第六章微生物的生長與控制

第六章

微生物的生長與控制生命科學(xué)學(xué)院生長和繁殖是保證微生物獲得巨大數(shù)量的必要前提！第六章微生物的生長于控制

生物個(gè)體物質(zhì)有規(guī)律地、不可逆增加，導(dǎo)致個(gè)體體積擴(kuò)大的生物學(xué)過程。生長（growth）：

生物個(gè)體生長到一定階段，通過特定方式產(chǎn)生新的生命個(gè)體，即引起生命個(gè)體數(shù)量增加的生物學(xué)過程。繁殖（reproduction）：第六章微生物的生長于控制生長是一個(gè)逐步發(fā)生的量變過程，繁殖是一個(gè)產(chǎn)生新的生命個(gè)體的質(zhì)變過程。第六章微生物的生長于控制特別在單細(xì)胞的生物里，由于細(xì)胞小，生長與繁殖兩個(gè)過程是緊密聯(lián)系、很難劃分。高等生物生長和繁殖這兩個(gè)過程可以明顯分開；低等生物第六章微生物的生長于控制在一定時(shí)間和條件下細(xì)胞數(shù)量的增加（微生物群體生長）在微生物學(xué)中提到的“生長”，一般均指群體生長，這一點(diǎn)與研究大生物時(shí)有所不同。第六章微生物的生長于控制第六章微生物的生長于控制群體中個(gè)體數(shù)目的增加。可以用重量、體積、密度或濃度來衡量。個(gè)體生長微生物細(xì)胞個(gè)體吸收營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行新陳代謝，原生質(zhì)與細(xì)胞組分的增加。群體生長群體生長=個(gè)體生長+個(gè)體繁殖個(gè)體生長→個(gè)體繁殖→群體生長第六章微生物的生長于控制測定生長繁殖的方法第一節(jié)第六章微生物的生長于控制單位時(shí)間里微生物數(shù)量或生物量（biomass）的變化。微生物生長：第一節(jié)測生長繁殖的方法微生物生長的測定：個(gè)體計(jì)數(shù)群體重量測定群體生理指標(biāo)測定評價(jià)培養(yǎng)條件、營養(yǎng)物質(zhì)等對微生物生長的影響；評價(jià)不同的抗菌物質(zhì)對微生物產(chǎn)生抑制(或殺死)作用的效果；客觀地反映微生物生長的規(guī)律。第一節(jié)測生長繁殖的方法一、測生長量測定生長量的方法很多，適用于一切微生物。（一）測生長量直接法（二）測生長量間接法第一節(jié)測生長繁殖的方法（一）測生長量直接法測體積法：粗放型，在刻度離心管中測沉降量稱干重法：精確型，離心法和過濾法獲得菌體細(xì)胞，微生物的干重一般為其濕重的10％～20％。測定多細(xì)胞及絲狀真菌生長情況的有效方法第一節(jié)測生長繁殖的方法例如，E.coli一般的液體培養(yǎng)物（culture）中，細(xì)胞濃度通常為2×109個(gè)／mL，100mL培養(yǎng)物約可得10～90mg干重的細(xì)胞；E.coli的高密度培養(yǎng)（highcell-densityculture，HCDC）中，細(xì)胞產(chǎn)量最高記錄可達(dá)到174g/L。第一節(jié)測生長繁殖的方法（二）測生長量間接法1.比濁法2.生理指標(biāo)法第一節(jié)測生長繁殖的方法1.比濁法

用分光光度法對無色的微生物懸浮液進(jìn)行測定，一般選用450～650nm波段。

在一定波長下，測定菌懸液的光密度，以光密度（opticaldensity,即OD）表示菌量。第一節(jié)測生長繁殖的方法

若要連續(xù)跟蹤某一培養(yǎng)物的生長動(dòng)態(tài)，例如，測定生長曲線時(shí)可用帶有側(cè)臂的三角燒瓶作原位測定，即不必取樣。第一節(jié)測生長繁殖的方法2.生理指標(biāo)法

微生物的生理指標(biāo)，如氮、碳、DNA、ATP等物質(zhì)的含量，呼吸強(qiáng)度、耗氧量、酶活性、生物熱等與其群體的規(guī)模成正相關(guān)。

樣品中微生物數(shù)量愈多或生長愈旺盛，這些指標(biāo)愈明顯，因此可以借助特定的儀器如瓦勃氏呼吸儀、微量量熱計(jì)等設(shè)備來測定相應(yīng)的指標(biāo)。常用于對微生物的快速鑒定與檢測第一節(jié)測生長繁殖的方法二、計(jì)繁殖數(shù)測定繁殖，一定要一一計(jì)算各個(gè)體的數(shù)目。單細(xì)胞狀態(tài)的細(xì)菌和酵母菌放線菌和霉菌等絲狀生長的微生物計(jì)算其孢子數(shù)計(jì)算各個(gè)體的數(shù)目第一節(jié)測生長繁殖的方法（一）計(jì)繁殖數(shù)直接法1.計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)法2.染色后活菌計(jì)數(shù)法3.比例計(jì)數(shù)法4.過濾計(jì)數(shù)法第一節(jié)測生長繁殖的方法1.計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)法指采用計(jì)數(shù)板（細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板），在光學(xué)顯微鏡下直接觀察微生物細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)的方法。計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量！第一節(jié)測生長繁殖的方法適用范圍：

適用于個(gè)體較大細(xì)胞或顆粒，如血細(xì)胞、酵母菌等,

不適用于細(xì)菌等個(gè)體較小的細(xì)胞。

細(xì)菌細(xì)胞太小，可用Peteroff-Hauser計(jì)菌器和Hawksley計(jì)菌器。

第一節(jié)測生長繁殖的方法缺點(diǎn)：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)；需要相對高的細(xì)菌濃度；個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察。優(yōu)點(diǎn)：快速，準(zhǔn)確，對酵母菌可同時(shí)測定出芽率。第一節(jié)測生長繁殖的方法2.染色后活菌計(jì)數(shù)法

采用特定的染色技術(shù)進(jìn)行活菌染色，然后用光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)的方法?？煞謩e對活菌和死菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。第一節(jié)測生長繁殖的方法細(xì)菌經(jīng)吖啶橙染色后，在紫外顯微鏡下可觀察，活細(xì)胞→橙色熒光死細(xì)胞→綠色熒光酵母細(xì)胞采用美藍(lán)染色后可以區(qū)分活和死細(xì)胞。酵母活細(xì)胞→無色；酵母死細(xì)胞→藍(lán)色。第一節(jié)測生長繁殖的方法

將已知顆粒濃度的樣品（例如血液）與待測細(xì)胞濃度的樣品混勻后在顯微鏡下根據(jù)二者之間的比例直接推算待測微生物細(xì)胞濃度。3.比例計(jì)數(shù)法4.過濾計(jì)數(shù)法

當(dāng)樣品中菌數(shù)很低時(shí)，可以將一定體積的的樣品通過膜過濾器。然后將濾膜干燥、染色，并經(jīng)處理使膜透明，再在顯微鏡下計(jì)算膜上（或一定面積中）的細(xì)菌數(shù)。第一節(jié)測生長繁殖的方法（二）計(jì)繁殖數(shù)間接法

是一種活菌計(jì)數(shù)法，這是一種依據(jù)活菌在液體培養(yǎng)基中會使其變混或在固體培養(yǎng)基上（內(nèi)）形成菌落的原理而設(shè)計(jì)。最常用的是菌落計(jì)數(shù)法（colony-countingmethod）。第一節(jié)測生長繁殖的方法1.平板菌落計(jì)數(shù)法2.膜過濾培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)法3.厭氧菌的菌落計(jì)數(shù)法（二）計(jì)繁殖數(shù)間接法

第一節(jié)測生長繁殖的方法1.平板菌落計(jì)數(shù)法

可用澆注平板（pourplate）或涂布平板（spreadplate）等方法進(jìn)行。此法適用于各種好氧菌或厭氧菌。第一節(jié)測生長繁殖的方法液體稀釋法樣品充分混勻；每支移液管及涂布棒最好只接觸一個(gè)稀釋度的菌液；同一稀釋度三個(gè)以上重復(fù),取平均值；每個(gè)平板上的菌落數(shù)目合適，便于準(zhǔn)確計(jì)數(shù)；涂布平板法傾注平板法一個(gè)菌落可能是多個(gè)細(xì)胞一起形成，所以一般用菌落形成單位來表示，而不是直接表示為細(xì)胞個(gè)數(shù)。根據(jù)每皿上形成的cfu數(shù)乘上稀釋度推算出樣品的含菌數(shù)。菌落形成單位（colonyformingunit，cfu）第一節(jié)測生長繁殖的方法

優(yōu)點(diǎn)此方法最為常用，適用于各種好氧菌或厭氧菌。

缺點(diǎn)操作較繁瑣，故要求操作者技術(shù)熟練、準(zhǔn)確。商品化的用于菌落計(jì)數(shù)的小型紙片或密封瓊脂板基本原理：利用加在培養(yǎng)基中的活菌指示劑TTC（2，3，5－氯化三苯基四氮唑），它可使菌落在很微小時(shí)就染成易于辨認(rèn)的玫瑰色。第一節(jié)測生長繁殖的方法2.膜過濾培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)法

