的雜菌總數(shù)由于傾注平板的局限性，會(huì)有一部分細(xì)菌在實(shí)際條件下不生長，估計(jì)數(shù)結(jié)果比實(shí)際數(shù)要低菌落總數(shù)測定——菌落總數(shù)的概念菌落總數(shù):AerbicPlateCount，是指在被檢樣品的單位重量（g）、容積（ml）或表面積（cm2）內(nèi)，所含能于某種固體培養(yǎng)基上，在一定條件下培養(yǎng)后（如時(shí)間、溫度、PH、需氧性質(zhì)等）所生成的菌落的總數(shù)。菌落：Coiony，單個(gè)微生物在適宜培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長繁殖到一定程度，形成一群肉眼可見的細(xì)菌群落CFU：菌落形成單位菌落總數(shù)測定——衛(wèi)生學(xué)意義判定食品被細(xì)菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量。及時(shí)反映食品加工過程是否符合衛(wèi)生要求，為被檢食品衛(wèi)生學(xué)評價(jià)提供依據(jù)。通常認(rèn)為，食品中細(xì)菌數(shù)量越多，則可考慮致病菌污染的可能性越大，菌落總數(shù)的多少在一定程度上標(biāo)志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的優(yōu)劣。檢樣↓適當(dāng)十倍稀釋樣品↓選擇2~3個(gè)連續(xù)適宜稀釋度各取1mL分別加入滅菌平皿內(nèi)（每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平行）↓每皿內(nèi)加入適量平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）(35℃，48±2h)↓菌落計(jì)數(shù)菌落總數(shù)測定流程菌落總數(shù)測定幾點(diǎn)說明由于檢樣中采用30/35℃有氧條件下培養(yǎng)，因而并不是樣品中實(shí)際的總活菌數(shù)，一些特殊營養(yǎng)要求的細(xì)菌、厭氧菌、微需氧菌、以及非嗜中溫細(xì)菌，均難以反映出來。鑒于食品檢樣中的細(xì)菌細(xì)胞是以單個(gè)、成雙、鏈狀、葡萄狀或成堆的形式存在，因而在平板上出現(xiàn)的菌落可以來源于細(xì)胞塊，也可以來源于單個(gè)細(xì)胞，因而平板上所得菌落的數(shù)字不應(yīng)報(bào)告活菌數(shù)，而應(yīng)以單位重量、容積或表面積內(nèi)的菌落數(shù)或菌落形成單位（colonyformingunits，CFU）報(bào)告。菌落總數(shù)測定幾點(diǎn)要求每個(gè)樣品從開始稀釋到傾注最后一個(gè)平皿所用的時(shí)間不得超過15min，主要為防止細(xì)菌增殖和產(chǎn)生片狀菌落。樣液與瓊脂應(yīng)充分混合，避免將混合物濺到平皿壁和皿蓋上。皿內(nèi)瓊脂凝固后，不要長時(shí)間放置，然后倒置培養(yǎng)，可避免菌落蔓延生長。檢樣過程中應(yīng)用稀釋劑做空白對照，用以判定稀釋液、培養(yǎng)基、平皿或吸管可能存在的污染。同時(shí)，檢樣過程中應(yīng)在工作臺(tái)上打開一塊空白平板計(jì)數(shù)瓊脂，其暴露時(shí)間應(yīng)與檢樣時(shí)間相當(dāng)，以了解檢樣在檢驗(yàn)操作過程中有無受到來自空氣的污染。檢樣稀釋液有時(shí)帶有食品顆粒，為避免與細(xì)菌菌落發(fā)生混淆，可作一檢樣稀釋液與平板計(jì)數(shù)瓊脂混合的平皿，不經(jīng)培養(yǎng)，于4℃放置，以便在計(jì)數(shù)檢樣時(shí)用作對照。菌落計(jì)數(shù)方法選取菌落數(shù)在30-300cfu之間，無蔓延生長的平板計(jì)數(shù)低于30記錄具體菌落數(shù)，大于300為多不可記，每個(gè)稀釋度用兩個(gè)平行均數(shù)有較大片狀菌落生長者不宜采用，若片狀小于平板一半且余部均勻分布，則以平板數(shù)2倍報(bào)告無明顯界限鏈狀菌落每條單鏈視為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)結(jié)果的表述若只有一個(gè)平板在30-300之間，則計(jì)算兩平板平均數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告若連續(xù)兩個(gè)稀釋度符合計(jì)數(shù)要求，則按下公式：N=∑c／(n1+n2)dN－菌落數(shù)∑c－平板菌落數(shù)之和n1－第一稀釋度平板上的菌落數(shù)n2－第二稀釋度平板上的菌落數(shù)d－稀釋因子(第一稀釋度）如

