生物化學第3章

第三章氨基酸一、氨基酸——蛋白質(zhì)的構件分子二、氨基酸的分類三、氨基酸的酸堿化學四、氨基酸的化學反應五、氨基酸的光學活性和光譜性質(zhì)六、氨基酸混合物的分析分離2/5/2023一、氨基酸——蛋白質(zhì)的構件分子（一）蛋白質(zhì)的水解蛋白質(zhì)的水解可分為完全水解和部分水解兩種情況。（1）酸水解常用H2SO4(4mol/L)和HCl(6mol/L)進行水解。色氨酸破壞，天冬酰胺、谷胺酰胺脫酰胺基。

（2）堿水解用5mol/L的NaOH水解，氨基酸消旋，色氨酸穩(wěn)定。（3）酶水解水解位點特異，為部分水解。用于一級結構分析。2/5/2023（二）α－氨基酸的一般結構1809年發(fā)現(xiàn)Asp，1938年發(fā)現(xiàn)Thr，目前已發(fā)現(xiàn)180多種。但是組成蛋白質(zhì)的aa常見的有20種，稱為基本氨基酸或蛋白質(zhì)氨基酸（編碼蛋白質(zhì)的氨基酸），還有一些稱為稀有氨基酸，是多肽合成后由基本aa經(jīng)酶促修飾而來。此外還有存在于生物體內(nèi)但不組成蛋白質(zhì)的非蛋白質(zhì)氨基酸(約150種)。（1）具有酸性的—COOH基及堿性的—NH2基，為兩性電解質(zhì)。（2）如果R≠H，則具有不對稱碳原子，因而是光活性物質(zhì)。2/5/20232/5/20232/5/20232/5/2023旋光性在天然氨基酸中，只有甘氨酸無旋光性，因為只有含不對稱碳的氨基酸才有旋光作用。甘氨酸無不對稱碳故無旋光性。極性從氨基酸在不同溶劑中的溶解度和氨基酸的R基團在溶劑中的定位，可知有些氨基酸的R殘基是親水性的稱極性基(如酸基、堿基、脂族醇、酰胺基)，有的是疏水性的稱非極性基(如脂族和芳香族支鏈)。含極性基團的氨基酸稱極性氨基酸，含非極性基團的氨基酸稱非極性氨基酸。極性基可同其他相應基團形成氫鍵或離子鍵。非極性基團(疏水性基團)相互間的作用對天然蛋白質(zhì)分子的空間構象和穩(wěn)定性都起極大作用。2/5/2023二、氨基酸的分類（一）常見的蛋白質(zhì)氨基酸1、按照R基的化學結構（1）脂肪簇氨基酸①中性氨基酸：Gly、Ala、Val、Leu、Ile②含羥基或硫氨基酸：Ser、Thr、Cys、Met③酸性氨基酸及其酰胺：Asp、Glu、Asn、Gln④堿性氨基酸：Lys、Arg（2）芳香簇氨基酸Phe、Tyr、Trp（3）雜環(huán)簇氨基酸His、Pro2/5/20232/5/20232/5/20232/5/20232/5/20232/5/20232/5/20232.按R的極性性質(zhì)（1）非極性R基氨基酸Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Met（2）不帶電荷的極性R基氨基酸Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln（3）帶正電荷的R基氨基酸（4）帶負電荷的R基氨基酸Lys、Arg、HisAsp、Glu2/5/20232/5/20232/5/20232/5/20232/5/2023Gly0Ser-0.3Glu-2.5Lys-3.0Ala0.5Asn-0.2Asp-2.5Arg-3.0Met1.3Gln-0.2

His0.5Pro1.4Thr0.4

Val1.5Cys1.0

Leu1.8Tyr2.3

Ile1.8

Phe2.5

Trp3.4

側鏈極性(疏水性程度)2/5/2023膠原蛋白中的Lys側鏈氧化時能形成很強的分子間(內(nèi))交聯(lián)。Arg的胍基堿性很強，與NaOH相當。His是一個弱堿，是天然的緩沖劑，它往往存在于許多酶的活性中心。非極性aa一般形成蛋白質(zhì)的疏水核心，帶電荷的aa和極性aa位于表面。酶的活性中心：His、Ser、Cys2/5/2023（二）不常見的蛋白質(zhì)氨基酸有些不常見的氨基酸在某些蛋白質(zhì)中存在，是由相應的常見氨基酸經(jīng)修飾而來。在結締組織的膠原蛋白中有5-羥賴氨酸、4-羥脯氨酸；肌球蛋白含有甲基化的氨基酸（6-N-甲基賴氨酸）；凝血酶原中發(fā)現(xiàn)了γ－羧基谷氨酸；細菌紫膜質(zhì)中存在焦谷氨酸；甲狀腺蛋白中Tyr的衍生物：

