第六章 發(fā)酵液預處理及固液分離

第六章發(fā)酵液的預處理及固液分離四川理工生藥2011抗生素下游加工的一般過程1、發(fā)酵液的預處理和固液分離2、提取：沉淀、吸附、萃取3、分離（精制：層析、離子交換）4、最后純化（成品加工：濃縮、結(jié)晶、干燥）第一節(jié)發(fā)酵液的性質(zhì)一、抗生素在發(fā)酵液中的存在部位存在部位２.細胞內(nèi)：積累于菌絲體內(nèi)，且水溶性?。ㄉ贁?shù)）１.細胞外：產(chǎn)生后被分泌到細胞外（多數(shù)）胞內(nèi)抗生素：②過濾→濾餅→提?、偌铀?、堿等使其轉(zhuǎn)入細胞外二、抗生素的穩(wěn)定性抗生素需在適宜的溫度、pH值、壓力等條件下才穩(wěn)定。提取、分離等過程應提供適宜的條件。eg.青霉素pH值4.8-5.2，低溫條件下才穩(wěn)定三、發(fā)酵液中的雜質(zhì)較多包括：２.可溶性：Pr.aa.金屬離子等萃取，分離，離子交換１.不溶性：菌絲體、剩余培養(yǎng)基等過濾除去第二節(jié)發(fā)酵液預處理的方法一、發(fā)酵液預處理的目的１、固液分離：分離菌絲體、未用完培養(yǎng)基及其它代謝產(chǎn)物等，盡可能使發(fā)酵產(chǎn)物轉(zhuǎn)入后續(xù)工序處理的相中（多為液相）２、能夠除去部分雜質(zhì)：主要去除蛋白質(zhì)和金屬離子，減少后續(xù)處理的負荷。二、發(fā)酵液預處理的要求1、菌體分離發(fā)酵液中除發(fā)酵產(chǎn)物外，還含有大量的菌體，為方便提取和精制，首先要將菌體與發(fā)酵液分離。為保證離心和過濾順利進行，要正確控制發(fā)酵終點。否則對目標物的回收均不利。２、蛋白質(zhì)的去除發(fā)酵液中去除菌體和固體懸浮物后，一些可溶性蛋白質(zhì)仍留在濾液中，需設法去除。除去蛋白質(zhì)的濾液要保證在一定的pH范圍內(nèi)不發(fā)生混濁，否則影響溶媒提取和離子交換提取。３、重金屬離子的去除重金屬離子的存在，會影響提取和精制，同時會影響發(fā)酵產(chǎn)物的質(zhì)量和回收率，故必須除去。４、色素、熱原質(zhì)、毒性物質(zhì)的去除針對藥用發(fā)酵產(chǎn)品尤為重要。尤其是針劑。５、改變發(fā)酵液性質(zhì)，以利于提取和精制后續(xù)工序的操作順利進行如，當發(fā)酵終了時，發(fā)酵產(chǎn)物可能在發(fā)酵液中，也可以在菌體內(nèi)部或兩相同時存在。常采用調(diào)節(jié)pH、酸性或堿性的方法使發(fā)酵產(chǎn)物轉(zhuǎn)入后續(xù)處理的相中。６、調(diào)整適當pH值和溫度避免引起產(chǎn)物的破壞和損失。多數(shù)抗生素不耐熱，對pH值要求高。三、蛋白質(zhì)的預處理（除雜蛋白）1．等電點沉淀2.變性沉淀3．加各種沉淀劑沉淀4．加入凝聚劑（金屬鹽）5．加入絮凝劑1．等電點沉淀調(diào)Ph到等電點，雜蛋白的凈電荷為零，溶解度最小，沉淀析出。多數(shù)抗生素發(fā)酵液的等電點4.0-5.5之間，一般加酸調(diào)。如：硫酸、鹽酸、磷酸等。2.變性沉淀（凝固）：①加熱，但多數(shù)抗生素不耐熱，只適用于熱穩(wěn)定抗生素。如：灰黃霉素②加酒精、丙酮等有機溶劑或表面活性劑等3．加沉淀劑沉淀：對酸性發(fā)酵液：可加陰離子，如三氯乙酸，鞣酸等對堿性發(fā)酵液：可加陽離子，如Ag+、Cu2+、Zn2+等4．加入凝聚劑（金屬鹽）凝集劑的作用：粒子表面電荷中和；消除粒子表面穩(wěn)定的雙電荷層；使膠體粒子的排斥電位降低而發(fā)生聚沉。金屬鹽特別是重金屬鹽較常用。如，硫酸鋁、三氯化鐵等5．加入絮凝劑絮凝是指某些高分子絮凝劑能在懸浮粒子之間產(chǎn)生橋梁作用，使膠粒形成粗大絮凝團的過程。近年較常用。如，殼聚糖、海藻酸鈉、明膠的等（帶有氨基、羧酸基等，電荷密度高。5．加入絮凝劑絮凝是指某些高分子絮凝劑能在懸浮粒子之間產(chǎn)生橋梁作用，使膠粒形成粗大絮凝團的過程。近年較常用。如，殼聚糖、海藻酸鈉、明膠的等（帶有氨基、羧酸基等，電荷密度高。四、高價金屬離子的去除Ca2+：加入草酸鈉或草酸，生成的草酸鈣沉淀還能促使雜蛋白質(zhì)凝固，提高濾速和濾液質(zhì)量。Mg2+：草酸、磷酸鹽（在堿性條件下，生成磷酸鎂鹽沉淀）、三聚磷酸鈉。Fe3+：加入黃血鹽，形成普魯士藍沉淀。第三節(jié)發(fā)酵液的液固分離