N=(232+244+33+35)÷[2+(0.1x2)]x10-2=24727稀釋度1：100（第一稀釋度）1：1000（第二稀釋度）菌落數(shù)232，24433，35最終結(jié)果表述均數(shù)10-1均數(shù)10-2描述最終結(jié)果25536均在30-300之間，按公式計(jì)算2.6x103多不可記345個(gè)平板>300，去稀釋度最高報(bào)告3.5x104122均<30，則取最低報(bào)告1.2x10233029所有平板不在30-300之間，按最接近30或300報(bào)告2.9x10300所有平板均無菌落，測1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告1x10.10大腸菌群的定義大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。大腸菌群不是細(xì)菌學(xué)上的分類命名，而是根據(jù)衛(wèi)生學(xué)方面的要求，提出的與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，即作為食品、水體等是否受過人畜糞便污染的指示菌，這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致。根據(jù)進(jìn)一步的生化試驗(yàn)，可將這群細(xì)菌再分為大腸艾希氏菌（俗稱大腸桿菌）、弗氏檸檬酸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌等。

大腸桿菌的定義大腸桿菌（也稱大腸埃希氏菌），分類于腸桿菌科，歸屬于埃希氏菌屬。大腸桿菌指革蘭氏陰性無芽孢桿菌、乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣、IMViC試驗(yàn)（靛基質(zhì)、MR、V-P、檸檬酸鹽試驗(yàn)）為++--或-+--的細(xì)菌。與人類有關(guān)的大腸桿菌統(tǒng)稱為致瀉性大腸桿菌，包括五種：腸毒素性大腸桿菌（ETEC）、致病性大腸桿菌（EPEC）、出血性大腸桿菌（EHEC）、侵襲性大腸桿菌（EIEC）、黏附性大腸桿菌（EAEC）。衛(wèi)生學(xué)意義大腸菌群和大腸桿菌是評價(jià)衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)，作為食品中的糞便污染指標(biāo)。食品中檢出大腸菌群，表明該食品有糞便污染，既可能有腸道致病菌存在，因而也就有可能通過污染的食品引起腸道傳染病的流行。大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大小。大腸桿菌在外界存活時(shí)間與一些主要腸道致病菌接近，它的出現(xiàn)預(yù)示著某些腸道病原菌的存在，因此該菌是國際上公認(rèn)的衛(wèi)生監(jiān)測指示菌。近年來，有些國家在執(zhí)行HACCP管理中，將大腸桿菌檢測作為微生物污染狀況的監(jiān)測指標(biāo)和HACCP實(shí)施效果的評估指標(biāo)大腸桿菌的生物學(xué)特性基本形態(tài)：

此菌為兩端鈍圓的短小桿菌，一般約0.5-0.8μm*1.0-3.0μm，多單獨(dú)存在或成雙，但不呈長鏈排列。約50%的菌株有周生鞭毛，但多數(shù)只有1-4根，一般不超過10根，故菌體動(dòng)力弱。多數(shù)菌株有菌毛，有的有莢膜或微莢膜，不形成芽孢，對普通堿性染料著色良好，革蘭氏染色陰性。大腸桿菌的生物學(xué)特性大腸桿菌合成代謝能力強(qiáng)，在含無機(jī)鹽、銨鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長良好。最適生長溫度為37℃，在42-44℃條件下仍能生長，生長溫度范圍15-46℃。在普通營養(yǎng)瓊脂上有3中菌落形態(tài)：1）光滑型：菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤、光滑、呈灰色，在生理鹽水中易分散；2）粗糙型：菌落扁平、干澀、邊緣不整齊，在生理鹽水中自凝；3）黏液型：常為含有莢膜的菌株。大腸菌群及大腸桿菌測定

