疏水性相互作用色譜

疏水性相互作用色譜

(HIC)目錄一、概念二、原理三、疏水性的吸附劑四、影響疏水性吸附的因素五、疏水性相互作用色譜的操作六、HIC的特點(diǎn)及應(yīng)用一、概念

疏水性相互作用色譜(Hydrophobicinteractionchromatography，HIC)是利用表面偶聯(lián)弱疏水性基團(tuán)(疏水性配基)的疏水性吸附劑為固定相，根據(jù)蛋白質(zhì)與疏水性吸附劑之間的弱疏水性相互作用的差別進(jìn)行蛋白質(zhì)類生物大分子分離純化的洗脫層析法。

疏水性相互作用色譜二、原理組成蛋白質(zhì)的氨基酸中包括一些疏水性氨基酸基團(tuán)，如苯丙氨酸，酪氨酸；這些基團(tuán)大部分處于蛋白質(zhì)內(nèi)部，但有部分疏水基團(tuán)暴露于蛋白質(zhì)表面。在高離子強(qiáng)度鹽溶液中，蛋白質(zhì)表面的水化層被破壞，更多的疏水部分暴露在外，這些暴露在外的疏水基團(tuán)與介質(zhì)上的弱疏水性配基發(fā)生疏水性作用，被固定相(疏水性吸附劑)所吸附。被固定相吸附蛋白質(zhì)在疏水性吸附劑上的分配系數(shù)隨流動(dòng)相鹽析鹽濃度的提高而增大。HIC采用高鹽下吸附，低鹽下洗脫。鹽濃過高，沉淀不可原理圖示MechanismofHIC三、疏水性吸附劑常用配基

苯基、短鏈烷基、烷氨基、聚乙二醇聚醚修飾密度

疏水配基修飾密度一般在10~40umol/ml

疏水性吸附作用與配基的疏水性和配基密度成正比，故配基的修飾密度應(yīng)根據(jù)配基的疏水性而異。四、影響疏水性吸附的因素①離子強(qiáng)度及種類除離子強(qiáng)度外，離子的種類亦影響蛋白質(zhì)的疏水性吸附。在高價(jià)陰離子的存在下，疏水性吸附作用力較高。HIC分離過程中主要利用硫酸銨、硫酸鈉和氯化鈉等鹽溶液為流動(dòng)相，在略低于鹽析點(diǎn)的鹽濃度下進(jìn)料，然后逐漸降低流動(dòng)相離子強(qiáng)度進(jìn)行洗脫分離。

一般配基修飾密度在（10～40）μmo1／cm3之間。配基修飾密度過小則疏水性吸附作用不足，密度過大則洗脫困難。疏水性配基與親水性固定相粒子之間的偶聯(lián)主要利用氨基或醚鍵結(jié)合，形成各種疏水性吸附劑，其中R表示疏水配基。

圖中a的末端氨基以及a和b的鍵合亞氨基顯弱堿性，在中性pH范圍內(nèi)帶正電荷，因此，這類疏水件吸附劑除疏水性吸附外，還可能存在靜電吸附(離子交換)作用。圖中c的吸附劑利用醚鍵結(jié)合．不引入荷電基團(tuán)，對(duì)蛋白質(zhì)僅產(chǎn)生疏水性吸附作用。疏水性吸附劑②破壞水化作用的物質(zhì)

蛋白質(zhì)疏水部位的失水有利于疏水性吸附。因此水化能力低的物質(zhì)容易作洗脫劑。SCN－，CIO4－和I－等半徑較大、表面電荷密度低，水化能力差，這類陰離子具有減弱水分子之間相互作用。因此，這類陰離子稱為離液離子（chaotropicion）；在離液離子存在下疏水性吸附減弱，蛋白質(zhì)易于洗脫。鹽析作用強(qiáng)的高價(jià)陰離子（如SO42－，HPO42－等）的作用正好相反，稱為反離液離子（antichaotropicion）。除離液離子外，乙二醇和丙三醇等含羥基的物質(zhì)也具有影響水化的作用，降低蛋白質(zhì)的疏水性吸附作用，經(jīng)常用做洗脫促進(jìn)劑，洗脫時(shí)疏水吸附強(qiáng)烈、僅靠降低鹽濃度難于洗脫高疏水性蛋白質(zhì)。③表面活性劑表面活性劑可與吸附劑及蛋白質(zhì)的疏水部位結(jié)合，從而減弱蛋白質(zhì)的疏水性吸附。根據(jù)這一原理，難溶于水的膜蛋白質(zhì)可添加一定量的表面活性劑使其溶解，利用HIC法進(jìn)行洗脫分離。

但此時(shí)選用表面活性劑的種類和濃度應(yīng)當(dāng)適宜：濃度過小則膜蛋白不溶解，過大則抑制蛋白質(zhì)的吸附。④溫度

失水是吸熱過程，即疏水性吸附為吸熱過程，因此與一般物質(zhì)吸附相比，趨勢相反，即溫度越高，吸附越容易。五．疏水性相互作用色譜（HIC）的操作

疏水性相互作用色譜在蛋白質(zhì)的分離過程中由于機(jī)理比較復(fù)雜，吸附劑的選擇和洗脫分離條件不易掌握所以難以取得良好的分離效果。因此，在利用HIC分離蛋白質(zhì)的混合物時(shí)，需事先利用各種小型預(yù)裝柱進(jìn)行吸附與洗脫實(shí)驗(yàn)，確定最佳吸附劑和洗脫分離條件分離溶劑。吸附生物大分子采用柱層析法，裝柱和拆柱與其他類型的柱層析法相同。為了使要分離的生物大分子能緊密結(jié)合在柱上，選擇適當(dāng)?shù)木彌_液、pH和離子強(qiáng)度，也要考慮溫度因素。

為了有效地洗脫吸附劑上的生物大分子，可以用下列的一種或幾種方法：①改換一種具有較低鹽析效應(yīng)的離子；②降低離子強(qiáng)度；③減弱洗脫劑的極性，也可加入乙二醇；④用含有表面活性劑的洗脫劑；⑤提高洗脫劑的pH。

每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，吸附劑需要再生。因?yàn)槲絼┲猩辛粲薪Y(jié)合緊密的生物大分子、表面活性劑等。未經(jīng)再生的疏水吸附劑，其吸附容量將明顯降低。一般來說可用蒸餾水、乙醇、正丁醇、乙醇、蒸餾水依次洗滌，裝柱，用初始緩沖液平衡吸附劑。吸附劑經(jīng)再生后可反復(fù)使用。

再生

蛋白質(zhì)的純化過程中，各種分離技術(shù)結(jié)合的順序是很重要的。疏水層析可用在沉淀步驟之后，或與凝膠過濾、離子交換層析結(jié)合使用。

操作1）加樣：樣品溶液中補(bǔ)加適量的鹽。2）洗脫：用降低鹽濃度的平衡緩沖液洗脫。3）再生：除去固定相吸附的雜質(zhì)，用水或

8mol/L脲素溶液。

應(yīng)用主要用于分離純化大分子物質(zhì)。

應(yīng)用

HIC主要用于蛋白質(zhì)類生物大分子的分離純化。這種方法與IEC的離子交換作用完全不同。

它不僅是一種有效的分離純化手段，而且還可與IEC互補(bǔ)短長，分離純化利用IEC難以分離的蛋白質(zhì)。

但是，疏水性相互作用機(jī)理比較復(fù)狀。吸附劑的選擇和洗脫分離條件不