當(dāng)樣品中菌數(shù)很低時(shí)，可以將一定體積的樣品（湖水、海水或飲用水等）通過膜過濾器，然后再將膜轉(zhuǎn)到相應(yīng)的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，對形成的菌落進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。第一節(jié)測生長繁殖的方法3.厭氧菌的菌落計(jì)數(shù)法

一般可用亨蓋特滾管培養(yǎng)法進(jìn)行。此法設(shè)備較復(fù)雜，技術(shù)難度很高。第一節(jié)測生長繁殖的方法

簡便快速的半固體深層瓊脂法，可測定雙歧桿菌（bifidobacteria）和乳酸菌（lacticacidbacteria）等厭氧菌活菌數(shù)?；驹恚?/p>

試管中的深層半固體瓊脂有良好的厭氧性能，并利用其凝固前可作稀釋用，凝固后又可代替瓊脂平板作菌落計(jì)數(shù)用的良好性能。第一節(jié)測生長繁殖的方法微生物的生長規(guī)律第二節(jié)微生物的特點(diǎn)：個(gè)體微小肉眼看到或接觸到的微生物是成千上萬個(gè)微生物組成的群體微生物接種是群體接種，接種后的生長是微生物群體的生長繁殖對細(xì)菌生長規(guī)律的了解是對其進(jìn)行研究與利用的基礎(chǔ)第二節(jié)微生物生長規(guī)律一、微生物的個(gè)體生長和同步生長

1.微生物個(gè)體細(xì)胞的生長（1）細(xì)菌的生長

一個(gè)新生的細(xì)胞長大到最后分裂為兩個(gè)子細(xì)胞的過程稱為細(xì)胞周期。細(xì)胞周期內(nèi)主要的細(xì)胞學(xué)變化是細(xì)胞的表面生長即細(xì)胞壁的增生、DNA的復(fù)制以及細(xì)胞分裂成子代細(xì)胞。第二節(jié)微生物生長規(guī)律（2）酵母菌的生長

酵母菌主要的繁殖方式是出芽，酵母菌細(xì)胞的生長——芽細(xì)胞的生長。

酵母菌的細(xì)胞周期是兩次細(xì)胞分裂之間的時(shí)間，這個(gè)周期分為4個(gè)時(shí)期：第一間隔期G1DNA合成期S第二間隔期G2有絲分裂期M第二節(jié)微生物生長規(guī)律（3）霉菌的生長

絲狀真菌的生長：從孢子萌發(fā)開始，以其菌絲頂端延長的方式進(jìn)行。當(dāng)菌絲伸長到一定程度后就會出現(xiàn)分支。第二節(jié)微生物生長規(guī)律目前研究生長過程使用的方法：（1）電子顯微鏡觀察細(xì)胞的超薄切片（2）同步培養(yǎng)（synchronousculture）技術(shù)第二節(jié)微生物生長規(guī)律（1）電子顯微鏡觀察細(xì)胞的超薄切片第二節(jié)微生物生長規(guī)律

設(shè)法使某一群體中的所有個(gè)體細(xì)胞盡可能都處于同樣細(xì)胞生長和分裂周期中，通過分析此群體在各階段的生物化學(xué)特性變化，來間接了解單個(gè)細(xì)胞的相應(yīng)變化規(guī)律。（2）同步培養(yǎng)（synchronousculture）技術(shù)第二節(jié)微生物生長規(guī)律

這種通過同步培養(yǎng)的手段而使細(xì)胞群體中各個(gè)體處于分裂步調(diào)一致的生長狀態(tài)，稱為同步生長（synchronousgrowth）。同步生長（synchronousgrowth）2.微生物的同步生長獲得微生物同步生長的方法：①環(huán)境條件誘導(dǎo)法②機(jī)械篩選法第二節(jié)微生物生長規(guī)律①環(huán)境條件誘導(dǎo)法例如，氯霉素抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成；

細(xì)菌芽孢誘導(dǎo)發(fā)芽；

藻類細(xì)胞的光照、黑暗控制；用EDTA或離子載體處理酵母菌；短期熱休克（40℃）法等。變換溫度、光線、培養(yǎng)基等。造成與正常細(xì)胞周期不同的周期變化。第二節(jié)微生物生長規(guī)律利用處于同一生長階段細(xì)胞的體積、大小的相同性，用過濾法、區(qū)帶密度梯度離心法或膜洗脫法收集同步生長的細(xì)胞。②機(jī)械篩選法區(qū)帶密度梯度離心法膜洗脫法過濾法第二節(jié)微生物生長規(guī)律有效和常用的方法

——Helmstetter-Cummigs技術(shù)硝酸纖維素膜洗脫法獲得同步生長的細(xì)菌原理：一些細(xì)菌細(xì)胞會緊緊粘附于硝酸纖維微孔濾膜上。第二節(jié)微生物生長規(guī)律基本步驟：A：菌懸液通過微孔濾膜，細(xì)胞吸附其上；B：反置濾膜，以新鮮培養(yǎng)液通過濾膜，洗掉浮游細(xì)胞；C：除去起始洗脫液后就可得到剛剛分裂下來的新生細(xì)胞，即為同步培養(yǎng)。第二節(jié)微生物生長規(guī)律二、單細(xì)胞微生物的典型生長曲線生長曲線：

定量描述液體培養(yǎng)基中微生物群體生長規(guī)律的實(shí)驗(yàn)曲線，稱為生長曲線（growthcurve）。在微生物學(xué)中提到的“生長”，均指群體生長！第二節(jié)微生物生長規(guī)律將少量單細(xì)胞的純培養(yǎng)，接種到一恒定容積的新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間取樣，測細(xì)胞數(shù)目。生長曲線的制作第二節(jié)微生物生長規(guī)律以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)以菌數(shù)的對數(shù)為縱坐標(biāo)作圖一條反映細(xì)菌在整個(gè)培養(yǎng)期間菌數(shù)變化規(guī)律的曲線！測定的數(shù)據(jù)單細(xì)胞微生物的典型生長曲線第二節(jié)微生物生長規(guī)律

根據(jù)微生物的生長速率常數(shù)（growthrateconstant），即每小時(shí)的分裂次數(shù)（R）的不同，一般可把典型生長曲線粗分為延滯期、指數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期4個(gè)時(shí)期。

典型生長曲線延滯期（Ⅰ）指數(shù)期（Ⅱ）穩(wěn)定期（Ⅲ）衰亡期（Ⅳ）

第二節(jié)微生物生長規(guī)律延滯期指數(shù)期穩(wěn)定期衰亡期第二節(jié)微生物生長規(guī)律

又稱停滯期、調(diào)整期和適應(yīng)期。指少量單細(xì)胞微生物接種到新鮮培養(yǎng)基后，在開始培養(yǎng)的一段時(shí)間內(nèi)細(xì)胞數(shù)目不立即增加，或增加很少，生長速度接近于零的一段時(shí)期——代謝系統(tǒng)正在適應(yīng)新環(huán)境。（一）延滯期（lagphase）延滯期第二節(jié)微生物生長規(guī)律分裂遲緩、代謝活躍①生長速率常數(shù)為零；②細(xì)胞形態(tài)變大或增長，許多桿菌可長成絲狀；例如，巨大芽孢桿菌（Bacillusmegaterium）在延滯期末，細(xì)胞的平均長度比剛接種時(shí)長6倍。一般來說處于延滯期的細(xì)菌細(xì)胞體積最大！1.延滯期的特點(diǎn)第二節(jié)微生物生長規(guī)律細(xì)胞處于活躍生長中，只是分裂遲緩。在此階段后期，少數(shù)細(xì)胞開始分裂，曲線略有上升。③細(xì)胞內(nèi)RNA尤其是rRNA含量增高，原生質(zhì)呈嗜堿性；④合成代謝十分活躍（核糖體、酶類和ATP合成加速），易產(chǎn)生各種誘導(dǎo)酶；⑤對外界不良條件敏感（如NaCl溶液濃度、溫度和抗生素等理化因素）。第二節(jié)微生物生長規(guī)律

微生物接種到一個(gè)新的環(huán)境，暫時(shí)缺乏分解和催化有關(guān)底物的酶，或是缺乏充足的中間代謝產(chǎn)物等。為適應(yīng)新的環(huán)境，產(chǎn)生誘導(dǎo)酶或合成中間代謝產(chǎn)物，就需要一段適應(yīng)期。調(diào)整代謝2.延滯期出現(xiàn)的原因第二節(jié)微生物生長規(guī)律（1）菌種的遺傳性（2）接種齡3.影響延滯期長短的因素（3）接種量