——MPN法檢驗(yàn)流程（FDABAM）檢樣25g+225ml稀釋液

↓適當(dāng)十倍稀釋樣品

↓選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液，每個(gè)稀釋度接種三管LST肉湯（每管10mlLST肉湯并加有導(dǎo)管），每管接種1mL|35℃，24±2h~48±2h沒有產(chǎn)氣管有產(chǎn)氣管報(bào)告陰性接種BGLB肉湯管接種EC肉湯

35±℃，48±2h44.5±0.5℃（水浴培養(yǎng)）24±2h~48±2h查MPN表報(bào)告結(jié)果產(chǎn)氣管接種EMB平板（35℃、18~24h）

（大腸菌群）從EMB平板上挑取5個(gè)可疑菌轉(zhuǎn)接到PCA斜面，進(jìn)行革蘭氏染色、IMVC生化鑒定、接種LST復(fù)檢產(chǎn)氣查MPN表報(bào)告結(jié)果（大腸桿菌）大腸菌群測定——MPN法檢驗(yàn)幾點(diǎn)說明MPN檢索表：MPN為最大可能數(shù)(MostProbableNumber)的簡稱。這種方法，對樣品進(jìn)行連續(xù)系列稀釋，加入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，從規(guī)定的反應(yīng)呈陽性管數(shù)的出現(xiàn)率，用概率論來推算樣品中菌數(shù)最近似的數(shù)值。MPN檢索表只給了三個(gè)稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或增加10倍。產(chǎn)氣量與倒管：在乳糖發(fā)酵試驗(yàn)工作中，經(jīng)常可以看到在發(fā)酵倒管內(nèi)極微少的氣泡（有時(shí)比小米粒還?。袝r(shí)可以遇到在初發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。實(shí)驗(yàn)表明，大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問時(shí)，可以用手輕輕打動(dòng)試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進(jìn)一步試驗(yàn)。

結(jié)果報(bào)告根據(jù)證實(shí)為糞大腸菌群的陽性管數(shù)，查MPN檢索表，報(bào)告每100mL(g)糞大腸菌群的MPN值。

大腸桿菌測定——革蘭氏染色基本原理：革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種重要的鑒別染色法。1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。此法可將細(xì)菌分為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌兩大類。革蘭氏染色的機(jī)理主要是利用兩類細(xì)菌的細(xì)胞壁成分和結(jié)構(gòu)的不同。革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁中含有較多的類脂質(zhì)，而肽聚糖的含量較少。當(dāng)用酒精或丙酮酸脫色時(shí)，類脂質(zhì)被溶解，增加了細(xì)胞壁的通透性，使初染后的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)胞被脫色，經(jīng)復(fù)染后，又染上復(fù)染液的顏色。而革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁中肽聚糖的含量多而且交聯(lián)度大，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)乙醇或丙酮洗脫后，肽聚糖層的孔徑變小，通透性降低，因此細(xì)胞仍保留初染時(shí)的顏色。大腸桿菌測定——革蘭氏染色基本步驟：將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染液，染1min，水洗；滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗；滴加95%乙醇脫色約15～30s,直至染色液被洗掉，不要過分脫色，水洗；滴加番紅復(fù)染液，復(fù)染1min，水洗、待干、鏡檢。結(jié)果：革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。致病菌的食品衛(wèi)生學(xué)意義食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定任何食品中不得檢出致病菌致病菌對人體健康的威脅是直接和肯定的根據(jù)不同食品被污染的特點(diǎn)重點(diǎn)檢驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌微生物的毒素也是重點(diǎn)，如黃曲霉毒素等細(xì)菌性食物中毒概念：由于食入被病原菌或其毒素污染的食物所引起的急性腸胃炎為主的疾病分類：感染型、毒素型、不定型病原菌常見食品潛伏期病程癥狀沙門氏菌肉乳蛋6-8h3-7d惡行嘔吐腹痛發(fā)熱冷汗頭痛副溶血性弧菌水產(chǎn)品腌制品8-24h1-3d惡行嘔吐腹痛腹瀉蠟樣芽孢桿菌米飯肉乳淀粉類30-60min1d惡行嘔吐腹痛腹瀉金黃色葡萄球菌——概述根據(jù)《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊》，按葡萄球菌的生理化學(xué)組成，將葡萄球菌分為金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)和腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)，其中金葡多為致病性菌，表葡偶爾致病。金黃色葡萄球菌是人類化膿性感染中最常見的病原菌。可引起局部化膿性感染，如癤、癰、皮下膿腫、外科切口及燒傷創(chuàng)面的感染；也可引起肺炎、偽膜性腸炎、腎盂腎炎、心包炎等多系統(tǒng)的化膿性感染；還可引起敗血癥、膿毒癥等全身性感染。葡萄球菌的致病力強(qiáng)弱主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶。