3.5

-二碘酪氨酸、甲狀腺素；等。2/5/20232/5/2023（三）非蛋白質(zhì)氨基酸除參與蛋白質(zhì)組成的20多種氨基酸外，生物體內(nèi)存在大量的氨基酸中間代謝產(chǎn)物，它們不是蛋白質(zhì)的結構單元，但在生物體內(nèi)具有很多生物學功能。（1）L-型α–氨基酸的衍生物：L-瓜氨酸和L-鳥氨酸（2）D-型氨基酸：D-Glu、D-Ala（肽聚糖中）、D-Phe（短桿菌肽S）（3）β-、γ-、δ-氨基酸：β-Ala（泛素的前體）、γ-氨基丁酸（神經(jīng)遞質(zhì)）。2/5/2023三、氨基酸的酸堿化學（一）氨基酸的兼性離子形式α-氨基酸都含有-COOH和-NH2，都是不揮發(fā)的結晶固體，熔點200-350℃，不溶于非極性溶劑，而易溶于水，這些性質(zhì)與典型的羧酸（R-COOH）或胺（R-NH2）明顯不同。三個現(xiàn)象：①晶體溶點高→離子晶格，不是分子晶格。②不溶于非極性溶劑→極性分子③介電常數(shù)高（氨基酸使水的介電常數(shù)增高，而乙醇、丙酮使水的介電常數(shù)降低。）→水溶液中的氨基酸是極性分子。2/5/2023原因：α-羧基pK1在2.0左右，當pH>3.5，α-羧基以-COO-形式存在。α-氨基pK2在9.4左右，當pH<8.0時，α-氨基以α-NH3+形式存在。在pH3.5-8.0時，帶有相反電荷，因此氨基酸在水溶液中是以兩性離子離子形式存在。2/5/2023（二）氨基酸的解離HA

A-

+

H+

2/5/2023氨基酸的兩性解離性質(zhì)及等電點（pI）

pH=pI

凈電荷=0pH<pI凈電荷為正pH>pI凈電荷為負CHRCOOHNH3+CHRCOONH2CHRCOONH3++H++OH-+H++OH-(pK′1)(pK′2)

當氨基酸溶液在某一定pH值時，使某特定氨基酸分子上所帶正負電荷相等，成為兩性離子，在電場中既不向陽極也不向陰極移動，此時溶液的pH值即為該氨基酸的等電點(isoelctricpoint)。2/5/20232/5/2023在pH2.34和pH9.60處，Gly具有緩沖能力。

起點：100%Gly+凈電荷：+1第一拐點：50%Gly+，50%Gly±平均凈電荷：+0.5pH=pK+lg[Gly±]/[Gly+]=pK1=2.34第二拐點：100%Gly±凈電荷：0等電點pI第三拐點：50%Gly±，50%Gly-平均凈電荷：-0.5pH=pK2+lg[Gly-]/[Gly±]=pK2=9.6終點：100%Gly-凈電荷：-1His咪唑基的pKa值為6.0，在pH7附近有明顯的緩沖作用。在生理條件下，只有His有緩沖能力。血紅蛋白中His含量高，在血液中具很強的緩沖能力。2/5/2023甘氨酸滴定曲線甘氨酸鹽酸鹽（A+）等電點甘氨酸（A）甘氨酸鈉（A-）一氨基一羧基AA的等電點計算：pI=2pK′1+pK′22/5/2023一氨基二羧基AA的等電點計算：pI=2pK′1+pK′2二氨基一羧基AA的等電點計算：pI=2pK′2+pK′32/5/2023（三）氨基酸的等電點氨基酸在等電點狀態(tài)下，溶解度最小。pH