（4）培養(yǎng)基成分第二節(jié)微生物生長規(guī)律（1）菌種的遺傳性繁殖速度較快的菌種的延滯期一般較短，繁殖速度較慢的菌種的延滯期一般較長。第二節(jié)微生物生長規(guī)律（2）接種齡指接種物或種子（inoculum，復(fù)數(shù)inocula）的生長年齡，亦即它處在生長曲線上哪一個(gè)階段時(shí)用來作種子的。這里指某一群體的生理年齡。種子的接種齡子代培養(yǎng)物的延滯期對數(shù)期短穩(wěn)定期居中延滯期或衰亡期長第二節(jié)微生物生長規(guī)律接種量的大小明顯影響延滯期的長短。一般說來，接種量增大可縮短甚至消除延滯期。接種量小延滯期長接種量大延滯期短（3）接種量第二節(jié)微生物生長規(guī)律（4）培養(yǎng)基成分①在營養(yǎng)成分豐富的培養(yǎng)基中生長，延滯期較短；②接種后培養(yǎng)基成分變化不大時(shí)，延滯期較短。天然培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富延滯期短組合培養(yǎng)基營養(yǎng)單調(diào)延滯期長發(fā)酵生產(chǎn)中發(fā)酵培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基成分盡量接近第二節(jié)微生物生長規(guī)律（1）改變菌種的遺傳特性使延滯期縮短；（2）利用對數(shù)生長期的細(xì)胞作為種子；（3）接種前后所使用的培養(yǎng)基組成不要相差太大；（4）適當(dāng)擴(kuò)大接種量（群體優(yōu)勢——適應(yīng)性增強(qiáng)）。4.縮短延滯期的常用手段第二節(jié)微生物生長規(guī)律（二）對數(shù)生長期（logarithmicphase

）

又稱指數(shù)生長期（exponentialphase）。指生長曲線中緊接著延滯期的一段細(xì)胞數(shù)以幾何級數(shù)增長的時(shí)期。指數(shù)期第二節(jié)微生物生長規(guī)律1.對數(shù)生長期的特點(diǎn)①生長速率常數(shù)R最大，細(xì)胞的代時(shí)或原生質(zhì)的倍增時(shí)間最短；②細(xì)胞進(jìn)行平衡生長（balancedgrowth），菌體各部分的成分十分均勻；③酶系活躍，代謝旺盛。第二節(jié)微生物生長規(guī)律2.對數(shù)生長期的3個(gè)重要參數(shù)（1）繁殖代數(shù)（n）（2）生長速率常數(shù)（R）（3）代時(shí)（G）第二節(jié)微生物生長規(guī)律（1）繁殖代數(shù)（n）x2=x1·2n

lgx2–lgx1n=————————=3.322（lgx2–lgx1）

lg2第二節(jié)微生物生長規(guī)律（2）生長速率常數(shù)（R）

n3.322（lgx2–lgx1）R=————————=————————————————

t2–t1

t2–t1

單位時(shí)間分裂的代數(shù)第二節(jié)微生物生長規(guī)律（3）代時(shí)（G）1t2–t1G=————=————————————————

R3.322（lgx2–lgx1）

分裂一次需要的時(shí)間倍增時(shí)間（doublingtime）指在群體生長里細(xì)菌數(shù)量增加一倍或者原生質(zhì)增加一倍所需的時(shí)間。第二節(jié)微生物生長規(guī)律①代時(shí)反應(yīng)細(xì)菌的生長速率。代時(shí)短，生長速率快。②不同種微生物，代時(shí)的變化很大。多數(shù)為1~3h，有些<10min；另一些幾小時(shí)到幾天。③同一種微生物，在不同生長條件下其代時(shí)不同。④在一定條件下，每一種微生物的代時(shí)是恒定的，因此它是微生物菌種的一個(gè)重要特征。代時(shí)的意義第二節(jié)微生物生長規(guī)律部分細(xì)菌的代時(shí)菌名培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度/℃代時(shí)/minE.coli(大腸桿菌)肉湯 37 17E.Coli

牛奶 37 12.5Enterobacteraerogenes(產(chǎn)氣腸細(xì)菌)肉湯或牛奶37 16~18E.aerogenes

組合 37 29~44B.Cereus(蠟狀芽孢桿菌)肉湯 30 18B.thermophilus(嗜熱芽孢桿菌)肉湯 55 18.3Lactobacillusacidophilus(嗜酸乳桿菌)牛奶 37 66~87Streptococcuslactis(乳酸鏈球菌)牛奶 37 26S.Lactis

乳糖肉湯 37 48Salmonellatyphi(傷寒沙門氏菌)肉湯 37 23.5Azotobacterchroococcum(褐球固氮菌)葡萄糖 25 344~46Mycobacteriumtuberculosis(結(jié)核分枝桿菌)組合 37 792~93Nitrobacteragilis(活躍硝化桿菌)組合 27 1200第二節(jié)微生物生長規(guī)律3.影響微生物代時(shí)長短的因素不同的微生物及微生物的不同菌株代時(shí)不同。（1）菌種同一種微生物，在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中生長代時(shí)短，反之則長。（2）營養(yǎng)成分（3）營養(yǎng)物濃度營養(yǎng)物的濃度可影響微生物的生長速率和生長總量，在一定范圍內(nèi)，生長速率與營養(yǎng)物濃度呈正比。第二節(jié)微生物生長規(guī)律生長限制因子（growth-limitedfactor）

凡是處于較低濃度范圍內(nèi)，可影響生長速率的營養(yǎng)物成分，就稱為生長限制因子（growth-limitedfactor）。第二節(jié)微生物生長規(guī)律在一定范圍，生長速率與培養(yǎng)溫度呈正相關(guān)。（4）培養(yǎng)溫度E.coli在不同溫度下的代時(shí)第二節(jié)微生物生長規(guī)律4.對數(shù)生長期的應(yīng)用此時(shí)期的細(xì)菌個(gè)體形態(tài)、化學(xué)組成和生理特性等均較一致，代謝旺盛，生長迅速，代時(shí)穩(wěn)定；（1）是生理代謝及遺傳研究或進(jìn)行形態(tài)觀察等研究的良好材料；（2）是增殖噬菌體的最適菌齡；（3）發(fā)酵工業(yè)上用作種子的最佳菌齡；（4）生產(chǎn)上盡量延長該期，以達(dá)到較高的菌體密度；（5）食品工業(yè)上盡量防止有害微生物進(jìn)入此期。第二節(jié)微生物生長規(guī)律（三）穩(wěn)定期（stationaryphase）

又稱恒定期或最高生長期。這個(gè)時(shí)期是處于新繁殖的細(xì)胞數(shù)與衰亡的細(xì)胞數(shù)相等，或正生長與負(fù)生長相等的動(dòng)態(tài)平衡之中。穩(wěn)定期第二節(jié)微生物生長規(guī)律1.穩(wěn)定期的特點(diǎn)①生長速率常數(shù)R為零；②菌體產(chǎn)量達(dá)到了最高點(diǎn)；③合成抗生素等次生代謝產(chǎn)物；④細(xì)胞內(nèi)開始積累糖原、異染粒等內(nèi)含物；⑤芽孢桿菌開始形成芽孢。第二節(jié)微生物生長規(guī)律

穩(wěn)定期的菌體產(chǎn)量達(dá)到了最高點(diǎn)，而且菌體產(chǎn)量與營養(yǎng)物質(zhì)的消耗間呈現(xiàn)出一定的比例關(guān)系，這一關(guān)系就是生長產(chǎn)量常數(shù)Y（或稱生長得率，growthyield）。生長產(chǎn)量常數(shù)Y（growthyield）第二節(jié)微生物生長規(guī)律

x–x0

x–x0Y=——————=——————

C0–C

C0

x——穩(wěn)定期時(shí)的細(xì)胞干重（g/mL培養(yǎng)液）x0——?jiǎng)偨臃N時(shí)的細(xì)胞干重C0——限制性營養(yǎng)物的最初濃度（g/mL）C

——穩(wěn)定期時(shí)限制性營養(yǎng)物的濃度（由于計(jì)算Y時(shí)必須用限制性營養(yǎng)物，所以C應(yīng)等于0）生長產(chǎn)量常數(shù)Y（growthyield）第二節(jié)微生物生長規(guī)律①營養(yǎng)物尤其是生長限制因子的耗盡；②營養(yǎng)物的比例失調(diào)，例如C／N比值不合適等；③酸、醇、毒素或H2O2等有害代謝產(chǎn)物的累積；④pH、氧化還原勢等理化條件越來越不適宜等。2.穩(wěn)定期到來的原因第二節(jié)微生物生長規(guī)律（1）以生產(chǎn)菌體或與菌體生長相平行的代謝產(chǎn)物（SCP、乳酸等）為目的的某些發(fā)酵生產(chǎn)來說，穩(wěn)定期是產(chǎn)物的最佳收獲期；（2）對維生素、堿基、氨基酸等物質(zhì)進(jìn)行生物測定（bioassay）來說，穩(wěn)定期是最佳測定時(shí)期；（3）通過對穩(wěn)定期到來原因的研究，還促進(jìn)了連續(xù)培養(yǎng)原理的提出和工藝、技術(shù)的創(chuàng)建。3.穩(wěn)定期對生產(chǎn)實(shí)踐的指導(dǎo)意義第二節(jié)微生物生長規(guī)律4.生產(chǎn)實(shí)踐中延長穩(wěn)定期的措施（1）補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)（補(bǔ)料）（2）取走代謝產(chǎn)物（3）調(diào)節(jié)pH（4）調(diào)節(jié)溫度（5）對好氧菌增加通氣、攪拌或振蕩

