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魚類育種學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容:微衛(wèi)星多重PCR擴(kuò)增技術(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆誗SR分子標(biāo)記技術(shù)的原理與分析方法;學(xué)習(xí)多重PCR技術(shù),了解體系優(yōu)化的方法;掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法;掌握銀染的實(shí)驗(yàn)方法。實(shí)驗(yàn)一PCR反應(yīng)及體系優(yōu)化實(shí)驗(yàn)材料與儀器材料:團(tuán)頭魴DNA模板(濃度:100ng/μl)儀器用具:PCR儀,制冰機(jī),紫外反射投射檢測(cè)儀,微量移液器,冰箱,天平,電泳儀,電泳槽,燒杯,量筒,200ulPCR管,Taq酶,dNTPs,引物,PCR緩沖液,石蠟油,電泳所需試劑,溴酚藍(lán),瓊脂糖,硼酸,Tris堿,蒸餾水,離心管。實(shí)驗(yàn)步驟PCR反應(yīng)液配置-PCR擴(kuò)增-產(chǎn)物檢測(cè)-程序優(yōu)化-PCR擴(kuò)增-產(chǎn)物檢測(cè)-結(jié)果分析多重PCR擴(kuò)增體系為20μl:包括100ng基因組DNA,1×PCR緩沖液,Mg2+(1.5mmol/L),1UTaq酶,dNTPs0.2mmol/L,多重PCR擴(kuò)增體系內(nèi)各位點(diǎn)上、下游引物分別為0.25μmol/L試劑體積三重PCR體系(μl)四重PCR體系(μl)H2O13.713.2Buffer2.02.0Mg2+1.21.2dNTP0.40.4Primer-1(F/R)0.25+0.250.25+0.25Primer-2(F/R)0.25+0.250.25+0.25Primer-3(F/R)0.25+0.250.25+0.25Primer-4(F/R)--0.25+0.25Taq酶0.20.2DNA(100ng/μl)11Total20μl20μl體系名稱引物組合產(chǎn)物大小3-7Mam_EST811290-320Mam_EST129200-250Mam_EST64140-1704-5Mam_EST179360-400Mam_EST11290-330Mam_EST90200-250Mam_EST37140-180PCR程序:95C3min95C30sTa30s32cycles72C45s72C5min4Cforever
注:對(duì)Ta進(jìn)行梯度優(yōu)化,設(shè)置4個(gè)溫度梯度-50,54,58,62。聚丙烯酰胺凝膠電泳溶液配置:5×TBE:54gTris堿,27.5g硼酸,20ml0.5mol/LEDTA(pH8.0),加ddH2O定容至1000ml。40%丙烯酰胺:380g丙烯酰胺,20g甲叉-丙烯酰胺,加ddH2O定容至1000ml。0.5mol/LEDTA(pH8.0):186.1gEDTA?Na?2H2O,800mlddH2O,NaOH調(diào)pH至8.0(about20gNaOH),加ddH2O定容至1000ml,高壓滅菌。10%APS:1gAPS,加ddH2O定容至10ml,置于4C。8%non-denaturingPAGEgel:
40%丙烯酰胺14mlddH2O41ml5×TBE14ml10%APS650μlTEMED65μl染色液-0.1%AgNO3:0.5gAgNO3,加ddH2O定容至500ml,置于4C。顯色液:10gNaOH,0.2gNaCO3,ddH2O定容至500ml,置于4C保存,用時(shí)加2ml37%formaldehyde。固定液-10%冰醋酸銀染步驟:1.取下凝膠用去離子水冼膠2min;2.0.1%硝酸銀染色10-15min;3.棄去染色液,蒸餾水洗膠30s;4.顯色液顯色15秒,換用新的顯色液,顯清條帶為止;5.
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