金黃色葡萄球菌——生物學(xué)特性金黃色葡萄球菌呈球形，直徑0.8μm左右，排列成葡萄串狀，無芽孢，無莢膜。革蘭氏染色陽性，但衰老、死亡或被白細(xì)胞吞噬的菌體，常呈革蘭氏陰性。金黃色葡萄球菌——生長特性金黃色葡萄球菌在肉湯中呈渾濁生長，在胰酪胨大豆肉湯內(nèi)有時(shí)液體澄清，菌量多時(shí)呈渾濁生長。血平板上金黃色葡萄球菌呈金黃色，有時(shí)也為白色，大而突起、圓形、不透明、表面光滑，周圍有溶血圈。Baird-Parker平板上金黃色葡萄球菌圓形突起、光滑、濕潤，顏色呈灰色到黑色，邊緣淡色，周圍為一渾濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的硬度。金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)——方法適用性MPN法：適用于檢測帶有大量競爭菌的食品及其原料和未經(jīng)處理的含少量金黃色葡萄球菌的食品。直接平板計(jì)數(shù)法：適用于檢查金黃色葡萄球菌數(shù)不小于10/g（ml）的食品。增菌培養(yǎng)法：適用于檢查含有受損傷的金黃色葡萄球菌的加工食品。定量方法定性方法金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)——直接平板計(jì)數(shù)法檢樣（25g+225mL稀釋液）

↓適當(dāng)十倍稀釋樣品

↓選擇2~3個(gè)連續(xù)適宜稀釋度

↓

吸取1ml菌液按照0.3mL、0.3mL、0.4mL分別涂布于

3塊90mmBaird-Parker平板上（做平行試驗(yàn)）

↓35℃，45~48h確證試驗(yàn)

↓報(bào)告FDABAM金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)——MPN法檢樣（50g+450mL稀釋液）

↓適當(dāng)十倍稀釋樣品

↓選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液，每個(gè)稀釋度接種三管10%NaClTSB肉湯，每管接種1mL

↓35℃，48±2h從生長的管中接種1環(huán)劃線于Baird-Parker平板上

↓35℃，48h確證試驗(yàn)報(bào)告FDABAM金黃色葡萄球菌確證試驗(yàn)?zāi)堂冈囼?yàn)方法：從平板上至少挑取1個(gè)可疑金黃色葡萄球菌菌落，移種到TSB/BHI肉湯中，置35℃培養(yǎng)18-24h。取肉湯培養(yǎng)物0.3mL同0.5mL凝固酶試驗(yàn)兔血漿充分混合，置35℃培養(yǎng)，定時(shí)觀察是否有凝塊形成，至少觀察6h。

試驗(yàn)中需同時(shí)做已知陽性和陰性對照。結(jié)果判定：以內(nèi)容物完全凝固，使試管倒置或傾斜時(shí)不流動(dòng)為陽性。部分凝固（2+和3+）的必須進(jìn)行生化鑒定加以證實(shí)。沙門氏菌簡介1880年E.Berth首先發(fā)現(xiàn)傷寒沙門氏菌，1885年Salmon與Smith又分離出豬霍亂沙門氏菌，以后取Salmon氏之名為本菌屬之名。沙門氏菌屬是一群符合腸桿菌科定義并與其血清學(xué)相關(guān)的革蘭氏陰性、需氧性、無芽孢桿菌。本菌屬種類繁多，抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)2000多個(gè)血清型，我國已發(fā)現(xiàn)血清型近200個(gè)。