可延長穩(wěn)定生長期，以獲得更多的菌體物質(zhì)或積累更多的代謝產(chǎn)物。第二節(jié)微生物生長規(guī)律（四）衰亡期（declinephase或deathphase）

在衰亡期中，個(gè)體死亡的速度超過新生的速度，整個(gè)群體呈現(xiàn)負(fù)生長狀態(tài)（R為負(fù)值）。衰亡期第二節(jié)微生物生長規(guī)律1.衰亡期的特點(diǎn)①生長速率常數(shù)R為負(fù)值；②細(xì)胞出現(xiàn)多形化、畸形或衰退形

；③合成或釋放抗生素等次生代謝產(chǎn)物；④芽孢桿菌釋放芽孢；⑤細(xì)胞死亡，出現(xiàn)自溶（autolysis）現(xiàn)象。第二節(jié)微生物生長規(guī)律有的微生物在衰亡期由于蛋白水解酶活力的增強(qiáng)或溶菌酶作用而發(fā)生自溶（autolysis）現(xiàn)象。自溶（autolysis）第二節(jié)微生物生長規(guī)律2.產(chǎn)生衰亡期的原因外界環(huán)境對繼續(xù)生長越來越不利，例如，營養(yǎng)物質(zhì)耗盡和有毒代謝產(chǎn)物的大量積累等，從而引起細(xì)胞內(nèi)的分解代謝大大超過合成代謝，繼而導(dǎo)致菌體死亡。第二節(jié)微生物生長規(guī)律在衰亡期死亡的細(xì)菌以對數(shù)方式增加，但在其后期，由于部分細(xì)菌產(chǎn)生抗性也會使細(xì)菌死亡的速率降低，仍有部分活菌存在。注意：第二節(jié)微生物生長規(guī)律絲狀微生物的非典型生長曲線以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)以菌絲干重為縱坐標(biāo)作圖測定的數(shù)據(jù)一條反映絲狀微生物群體生長變化規(guī)律的曲線！第二節(jié)微生物生長規(guī)律

對于絲狀生長的真菌和放線菌來說，是一條“非典型”的生長曲線，真菌的生長曲線大致可分3個(gè)時(shí)期，即

生長延滯期、快速生長期、生長衰退期。生長延滯期快速生長期生長衰退期第二節(jié)微生物生長規(guī)律1.生長延滯期生長延滯：一是孢子萌發(fā)前真正的停滯狀態(tài)，另一種是生長已經(jīng)開始，但還無法測定。2.快速生長期菌絲體干重迅速增加，其立方根與時(shí)間呈直線關(guān)系，菌絲干重不以幾何級數(shù)增加，沒有對數(shù)生長期。生長主要表現(xiàn)在菌絲尖端的伸長和出現(xiàn)分支、斷裂等，此時(shí)期的菌體呼吸強(qiáng)度達(dá)到高峰，有的開始積累代謝產(chǎn)物。3.衰退期菌絲體干重下降，到一定時(shí)期不再變化。大多數(shù)次級代謝產(chǎn)物在此期合成，大多數(shù)細(xì)胞都出現(xiàn)大的空泡。有些菌絲體還會發(fā)生自溶菌絲體，這與菌種和培養(yǎng)條件有關(guān)。第二節(jié)微生物生長規(guī)律微生物的二次生長

不同的微生物或同一種微生物對不同物質(zhì)的利用能力是不同的。當(dāng)培養(yǎng)基中同時(shí)含有速效和遲效碳源（或氮源）時(shí)，微生物在生長過程中會形成二次生長現(xiàn)象。第二節(jié)微生物生長規(guī)律三、微生物的連續(xù)培養(yǎng)分批培養(yǎng)（batchculture）

：將微生物置于一定容積的定量的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基一次性加入，不再補(bǔ)充和更換，最后一次性收獲。連續(xù)培養(yǎng)（continuousculture）：在微生物培養(yǎng)的過程中，不斷地供給新鮮的營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)排除含菌體及代謝產(chǎn)物的發(fā)酵液，讓培養(yǎng)的微生物長時(shí)間地處于對數(shù)生長期，以利于微生物的增殖速度和代謝活性處于某種穩(wěn)定狀態(tài)。第二節(jié)微生物生長規(guī)律連續(xù)培養(yǎng)（continousculture）

又稱開放培養(yǎng)（openculture），在微生物的整個(gè)培養(yǎng)期間，通過一定的方式使微生物能以恒定的比生長速率生長并能持續(xù)生長下去的一種培養(yǎng)方法。培養(yǎng)過程中不斷地補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)和以同樣的速率移出培養(yǎng)物是實(shí)現(xiàn)微生物連續(xù)培養(yǎng)的基本原則。第二節(jié)微生物生長規(guī)律連續(xù)培養(yǎng)理論基礎(chǔ)：由于對典型生長曲線中穩(wěn)定期到來原因的認(rèn)識，采取相應(yīng)有效措施推遲其來臨，從而發(fā)展出現(xiàn)在的連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)。第二節(jié)微生物生長規(guī)律連續(xù)培養(yǎng)的基本原理：當(dāng)微生物在單批培養(yǎng)方式下生長達(dá)到對數(shù)期后期時(shí)，一方面以一定的速度流進(jìn)新鮮培養(yǎng)基并攪拌，另一方面以溢流方式流出培養(yǎng)液，使培養(yǎng)物達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，其中的微生物就能長期保持對數(shù)期的平衡生長狀態(tài)和穩(wěn)定的生長速率。第二節(jié)微生物生長規(guī)律連續(xù)培養(yǎng)器的類型按控制方式分內(nèi)控制（控制菌體密度）：恒濁器外控制（控制培養(yǎng)液流速及R）：恒化器單級連續(xù)培養(yǎng)器多級連續(xù)培養(yǎng)器一般連續(xù)培養(yǎng)器固定化細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)器實(shí)驗(yàn)室科研用：連續(xù)培養(yǎng)器發(fā)酵生產(chǎn)用：連續(xù)發(fā)酵罐連續(xù)培養(yǎng)器按培養(yǎng)器的級數(shù)分按細(xì)胞狀態(tài)分按用途分第二節(jié)微生物生長規(guī)律控制連續(xù)培養(yǎng)的方法恒濁連續(xù)培養(yǎng)不斷調(diào)節(jié)流速而使細(xì)菌培養(yǎng)液濁度保持恒定恒化連續(xù)培養(yǎng)保持恒定的流速第二節(jié)微生物生長規(guī)律（一）恒濁連續(xù)培養(yǎng)通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基流速，使培養(yǎng)液濁度保持恒定的連續(xù)培養(yǎng)方法。采用恒濁器（turbidostat）進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。第二節(jié)微生物生長規(guī)律

恒濁器（turbidostat）是一種根據(jù)培養(yǎng)器內(nèi)微生物的生長密度，并借光電控制系統(tǒng)來控制培養(yǎng)液流速，以取得菌體密度高、生長速度恒定的微生物細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)器。第二節(jié)微生物生長規(guī)律在線測定所培養(yǎng)微生物的光密度值自動(dòng)調(diào)節(jié)新鮮培養(yǎng)基流入和培養(yǎng)物流出培養(yǎng)室的流速使培養(yǎng)物維持在某一恒定濁度當(dāng)培養(yǎng)室中的濁度超過預(yù)期數(shù)值時(shí)，流速加快，使?jié)岫冉档?；?dāng)培養(yǎng)室中的濁度低于預(yù)期數(shù)值時(shí)，流速減慢，使?jié)岫壬吆銤崤囵B(yǎng)器的工作精度是由光電控制系統(tǒng)的靈敏度來決定的如果所用培養(yǎng)基中有過量的必需營養(yǎng)物，就可以使菌體維持最高的生長速率特點(diǎn)：基質(zhì)過量，微生物始終以最高速率進(jìn)行生長，并可在允許范圍內(nèi)控制不同的菌體密度；但工藝復(fù)雜，繁瑣。應(yīng)用范圍：用于生產(chǎn)大量菌體、生產(chǎn)與菌體生長相平行的某些代謝產(chǎn)物，如乳酸、乙醇等。第二節(jié)微生物生長規(guī)律（二）恒化連續(xù)培養(yǎng)采用恒定流速使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)濃度恒定而保持細(xì)菌生長速率恒定的方法。采用恒化器（chemostat或bactogen）進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。第二節(jié)微生物生長規(guī)律恒化器（chemostat或bactogen）