>

pI時，氨基酸帶負電荷，-COOH解離成-COO-，向正極移動。pH

=

pI時，氨基酸凈電荷為零。pH

<

pI時，氨基酸帶正電荷，-NH2解離成-NH3+，向負極移動。2/5/2023四、氨基酸的化學性質(zhì)（一）α－氨基參加的反應1.與亞硝酸的反應氨基酸的α-氨基定量地與亞硝酸作用產(chǎn)生羥酸和N2，所生成的N2可用氣體分析儀器加以測定，這是VanSlyke氏氨基氮測定法的原理。2/5/20232.與甲醛的反應氨基酸兩性離子的NH3+是弱酸，其pKa為9.7左右，完全離解時溶液的pH約為10±，超出酸堿滴定指示劑的顯色范圍，不能用一般指示劑，例如酚酞，作酸堿滴定。但當氨基酸的氨基與中性甲醛結合成氨基酸二羥甲基衍生物后，其氨基的堿性即大大減少，反應向右進行，兩性離子中NH3+基的離解度增加，釋出H+質(zhì)子，NH3+的pKa值降低到6.5左右，溶液的pH降至6.7左右，此時NH3+離解釋出的H+即可以酚酞作指示劑用標準NaOH溶液加以滴定。每釋出的一個H+就相當于一個氨基酸。甲醛滴定可用來測定蛋白質(zhì)的水解程度。當氨基酸溶液中存在1mol/L甲醛時，滴定終點由pHl2左右移至9附近，亦即酚酞指示劑的變色區(qū)域。這就是甲醛滴定法的基礎。2/5/20233.?；蜔N基化反應氨基酸氨基的一個H可被?；驘N基(包括環(huán)烴及其衍生物)取代，這些取代基對氨基酸的氨基有保護作用。2/5/2023（生物體內(nèi)）在酶和ATP存在條件下，羧酸也可與氨基酸的氨基作用，形成?；a(chǎn)物。苯甲酸與Gly的氨基的?；磻巧矬w內(nèi)解毒作用的一個典型的例子。苯甲酸是食品防腐劑，在生物體內(nèi)轉(zhuǎn)變成N-苯甲酰-Gly后，可經(jīng)尿排出。2/5/2023α-氨基中的氮是一個親核中心，能發(fā)生親核取代反應。強親電的有機物能與α-NH2發(fā)生烷基化反應。第一次大戰(zhàn)中使用的芥子氣，它的主要作用是使氨基酸的α-氨基烷基化，從而破壞蛋白質(zhì)的正常功能。Sanger反應二硝基苯基氨基酸（DNP-氨基酸），黃色，層析法鑒定，被Sanger用來測定多肽的NH2末端氨基酸。Edman反應PTH-氨基酸，無色，可以用層析法分離鑒定。被Edman用來鑒定多肽的NH2末端氨基酸。2/5/20232/5/20232/5/20234.形成西佛堿反應氨基酸的α氨基與醛類反應，生成西佛堿。西佛堿是以氨基酸為底物的某些酶促反應例如轉(zhuǎn)氨基反應的中間物。2/5/20235.脫氨基化學氨基酸經(jīng)氧化劑或酶(如氨基酸氧化酶)的作用即脫出氨產(chǎn)生酮酸。氨基酸的氨基還可通過酶的作用將氨基轉(zhuǎn)移給酮酸以形成新氨基酸。2/5/2023（二）α－羧基參加的反應氨基酸在有HCl(干氯化氫氣)存在下與無水甲醇或乙醇作用即產(chǎn)生氨基酸甲酯或乙酯。1.成酯和成鹽反應如將氨基酸與NaOH起反應，則得氨基酸鈉鹽。當氨基酸的羧基變成乙酯(或甲酯)，或鈉鹽后。羧基的化學性質(zhì)就被掩蔽了(或者說羧基被保護了)，而氨基的化學性質(zhì)就突出地顯示出來(或者說氨基被活化了)，可與?；Y合。2/5/2023?；被嵬琍Cl5或PCl3在低溫下起作用，其—COOH基即可變?yōu)椤狢OCl基：2.酰氯化反應這個反應可使氨基酸的羧基活化，使之易與另一氨基酸的氨基結合，在合成肽的工作上是常用的。