沙門氏菌——生物學(xué)特性形態(tài)特征：

革蘭氏陰性，大小為1~3×0.4~0.9μm的兩端鈍圓的短桿菌，無芽孢，一般無莢膜，除雞沙門氏菌和雛沙門氏菌以外，都有周身鞭毛，運(yùn)動(dòng)力強(qiáng)。沙門氏菌——生物學(xué)特性培養(yǎng)特性：沙門氏菌需氧或兼性厭氧，10-42℃都可生長，最適生長溫度為37℃，最適pH為6.8~7.8。營養(yǎng)瓊脂平板上：35~37℃培養(yǎng)18~24h，其菌落大小一般為2~3mm，光滑、濕潤、無色、半透明、邊緣整齊。血平板上：中等大小的灰白色菌落。生化特性：絕大多數(shù)沙門氏菌有規(guī)律的發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，但也有不產(chǎn)氣者，不發(fā)酵蔗糖和側(cè)金盞花醇、不產(chǎn)生吲哚、不分解尿素。沙門氏菌食物中毒已引起沙門氏菌中毒的食品：肉、蛋、乳類食品中毒原因1、食用病畜禽的肉制品食品2、病畜禽、帶菌人和動(dòng)物使食品受污染3、用不潔凈水處理食品FDABAM沙門氏菌檢驗(yàn)流程前增菌25g樣+225mL乳糖肉湯（肉制品、肉副產(chǎn)品、動(dòng)物產(chǎn)品）勻質(zhì)2min，室溫放置60±5min混合均勻，測定調(diào)節(jié)PH6.8±0.235℃、24±2h選擇性增菌

0.1ml+10mlMM（RV）1ml+10mlTTB42℃、24h

（水浴培養(yǎng)）35℃、24h43℃、24h（水浴培養(yǎng)）

含菌量高含菌量低分離培養(yǎng)劃線接種選擇性培養(yǎng)基（BS、XLD、HE）35℃、24~48h（BS）生化鑒定每個(gè)平板挑取至少2個(gè)可疑菌（包括典型和非典型各2個(gè)）接種TSI三糖鐵、LIA賴氨酸鐵高層斜面（LIA高層深4cm）

（松蓋以保持有氧條件防止產(chǎn)生過多H2S）35℃、24±2h棄去尿素酶試驗(yàn)衛(wèi)矛醇、氰化鉀、丙二酸鈉、吲哚試驗(yàn)

陽性

陰性血清學(xué)血清學(xué)試驗(yàn)——沙門氏菌的分類報(bào)告結(jié)果沙門氏菌檢驗(yàn)選擇性分離培養(yǎng)BS瓊脂：FDABAM——典型菌落：產(chǎn)硫化氫菌落黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍的培養(yǎng)基通常開始呈褐色，但伴隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而變?yōu)楹谏?，并有暈環(huán)效應(yīng)；——非典型菌落：有些菌株不產(chǎn)生硫化氫，形成灰綠色菌落，周圍培養(yǎng)基不變色。菌名菌落形態(tài)傷寒沙門氏菌黑色，有金屬光澤鼠傷寒沙門氏菌黑色，有金屬光澤奇異變形桿菌褐色或呈黑色，無金屬光澤弗氏志賀氏菌棕色至綠色大腸埃希氏菌棕色至綠色糞鏈球菌-沙門氏菌檢驗(yàn)選擇性分離培養(yǎng)HE瓊脂：FDABAM——典型菌落：蘭綠色至蘭色，多數(shù)菌株產(chǎn)硫化氫，菌落帶或不帶黑色中心或幾乎全黑色。——非典型菌落：乳糖陽性的菌株為黃色中心黑色或全黑色。菌名菌落形態(tài)傷寒沙門氏菌藍(lán)綠色，部分有黑心鼠傷寒沙門氏菌藍(lán)綠色，部分有黑心奇異變形桿菌藍(lán)綠色，有或無