是一種設(shè)法使培養(yǎng)液流速保持不變，并使微生物始終在低于其最高生長速率條件下進(jìn)行生長繁殖的一種連續(xù)培養(yǎng)裝置。它通過控制某一種營養(yǎng)物的濃度，使其始終成為生長限制因子的條件下達(dá)到的，因而可稱為外控制式的連續(xù)培養(yǎng)裝置。第二節(jié)微生物生長規(guī)律1.培養(yǎng)液儲備瓶：a過濾器,b培養(yǎng)基進(jìn)口2.蠕動(dòng)泵3.恒化器：c培養(yǎng)基入口,d攪拌器,e空氣過濾裝置,d取樣口4.收集瓶：g過濾器恒化器結(jié)構(gòu)示意圖第二節(jié)微生物生長規(guī)律使培養(yǎng)液流速保持不變，并使微生物始終在低于其最高生長速率下進(jìn)行生長繁殖。將某種必需的營養(yǎng)物質(zhì)控制在較低的濃度，作為限制性因子，其他營養(yǎng)物均過量（細(xì)菌的生長速率取決于限制性因子的濃度，并低于最高生長速率）生長限制性因子必須是機(jī)體生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，因而可在一定濃度范圍內(nèi)能決定該機(jī)體生長速率通過控制流速可以得到生長速率不同但密度基本恒定的培養(yǎng)物第二節(jié)微生物生長規(guī)律特點(diǎn)：維持營養(yǎng)成分的亞適量，控制微生物生長速率。菌體生長速率恒定，菌體均一，密度穩(wěn)定，產(chǎn)量低于最高菌體產(chǎn)量。遺傳學(xué)：突變株分離；生理學(xué)：不同條件下的代謝變化；生態(tài)學(xué)：模擬自然營養(yǎng)條件建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。?yīng)用范圍：

第二節(jié)微生物生長規(guī)律恒濁器與恒化器的比較裝置控制對象培養(yǎng)基培養(yǎng)基流速生長速率產(chǎn)物應(yīng)用范圍恒濁器菌體密度(內(nèi)控制)無

限制生長因子不恒定最高菌體或與菌體形成相平行的產(chǎn)物生產(chǎn)為主恒化器培養(yǎng)基流速(外控制)有限制生長因子恒定低于最高不同生長速率的菌體實(shí)驗(yàn)室為主第二節(jié)微生物生長規(guī)律連續(xù)發(fā)酵與單批發(fā)酵相比的優(yōu)點(diǎn)：（1）高效，簡化了操作——裝料、滅菌、出料、清洗發(fā)酵罐等單元操作；（2）自控，便于利用各種儀表進(jìn)行自動(dòng)控制；（3）產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定；（4）節(jié)約，節(jié)省大量動(dòng)力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、電的負(fù)荷均衡合理。第二節(jié)微生物生長規(guī)律連續(xù)發(fā)酵與單批發(fā)酵相比的缺點(diǎn)：（1）菌種易于退化；（2）易于遭到雜菌污染；（3）營養(yǎng)物利用率低于單批培養(yǎng)。所以，連續(xù)發(fā)酵的生產(chǎn)時(shí)間受以上因素限制，一般只能維持?jǐn)?shù)月至1年。第二節(jié)微生物生長規(guī)律四、微生物的高密度培養(yǎng)微生物的高密度培養(yǎng)（highcell-densityculture，HCDC）也稱高密度發(fā)酵，一般是指微生物在液體培養(yǎng)中細(xì)胞群體密度超過常規(guī)培養(yǎng)10倍以上時(shí)的生長狀態(tài)或培養(yǎng)技術(shù)。第二節(jié)微生物生長規(guī)律現(xiàn)代高密度培養(yǎng)技術(shù)主要是在用基因工程菌（尤其是E.coli）生產(chǎn)多肽類藥物的實(shí)踐中逐步發(fā)展起來的。例如，人生長激素胰島素白細(xì)胞介素類人干擾素等

重組人生長激素凍干粉針劑第二節(jié)微生物生長規(guī)律提高菌體培養(yǎng)密度產(chǎn)物的比生產(chǎn)率（單位體積單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的產(chǎn)量）“下游工程”（down-streamprocessing）中分離、提取的效率重要的實(shí)踐價(jià)值減少培養(yǎng)容器的體積培養(yǎng)基的消耗生產(chǎn)周期設(shè)備投入生產(chǎn)成本第二節(jié)微生物生長規(guī)律高密度培養(yǎng)的具體方法：（1）選取最佳培養(yǎng)基成分和各成分含量。（2）補(bǔ)料，這是工程菌高密度培養(yǎng)的重要手段之一。（3）提高溶解氧的濃度，提高好氧菌和兼性厭氧菌培養(yǎng)時(shí)的溶氧量也是高密度培養(yǎng)的重要手段之一。（4）防止有害代謝產(chǎn)物的生成。第二節(jié)微生物生長規(guī)律環(huán)境因素對微生物生長的影響第三節(jié)影響微生物生長的外界因素很多，除了前面講過的營養(yǎng)因素之外，還有許多物理化學(xué)條件。本節(jié)主要內(nèi)容：一、溫度對微生物生長的影響二、氧氣對微生物生長的影響三、pH對微生物生長的影響一、溫度溫度是影響微生物細(xì)胞生長和存活的最重要的因素之一。溫度對微生物的影響具體表現(xiàn)在：（1）影響酶活性（2）影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性，影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與代謝產(chǎn)物的分泌（3）影響物質(zhì)的溶解度1.微生物生長溫度的3個(gè)重要指標(biāo)從微生物整體來看:生長的溫度范圍一般在-10～100℃；極端下限為-30℃，極端上限為105～300℃。對于特定的某一種微生物：只能在一定溫度范圍內(nèi)生長，在這個(gè)范圍內(nèi)，每種微生物都有自己的生長溫度三基點(diǎn)。最低生長溫度最適生長溫度最高生長溫度生長溫度三基點(diǎn)(threecardinalpoint)處于最適生長溫度時(shí)，生長速度最快，代時(shí)最短。超過最低生長溫度時(shí)，微生物不生長，溫度過低，甚至?xí)劳?。超過最高生長溫度時(shí)，微生物不生長，溫度過高，甚至?xí)劳觥?/p>

微生物作為整體來言，其溫度的三基點(diǎn)是極其寬的，堪稱“生物世界之最”。根據(jù)微生物的最適生長溫度的不同，可將微生物劃為3個(gè)類型：低溫型微生物（嗜冷微生物）中溫型微生物（嗜溫微生物）高溫型微生物（嗜熱微生物）15℃25~37℃55℃溫度對微生物生長速率的影響

對某一具體微生物來說，其生長溫度的寬和窄與它們長期進(jìn)化過程中所處的生存環(huán)境溫度有關(guān)。寬溫微生物窄溫微生物一些生活在土壤中的芽孢桿菌（15～65℃）；既可在人體大腸中生活，也可在體外環(huán)境中生活的E.coli（10～47.5℃）；專性寄生在人體泌尿生殖道中的Neisseriagonorrhoeae（淋病奈瑟氏球菌）（36～40℃）。

最適生長溫度（optimumgrowthtemperature）簡稱最適溫度，是指某菌分裂代時(shí)最短或生長速率最高時(shí)的培養(yǎng)溫度。2.最適生長溫度對同一微生物來說，最適溫度并非一切生理過程的最適溫度——一般規(guī)律最適生長溫度≠生長得率最高時(shí)的培養(yǎng)溫度≠累積某一代謝產(chǎn)物量最高時(shí)的培養(yǎng)溫度≠最適發(fā)酵速率強(qiáng)調(diào)指出菌名生長溫度／℃發(fā)酵溫度／℃累積產(chǎn)物溫度／℃Serratiamarcescens（粘質(zhì)賽氏桿菌）37合成靈桿菌素20～25Aspergillusniger（黑曲霉）37產(chǎn)糖化酶32～34Streptococcusthermophilus（嗜熱鏈球菌）374737Streptococcuslactis（乳酸鏈球菌）3440產(chǎn)細(xì)胞：25～30產(chǎn)乳酸：30例如，在Penicilliumchrysogenum（產(chǎn)黃青霉）總共165h的青霉素發(fā)酵過程中，根據(jù)不同生理代謝過程的溫度特點(diǎn)分四段控制其培養(yǎng)溫度。0h→

5

h→40

h→125

h→165

h結(jié)果，青霉素產(chǎn)量提高了14.7％。30℃25℃20℃25℃這一規(guī)律對指導(dǎo)發(fā)酵生產(chǎn)有著重要的意義。二、氧氣氧對微生物的生命活動(dòng)有著極其重要的影響。好氧微生物（好氧菌，aerobes）厭氧微生物（厭氧菌，anaerobes）細(xì)分為5類微生物與氧的關(guān)系微生物與氧氣的關(guān)系好氧菌(aerobes)厭氧菌(anaerobes)專性好氧菌：需氧，通過呼吸產(chǎn)能兼性厭氧菌微好氧菌：需在微量氧下生活耐氧菌：不需氧，只以發(fā)酵產(chǎn)能，氧無毒害（專性）厭氧菌：氧有害或致死，以發(fā)酵或無氧呼吸產(chǎn)能以呼吸為主，兼營發(fā)酵產(chǎn)能以呼吸為主，兼營厭氧呼吸產(chǎn)能1.專性好氧菌（obligateorstrict

aerobes）

必須在較高濃度分子氧（～2×104Pa）的條件下才能生長，它們有完整的呼吸鏈，以分子氧作為最終氫受體，含有超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase）。絕大多數(shù)真菌和許多細(xì)菌、放線菌都是專性好氧菌，例如，Acetobacter（醋桿菌屬）、