2/5/2023在體外，氨基酸酯與氨(在醇溶液中或無水狀態(tài))作用即可形成氨基酸酰胺。3.成酰胺反應動、植物機體在ATP及天冬酰胺合成酶存在情況下可利用NH+4與天冬氨酸作用合成天冬酰胺；同樣，谷氨酸與NH+4作用產(chǎn)生谷氨酰胺。2/5/2023生物體內(nèi)的氨基酸經(jīng)脫羧酶(一種催化氨基酸脫羧反應的生物催化劑)作用就放出CO2和產(chǎn)生相應的胺。4.脫羧反應大腸桿菌含有一種谷氨酸脫羧酶專使谷氨酸脫羧。人體和動物體中的胺也是由于氨基酸脫羧產(chǎn)生的。2/5/2023氨基酸可以通過酰基化和酯化先將自由氨基酸變?yōu)轷；被峒柞?，然后與聯(lián)氨和HNO2作用使變成疊氮化合物。5.疊氮反應這個反應有使氨基酸的羧基活化的作用，在人工合成肽的工作中也是常用的。2/5/2023（二）α－氨基和α－羧基共同參加的反應1.與茚三酮反應2/5/2023從理論上講，一個氨基酸的氨基與另一氨基酸的羧基可以縮合成肽，其鍵稱肽鍵。2.成肽反應2/5/20232/5/2023根據(jù)此原理，曾利用氨基酸氨基和竣基的某些特有反應合成了若干人工肽鏈。但必須指出，生物機體利用氨基酸合成肽鏈的方式并不如此簡單，而是通過一系列復雜過程來完成的(詳見蛋白質(zhì)的生物合成)。2/5/2023（四）側鏈R基參加的反應氨基酸的側鏈基團R有下列幾種：1．苯環(huán)(苯丙氨酸及酪氨酸)2．酚基(酪氨酸)3．OH基(絲氨酸、蘇氨酸)4．SH基及—S—S—鍵(半胱氨酸及胱氨酸)5．吲哚基(色氨酸)6．胍基(精氨酸)7．咪唑基(組氨酸)2/5/2023酪氨酸的酚基在3和5位上容易發(fā)生親電取代反應，例如發(fā)生碘化或硝化，分別生成一碘酪氨酸和二碘酪氨酸或一硝基酪氨酸和二硝基酪氨酸：2/5/2023酪氨酸的酚基還可以與重氮化合物（如對氨基苯磺酸的重氮鹽)結合生成桔黃色的化合物：這就是Pauly反應，可用于檢測酪氨酸。2/5/2023組氨酸的側鏈咪唑基與重氮苯磺酸也能形成相似的化合物，但顏色稍有差異，是棕紅色。精氨酸的側鏈胍基在硼酸鈉緩沖液(pH8—9，25－35℃）中，與1，2—環(huán)己二酮反應，生成縮合物：在胰蛋白酶水解肽段時，用于保護Arg的ε－NH2，減少作用位點。2/5/2023色氨酸的側鏈吲哚基在溫和條件下可被N—溴代琥珀酰亞胺氧化。此反應可用于分光光度法測定蛋白質(zhì)中色氨酸的含量，并能在色氨酸和酪氨酸殘基處選擇性化學斷裂肽鍵。蛋氨酸側鏈上的甲硫基是一個很強的親核基團，與烴化試劑如甲基碘容易形成锍鹽。2/5/2023生成的側鏈帶有正電荷(ε－+NH3)，它為胰蛋白酶水解肽鏈提供了一個新位點，這對氨基酸順序測定是很有用的。同時此反應也可用來保護肽鏈上的－SH基、以防止被重新氧化為二硫鍵。2/5/2023半胱氨酸可與二硫硝基苯甲酸(縮寫為DTNB)或稱Ellman氏試劑發(fā)生硫醇—二硫化物交換反應：反應中1分子的半胱氨酸引起1分子的硫硝基苯甲酸的釋放，它在pH8.0時，在412nm波長處有強烈的光吸收，因此可利用比色法定量測定一SH基。2/5/2023硫基很容易受空氣或其他氧化劑氧化。硫醇一般遇到的只有兩種氧化衍生物：二硫化物和磺酸。2R-SH＋1/2O2R-S-S-R+H2O2半胱氨酸的SH基可與另一個SH基結合成二硫鍵(—S—S—)。SH與—S—S—成一氧化還原體系，在機體氧化還原作用中有一定作用。二硫鍵存在于多種肽和蛋白質(zhì)分子中，胰島素分子中有3個二硫鍵，核糖核酸酶分子中有4個二硫鍵。