Azotobacter（固氮菌屬）、Pseudomonasaeruginosa

（銅綠假單胞菌，又稱綠膿桿菌）、Coeynebacteriumdiphtheriae（白喉棒桿菌）等。2.兼性厭氧菌（facultativeanaerobes）

是以在有氧條件下的生長為主也可兼在厭氧條件下生長的微生物，有時(shí)也稱

“兼性好氧菌”

（facultativeaerobes）。

在有氧時(shí)靠呼吸產(chǎn)能；無氧時(shí)借發(fā)酵或無氧呼吸產(chǎn)能，細(xì)胞含SOD和過氧化氫酶。許多酵母菌和不少細(xì)菌都是兼性厭氧菌。例如，Saccharomycescerevisiae（釀酒酵母）、Bacilluslicheniformis（地衣芽孢桿菌）、腸桿菌科的各種細(xì)菌，包括E.coli、Enterobacteraerogenes

（產(chǎn)氣腸桿菌，舊稱產(chǎn)氣氣桿菌或產(chǎn)氣桿菌）

Proteusvulgaris（普通變形桿菌）等。3.微好氧菌（microaerophilicbacteria）

只能在較低的氧分壓（1×103Pa～3×103Pa

)，正常大氣中的氧分壓為0.2bar）下才能正常生長的微生物。也是通過呼吸鏈并以氧為最終氫受體而產(chǎn)能。例如，Vibriocholerae（霍亂弧菌）、Hydrogenomonas（氫單胞菌屬）、

Zymomonas（發(fā)酵單胞菌屬）

和Campylobacter（彎曲菌屬）等。4.耐氧菌（aerotolerantanaerobes）

即耐氧性厭氧菌的簡稱?？稍诜肿友醮嬖谙逻M(jìn)行發(fā)酵性厭氧生活的厭氧菌。它們的生長不需要任何氧，但分子氧對它也無毒害。

它們不具有呼吸鏈，依靠專性發(fā)酵和底物水平磷酸化而獲得能量。

細(xì)胞內(nèi)存在SOD和過氧化物酶，但缺乏過氧化氫酶。一般的乳酸菌多數(shù)是耐氧菌，

例如，Streptococcuslactis（乳鏈球菌）、

Lactobacilluslactis（乳酸乳桿菌）、Leuconostocmesenteroides（腸膜明串珠菌）等；非乳酸菌類耐氧菌，

例如，Butyribacteriumrettgeri（雷氏丁酸桿菌）等。5.厭氧菌（anaerobes）嚴(yán)格厭氧菌一般厭氧菌特點(diǎn)：①

分子氧對它們有毒，即使短期接觸也會抑制甚至致死；②

在空氣或含10％CO2的空氣中，它們在固體或半固體培養(yǎng)基的表面上不能生長，只有在其深層的無氧或低氧化還原勢的環(huán)境下才能生長；③

生命活動(dòng)所需能量是通過發(fā)酵、無氧呼吸、循環(huán)光合磷酸化或甲烷發(fā)酵等提供；④

細(xì)胞內(nèi)缺乏SOD和細(xì)胞色素氧化酶，大多數(shù)還缺乏過氧化氫酶。常見的厭氧菌：Clostridium（梭菌屬）、Bacteroides（擬桿菌屬）、Fusobacterium（梭桿菌屬）、Bifidobacterium（雙歧桿菌屬）、以及各種光合細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌（methanogens）等。極端厭氧菌

1971年McCord和Fridovich提出關(guān)于專性厭氧生活的超氧化物歧化酶（SOD）學(xué)說。關(guān)于厭氧菌的氧毒害機(jī)制嚴(yán)格厭氧微生物并不是被氣態(tài)的氧所殺死，而是由于不能解除某些氧代謝產(chǎn)物的毒性而死亡。在氧還原為水的過程中，可形成某些有毒的中間產(chǎn)物，例如，過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子（O2·

）等。超氧陰離子為活性氧，兼有分子和離子的性質(zhì)，反應(yīng)力極強(qiáng)，極不穩(wěn)定，可破壞膜和重要生物大分子，對微生物造成毒害或致死。厭氧菌的氧毒害機(jī)制——

SOD學(xué)說：好氧微生物具有降解這些產(chǎn)物的酶，如過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶等，而嚴(yán)格厭氧菌缺乏SOD，故易被生物體內(nèi)極易產(chǎn)生的超氧陰離子自由基毒害致死。菌類型超氧化物歧化酶（SOD）過氧化氫酶細(xì)胞色素系統(tǒng)好氧菌有活力有活力有耐氧性厭氧菌有活力無活力無嚴(yán)格厭氧菌無活力無活力無微生物中SOD和過氧化氫酶的分布狀況：超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）SOD的功能：保護(hù)好氧菌免受超氧化物陰離子自由基的毒害，從而提出缺乏SOD的微生物必然只能進(jìn)行專性厭氧生活的學(xué)說。按SOD分子中所含金屬輔基的不同，可把它分為3類：類型SOD分子中所含金屬輔基存在的范圍①Cu、Zn幾乎所有的真核生物的細(xì)胞質(zhì)中②Fe原核生物③Mn真核生物的線粒體中過氧化氫酶（catalase）2H2O2過氧化氫酶2H2O+O2過氧化物酶NADH2 NAD耐氧菌過氧化氫酶好氧生物SOD好氧生物和耐氧細(xì)菌 H2O+O22O2·+2H+ O2+H2O2 2H2O12三、pHpH表示某水溶液中氫離子濃度的負(fù)對數(shù)值。純水呈中性，其氫離子濃度為10-7mol/L，pH為7。最低生長pH最適生長pH最高生長pH1.微生物pH的3個(gè)重要指標(biāo)從微生物整體來看:生長的pH范圍極廣，2～10，絕大多數(shù)微生物的生長pH都在5～9之間。對于特定的某一種微生物：只能在一定pH范圍內(nèi)生長，不同的微生物的生長pH也存在最低pH、最適pH、最高pH

3個(gè)數(shù)值。2.環(huán)境pH對微生物生長的影響（1）影響細(xì)胞膜的通透性和穩(wěn)定性；（2）影響物質(zhì)溶解度；（3）影響細(xì)胞表面電荷分布；（4）改變酶活、酶促反應(yīng)的速率及代謝途徑；（5）影響營養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度，從而影響吸收；（6）影響有毒物質(zhì)的毒性。注意：（1）微生物的活動(dòng)也能改變環(huán)境的pH；（2）不同種類的微生物有其最適生長pH；（3）同一種微生物在其不同的生長階段和不同的生理、生化過程中有不同的pH要求；（4）各類微生物能夠生長的pH較寬，但細(xì)胞內(nèi)部pH卻接近中性。根據(jù)微生物生長的最適pH，將微生物分為：

嗜堿微生物：硝化細(xì)菌、尿素分解菌、多數(shù)放線菌耐堿微生物：許多鏈霉菌中性微生物：絕大多數(shù)細(xì)菌，一部分真菌嗜酸微生物：硫桿菌屬耐酸微生物：乳酸桿菌、醋酸桿菌不同微生物的生長pH范圍最適生長pH偏于堿性范圍內(nèi)的微生物嗜堿微生物（basophile）耐堿微生物（basotolerantmicroorganism）例如,硝化細(xì)菌、尿素分解菌、根瘤菌和放線菌等如若干鏈霉菌等嗜堿性的能耐較堿的條件最適生長pH偏于酸性范圍內(nèi)的微生物嗜酸微生物（acidophile）耐酸微生物（acidotolerantmicroorganism）如Thiobacillus（硫桿菌屬）等如乳酸桿菌、醋酸桿菌、許多腸桿菌和假單胞菌等一般地說，多數(shù)真菌是嗜酸的（pH5），而多數(shù)放線菌則是嗜堿的（pH8）。嗜酸性的能耐較酸的條件對發(fā)酵生產(chǎn)中pH的控制最為重要。許多抗生素的生產(chǎn)菌也有同樣的情況。

不同種類微生物不同的最適生長pH同一種微生物在不同的生長階段和不同的生理、生化過程同一種微生物在不同的生長階段和不同生理生化過程中，對環(huán)境pH要求不同。例如：丙酮丁醇梭菌在pH=5.5～7.0時(shí)，以菌體生長為主。在pH=4.3～5.3時(shí)，進(jìn)行丙酮丁醇發(fā)酵。同一種微生物由于環(huán)境pH不同，可能積累不同的代謝產(chǎn)物。例如：黑曲霉pH=2～3時(shí)，產(chǎn)物以檸檬酸為主，只產(chǎn)少量草酸。pH在7左右時(shí)，產(chǎn)物以草酸為主，只產(chǎn)少量檸檬酸。幾種抗生素產(chǎn)生菌的生長與發(fā)酵的最適pH可免除DNA、ATP、菌綠素和葉綠素等重要成分被酸破壞，或RNA、磷脂類等被堿破壞的可能性。外環(huán)境pH相當(dāng)穩(wěn)定，一般都接近中性pH變化很大微生物細(xì)胞內(nèi)環(huán)境胞內(nèi)酶最適pH一般接近中性周質(zhì)空間中的酶胞外酶最適pH接近環(huán)境的pH

微生物也會能動(dòng)地改變外界環(huán)境的pH——培養(yǎng)基的pH在培養(yǎng)微生物過程中會發(fā)生改變?？赡馨l(fā)生的反應(yīng)有以下幾種

在一般培養(yǎng)過程中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，一般培養(yǎng)基以變酸占優(yōu)勢。pH變化與培養(yǎng)基的組分尤其是碳氮比有極大的關(guān)系。在微生物培養(yǎng)過程中，一項(xiàng)重要措施

——及時(shí)調(diào)節(jié)合適的pH。

根據(jù)表面現(xiàn)象進(jìn)行直接、快速但不能持久的調(diào)節(jié)。根據(jù)內(nèi)在機(jī)制采用間接、緩效但能發(fā)揮較持久作用的調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)措施治標(biāo)治本有害微生物的控制第四節(jié)控制（有害）微生物的生長速率,消滅不需要的微生物，在實(shí)際應(yīng)用中具有重要的意義。一、幾個(gè)基本概念消毒(disinfection)：殺死或消除物體上的病原微生物的方法。滅菌（sterilization）：殺死物體上全部微生物的方法。防腐(antisepsis)：用理化方法防止或抑制微生物生長的方法?；?chemotherapy)：利用對病原菌具有高度毒力而對宿主基本無毒的化學(xué)物質(zhì)來抑制宿主體內(nèi)病原微生物的生長繁殖?？刂朴泻拇胧缦?部分殺滅)抑制除菌滅菌(徹底殺滅)防腐(抑制霉腐微生物)化療(抑制宿主體內(nèi)病原菌)殺菌溶菌理化因子抑菌還是殺菌作用的相關(guān)因素：理化因子的強(qiáng)度或濃度；同一濃度理化因子作用時(shí)間的長短；不同種類的微生物；同種微生物的不同生長時(shí)期。（一）滅菌（sterilization）

采用強(qiáng)烈的理化因素使任何物體內(nèi)外部的一切微生物永遠(yuǎn)喪失其生長繁殖能力的措施，稱為滅菌。例如，高溫滅菌、輻射滅菌等。

殺菌（bacteriocidation）溶菌（bacteriolysis）菌體雖死，但形體尚存“死有全尸”菌體殺死后，其細(xì)胞發(fā)生溶化、消失的現(xiàn)象“死無全尸”滅菌（二）消毒（disinfection）

消

除毒

害“毒害”就是指傳染源或致病菌

消毒是一種采用較溫和的理化因素，僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體或動(dòng)、植物有害的病原菌，而對被消毒的對象基本無害的措施。例如，對皮膚、水果、飲用水進(jìn)行藥劑消毒的方法；對房間、道路、工廠、學(xué)校等進(jìn)行藥劑噴灑消毒；對啤酒、牛奶、果汁和醬油等進(jìn)行消毒處理的巴氏消毒法，等等。

（三）防腐（antisepsis）

防腐就是利用某種理化因素完全抑制霉腐微生物的生長繁殖，即通過制菌作用防止食品、生物制品等對象發(fā)生腐敗或霉變的措施。防腐的措施：（1）低溫（2）缺氧（3）干燥（4）高滲（5）高酸度（6）高醇度（7）防腐劑（四）化療

（chemotherapy）

化療即化學(xué)治療，指利用具有高度選擇毒力（selectivetoxicity）即對病原菌具有高度毒力而對宿主基本無毒的化學(xué)物質(zhì)來抑制宿主體內(nèi)病原微生物的生長繁殖，借以達(dá)到治療該宿主傳染病的一種措施。

用于化療目的的化學(xué)物質(zhì)稱化學(xué)治療劑（chemotherapeutant）?；瘜W(xué)治療劑磺胺類等化學(xué)合成藥物抗生素生物藥物素若干中草藥中的有效成分等殺滅或抑制微生物的物理因素高溫作用輻射作用高滲作用超聲波微波激光等二、物理滅菌因素（一）高溫殺菌作用的種類使蛋白質(zhì)、核酸等重要生物大分子發(fā)生變性失活，以及破壞細(xì)胞膜上的類脂成分，導(dǎo)致微生物死亡。高溫的作用：LTH法HTST法高溫滅菌（消毒）法火焰灼燒法間歇滅菌法常規(guī)加壓滅菌法烘箱熱空氣滅菌法濕熱滅菌（消毒）法干熱滅菌法巴氏消毒法煮沸消毒法常壓下加壓下連續(xù)加壓滅菌法（2）烘箱內(nèi)熱空氣滅菌（1）火焰灼燒干熱滅菌法

（dryheatsterilization）細(xì)胞膜破壞蛋白質(zhì)變性原生質(zhì)干燥各種細(xì)胞成分發(fā)生氧化干熱的作用：（1）火焰灼燒

灼燒（incineration或combustion）是一種最徹底的干熱滅菌方法，其破壞力很強(qiáng)，故應(yīng)用范圍僅限于接種環(huán)、接種針的滅菌或帶病原菌的材料、動(dòng)物尸體的燒毀等。

將金屬制品或清潔玻璃器皿放入電熱烘箱內(nèi)，在150～170℃下維持1～2h后，即可達(dá)到徹底滅菌的目的。（2）烘箱內(nèi)熱空氣滅菌2.濕熱滅菌法

（moistheatsterilization）濕熱滅菌法是指用100℃以上的加壓蒸汽進(jìn)行滅菌。（2）加壓法①常規(guī)加壓蒸汽滅菌法②連續(xù)加壓蒸汽滅菌法（1）常壓法①巴氏消毒法②煮沸消毒法③間歇滅菌法濕熱比干熱滅菌更好：?濕熱蒸汽透射力強(qiáng)，更易于傳遞熱量；?水蒸汽存在潛熱，汽變水放熱，升高溫度；?蛋白質(zhì)含水量與凝固溫度成反比，濕熱更易破壞保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的氫鍵等結(jié)構(gòu)；濕熱對一般營養(yǎng)體和孢子的殺滅條件：多數(shù)細(xì)菌和真菌的營養(yǎng)細(xì)胞：在60℃左右處理5～10min；酵母菌和真菌的孢子：用80℃以上溫度處理；細(xì)菌的芽孢：

121℃處理15min以上。（1）常壓法①

巴斯德消毒（pasteurization）法國微生物學(xué)家巴斯德于1865年發(fā)明，用于果酒的消毒，是一種低溫濕熱消毒法，處理溫度變化很大，一般在60～85℃處理15s～30min。低溫維持法（LTH，lowtemperatureholdingmethod）高溫瞬時(shí)法（HTST，hightemperatureshorttime）在63℃下保持30min可進(jìn)行牛奶消毒牛奶消毒時(shí)只要在72℃下保持15s即可巴斯德消毒的兩種具體方法專用于牛奶、啤酒、果酒和醬油等不宜進(jìn)行高溫滅菌的液態(tài)風(fēng)味食品或調(diào)料的低溫消毒方法。目前是世界上通用的一種牛奶消毒法。巴氏消毒法的用途：巴氏消毒法的優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：殺滅物料中無芽孢的病原菌（如結(jié)核桿菌或沙門氏菌），而又不影響它們的風(fēng)味。缺點(diǎn)：不能殺滅芽孢和某些病原體。例如，伯氏考克斯氏體（Coxiellaburnetii)，是一種立克次氏體，引起Q熱的病原體。100℃處理15～30min一般用于飲用水的消毒②煮沸消毒法煮沸消毒法的用途：③間歇滅菌法

（fractionalsterilization或tyndallization）又稱丁達(dá)爾滅菌法或分段滅菌法。具體滅菌步驟：（1）80～100℃下蒸煮15～60min，殺滅微生物營養(yǎng)體；（2）室溫或37℃下保溫過夜，誘使殘存芽孢發(fā)芽；（3）重復(fù)(1)、(2)步驟3次，達(dá)到較低溫度下徹底滅菌目的。例如，培養(yǎng)硫細(xì)菌的含硫培養(yǎng)基用間歇滅菌法滅菌，其內(nèi)所含元素硫在99～100℃的溫度下可保持正常結(jié)晶形，而常規(guī)的加壓滅菌（121℃）后會引起硫熔化。間歇滅菌法的用途：適用于不耐熱培養(yǎng)基的滅菌。（2）加壓法①常規(guī)加壓蒸汽滅菌法（normalautoclaving）