二硫鍵對蛋白質(zhì)和多肽分子的立體結構有維系穩(wěn)定的作用。二硫鍵可被還原劑破壞產(chǎn)生—SH基。SH基可被氧化成磺酸基(HSO3基)。這兩種反應在研究胰島素和含二硫鍵肽的結構工作中都有用處。2/5/20232/5/2023絲氨酸、蘇氨酸和羥脯氨酸的OH基能與酸結合成酯。在生物體蛋白質(zhì)中，絲氨酸常與磷酸結合，酪蛋白中含有大量的絲氨酸磷酸酯。2/5/2023五、氨基酸的光學活性和光譜性質(zhì)（一）氨基酸的光學活性和立體化學Gly一種構型,無旋光性Thr和Ile有四種光學異構體。其余17種氨基酸有兩種光學異構體：L型、D型。構成蛋白質(zhì)的氨基酸均屬L-型（L-蘇氨酸）。2/5/2023蛋白質(zhì)的酸或酶促水解得到的氨基酸都是L-型的，而用堿水解得到的都是無旋光性的DL-〔外〕消旋物。胱氨酸可以形成內(nèi)消旋胱氨酸。外消旋物：D-型和L-型的等摩爾混合物。L-蘇氨酸和D-蘇氨酸組成消旋物。內(nèi)消旋物：分子內(nèi)消旋胱氨酸有三種立體異構體：L-胱氨酸、D-胱氨酸、內(nèi)消旋胱氨酸。L-胱氨酸和D-胱氨酸是外消旋物2/5/2023構成蛋白質(zhì)的20種氨基酸在可見光區(qū)都沒有光吸收，但在遠紫外區(qū)(<220nm)均有光吸收。在近紫外區(qū)(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。酪氨酸的max＝275nm，275=1.4x103;苯丙氨酸的max＝257nm，257=2.0x102;色氨酸的max＝280nm，280=5.6x103;（二）氨基酸的光譜性質(zhì)蛋白質(zhì)最大紫外吸收峰在280nm處。2/5/2023六、氨基酸混合物的分析分離（一）分配層析法的一般原理層析系統(tǒng)固定相（靜相）流動相（動相）混合物在層折系統(tǒng)中的分離決定于該混合物的組分在這兩相中的分配情況，一般用分配系數(shù)來描述。Kd=CA/CB2/5/2023層析系統(tǒng)中的靜相可以是固相、液相或固—液混合相(半液體)；動相可以是液相或氣相，它充滿于靜相的空隙中。并能流過靜相。有效分配系數(shù)：Keff是Rv的函數(shù)，溶質(zhì)的有效分配系數(shù)可以調(diào)整兩相的體積比而加以改變。利用層析法分離混合物例如氨基酸混合物，其先決條件是各種氨基酸成分的分配系數(shù)要有差異，哪怕是很小的差異。一般差異越大，越容易分開。2/5/2023目前在分析分離上使用較廣的分配層析法，包括柱層析、紙層析和薄層層析等都是在分配分離的基礎上發(fā)展起來的。（二）分配柱層析層析柱中的填充物或稱支持劑都是一些具有親水性的不溶物質(zhì)，如纖維素、淀粉、硅膠等：支持劑吸附著一層不會流動的結合水，可以看作為固定相，沿固定相流動的與它不互溶的溶劑(如苯酚、正丁醇等)是流動相。2/5/20232/5/2023（三）（濾）紙層析濾紙層析也是分配層析的一種。濾紙纖維素上吸附的水是固定相，展層用的溶劑是流動相。層析時，混合氦基酸在這兩相中不斷分配，使它們分布在濾紙的不同位置上。2/5/2023（四）薄層層析把支持劑涂布在玻璃板上使成一個均勻的薄層，把要分析的樣品滴加在薄層的一端，然后用合適的溶劑在密閉的容器中進行展層，使樣品中各個成分分離開來，最后進行鑒定和定量測定。2/5/2023（五）離子