一般稱作“高壓蒸汽滅菌法”。這是一種利用高溫（而非壓力）進(jìn)行濕熱滅菌的方法。高壓蒸汽滅菌法的原理：將待滅菌的物件放置在盛有適量水的專用加壓蒸汽滅菌鍋（或家用壓力鍋）內(nèi)，蓋上鍋蓋，并打開排氣閥，通過加熱煮沸，讓蒸汽驅(qū)盡鍋內(nèi)原有的空氣，然后關(guān)閉鍋蓋上的排氣閥閥門，再繼續(xù)加熱，使鍋內(nèi)蒸汽壓逐漸上升，隨之溫度也相應(yīng)上升到100℃以上。

（1）121℃（壓力為1kg／cm2或15磅／英寸2），15～20min；（2）115℃（0.7kg／cm2或10磅／英寸2），35min。高壓蒸汽滅菌法常用參數(shù)：適合于一切微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)療保健機(jī)構(gòu)或發(fā)酵工廠中對培養(yǎng)基、物料及多種器材的滅菌。高壓蒸汽滅菌法的用途：優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，效果可靠，廣泛使用。高壓蒸汽滅菌法的優(yōu)缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：破壞一些不耐熱的營養(yǎng)成分。②連續(xù)加壓蒸汽滅菌法

（continuousautoclaving）在發(fā)酵行業(yè)里也稱“連消法”。連續(xù)加壓蒸汽滅菌法的原理：將培養(yǎng)基在發(fā)酵罐外連續(xù)不斷地進(jìn)行加熱、維持和冷卻，然后才進(jìn)入無菌的發(fā)酵罐。（1）135～140℃，5～15s，工業(yè)上發(fā)酵培養(yǎng)基（2）135～150℃，2～6s，牛奶或其他液態(tài)食品（超高溫滅菌）高壓蒸汽滅菌法常用參數(shù)：連續(xù)加壓蒸汽滅菌法的用途：此法只在大規(guī)模的發(fā)酵工廠中作培養(yǎng)基滅菌用。連續(xù)加壓蒸汽滅菌法的優(yōu)點(diǎn)：①最大限度減少營養(yǎng)成分的破壞；②滅菌時(shí)間明顯減少，提高了發(fā)酵罐的利用率；③蒸汽負(fù)荷均勻，提高了鍋爐的利用率；④適宜于自動(dòng)化操作；⑤降低了操作人員的勞動(dòng)強(qiáng)度。（二）影響加壓蒸汽滅菌效果的因素1.殺菌物體含菌量2.滅菌鍋內(nèi)空氣排除程度3.滅菌對象的pH4.滅菌對象的體積5.加熱與散熱速度1.殺菌物體含菌量（1）菌的特性：滅菌孢子所需要的時(shí)間＞營養(yǎng)體（2）菌的數(shù)量：物體中含菌量越高，滅菌時(shí)間須越長（3）物體的特性：天然培養(yǎng)基滅菌時(shí)間＞組合培養(yǎng)基2.滅菌鍋內(nèi)空氣排除程度在一切利用加壓蒸汽滅菌法的場合下，必須做到徹底排除滅菌鍋內(nèi)的殘余空氣。

滅菌鍋蒸汽的溫度壓力檢驗(yàn)空氣是否排盡最好的辦法：（1）滅菌鍋上同時(shí)裝有壓力表和溫度計(jì)；（2）將待測氣體通過橡膠管引入深層冷水中，只聽到“撲撲”聲而未見氣泡冒出，證明鍋內(nèi)已是純蒸汽；

（3）滅菌鍋內(nèi)加入耐熱性的芽孢桿菌，滅菌后培養(yǎng)，看其是否生長；

（4）加入適當(dāng)溶點(diǎn)的固體試劑，滅菌后看是否熔化。3.滅菌對象的pH（1）pH6.0～8.0時(shí)，微生物較不易死亡；（2）pH＜6.0時(shí)，最易引起死亡。4.滅菌對象的體積

滅菌對象體積的大小會影響熱的傳導(dǎo)速率。在實(shí)驗(yàn)室工作中，對大容量培養(yǎng)基滅菌時(shí)，必須注意相應(yīng)延長滅菌時(shí)間。5.加熱與散熱速度

根據(jù)季節(jié)的變化或滅菌物件體積的大小，確定相應(yīng)的“上磅”（預(yù)熱速度）或“下磅”（散熱）時(shí)間。（三）高溫對培養(yǎng)基成分的

有害影響及其防止1.有害影響（1）少數(shù)有利影響：長時(shí)間的高溫對培養(yǎng)基中的淀粉成分有促進(jìn)糊化和水解作用。（2）很多不利的影響：沉淀，褐變，改變pH，降低營養(yǎng)濃度等。導(dǎo)致培養(yǎng)基褐變的同時(shí)，還降低了有關(guān)營養(yǎng)物成分！產(chǎn)生褐變的機(jī)制氨基化合物（氨基酸、肽、蛋白質(zhì)）羰基化合物（糖類）梅拉特反應(yīng)（maillardreaction）2.防止法（1）采用特殊加熱滅菌法（2）過濾除菌法（3）其他方法（1）采用特殊加熱滅菌法①分別滅菌②低壓滅菌③間歇滅菌④連續(xù)加壓蒸汽滅菌①分別滅菌含Ca2+或Fe3+的溶液含糖培養(yǎng)基糖液其他成分分別滅菌合并磷酸鹽不易形成磷酸液沉淀分別滅菌合并112℃（0.57kg／cm2或8磅／英寸2）滅菌15min115℃（0.7kg／cm2或10磅／英寸2）滅菌35min②低壓滅菌③間歇滅菌含有在高溫下易破壞成分的培養(yǎng)基（如含糖組合培養(yǎng)基）間歇滅菌低壓滅菌在大規(guī)模發(fā)酵工業(yè)中，可采用連續(xù)加壓滅菌法進(jìn)行培養(yǎng)基的滅菌等。④連續(xù)加壓蒸汽滅菌（2）過濾除菌法

對空氣和培養(yǎng)液中某些不耐熱的成分可采用過濾除菌法“滅菌”。棉花、玻璃纖維或石棉微孔濾膜0.22～0.45m醋酸纖維素、硝酸纖維素核孔濾器各種濾器（filter）例如，濾膜過濾裝置、燒結(jié)玻璃濾板過濾器、石棉板過濾器（seitz

filter）、素?zé)蛇^濾器（chamberlandcandle）、硅藻土過濾器（berkefeldcandle）等。優(yōu)點(diǎn)：操作方法簡便，不破環(huán)物質(zhì)結(jié)構(gòu)。缺點(diǎn)：無法濾除液體中的病毒和噬菌體。（3）其他方法①加入0.01％EDTA（乙二胺四乙酸）或0.01％NTA（氮川三乙酸）等螯合劑到培養(yǎng)基中，可防止金屬離子發(fā)生沉淀；②用氣體滅菌劑如氧化乙烯（環(huán)氧乙烷）等對個(gè)別成分進(jìn)行滅菌處理，再混入已滅過菌的其他培養(yǎng)基成分中。

輻射滅菌（radiationsterilization）是利用電磁輻射產(chǎn)生的電磁波殺死大多數(shù)物質(zhì)上的微生物的一種有效方法。用于滅菌的電磁波Ⅱ輻射作用微波紫外線（UV）X射線射線Ⅲ無菌操作儀器超凈工作臺生物安全柜超凈工作臺生物安全柜Ⅳ高滲、干燥、超聲波等三、化學(xué)殺菌劑、消毒劑和治療劑抗微生物劑非選擇性（對所有細(xì)胞均有毒性）有選擇性（對病原微生物毒性更強(qiáng)）消毒劑（disinfectant）防腐劑（antisepsis）抗代謝藥物抗生素中草藥有效成分（化學(xué)治療劑）評價(jià)藥效和毒性的3種指標(biāo)：②半致死劑量（50％lethaldose，LD50）③最低致死劑量（minimumlethaldose，MLD）①最低抑制濃度（minimuminhibitoryconcentration，MIC）①最低抑制濃度

（minimuminhibitoryconcentration，MIC）

評定某化學(xué)藥物藥效強(qiáng)弱的指標(biāo)，指在一定條件下，某化學(xué)藥劑抑制特定微生物的最低濃度。

評定某藥物毒性強(qiáng)弱的指標(biāo)，指在一定條件下，某化學(xué)藥物能殺死50％試驗(yàn)動(dòng)物時(shí)的劑量。②半致死劑量

（50％lethaldose，LD50）③最低致死劑量

（minimumlethaldose，MLD）

評定某藥物毒性強(qiáng)弱的另一指標(biāo)，指在一定條件下，某化學(xué)藥物能引起試驗(yàn)動(dòng)物群體100％死亡率的最低劑量?；瘜W(xué)物質(zhì)的抗微生物能力的測定液體培養(yǎng)