一、固液分離的目的收集胞內(nèi)產(chǎn)物的細胞或菌體，分離除去液相（胞內(nèi)抗生素）收集含生化物質(zhì)的液相，分離除去固體懸浮物如，細胞、菌體、細胞碎片、蛋白質(zhì)的沉淀物和它們的絮凝體等。（胞外抗生素）二、固液分離的要求濾液澄清—便于后續(xù)處理速度快－多數(shù)抗生素不穩(wěn)定三、影響固液分離的因素

１、微生物的種類：①真菌：比較粗大,易過濾分離,通常不需特殊處理②放線菌:細而分枝(1um),較黏,較難.需處理—加助濾劑或蛋白絮凝劑③細菌:體積細小,過濾最難,可考慮離心２、菌體細胞:通常細胞破碎或細胞自溶后粘度增大。因此細胞破碎的程度應控制，發(fā)酵放罐時間要適宜。3、培養(yǎng)基成分：如用黃豆粉、花生粉作氮源，淀粉作碳源，粘度都會升高。固液分離速度通常與粘度成反比，粘度越大，固液分離越困難。四、固液分離常用方法：過濾和離心

過濾：懸浮液通過過濾介質(zhì)時固態(tài)顆粒與溶液分離。分為澄清過濾和濾餅過濾。

離心分離：在離心力場的作用下，將懸浮液中的固相與液相加以分離，多用于顆粒較小的懸浮液和乳濁液的分離。在某一支撐物上放過濾介質(zhì)，注入含固體顆粒的溶液，使液體通過，固體顆粒留下。（一）過濾：過濾介質(zhì)filtermedium:過濾采用的多孔物質(zhì)；濾漿filterpulp:所處理的懸浮液；濾液filtrate:通過多孔通道的液體；濾餅或濾渣filtercake:被截留的固體物質(zhì)。1）常規(guī)過濾：料液流動方向與過濾介質(zhì)垂直。通常適于過濾直徑較大的懸浮粒子。如放線菌、霉菌發(fā)酵液。對細小菌體或黏度較大的發(fā)酵液，需使用助濾劑。2）濾餅過濾：當懸浮液通過濾布時，固體顆粒被濾布阻攔而逐漸形成濾餅（濾渣）。在濾餅過濾中，當濾餅至一定厚度時即起主要的過濾作用適合于固體含量大于0.1%的懸浮液的過濾分離。1、過濾分類3）錯流過濾：又稱切向流過濾（Cross-FlowFiltration）傳統(tǒng)過濾時過濾液體垂直于過濾介質(zhì)，過濾阻力主要來之濾餅。錯流過濾打破了傳統(tǒng)過濾的機制，即液體的流向和濾膜相切。在壓力推動下，懸浮液以高速在管狀濾膜的內(nèi)壁作切向流動，利用流動的剪切作用將過濾介質(zhì)表面的固體（濾餅）移走，而附著在濾膜上的濾餅很薄，因而能在長時間內(nèi)保持穩(wěn)定不變的過濾速度2、過濾介質(zhì)選擇過濾介質(zhì)起過濾作用，還是濾餅的支撐物。應具有足夠的機械強度和盡可能小的流動阻力。合理選擇過濾介質(zhì)：過濾介質(zhì)所能截留的固體粒子大?。和ǔＲ赃^濾介質(zhì)的孔徑表示。常用的過濾介質(zhì)中，纖維濾布所能截留的最小粒子約10μm，硅藻土為lμm，超濾膜可小于0.5μm。發(fā)酵液中懸浮離子的大小過濾介質(zhì)的種類1、織物介質(zhì)2、粒狀介質(zhì)3、多孔固體介質(zhì)4、微孔纖維素薄膜和金屬薄膜介質(zhì)1）織物介質(zhì)又稱濾布，應用最廣泛，包括由棉、麻等天然纖維濾布和合成纖維濾布。其過濾性能受許多因素的影響，其中最重要的是纖維的特性、編織紋法和線型。2）粒狀介質(zhì)有硅藻土、珍珠巖粉、細砂、活性炭、白土等。最常用的是硅藻土，是優(yōu)良的過濾介質(zhì)：①一般不與酸堿反應，化學性能穩(wěn)定；②形狀不規(guī)則，空隙大且多孔，具有很大的吸附表面；③無毒且不可壓縮，形成的過濾層阻力不隨操作壓力變化。3）多孔固體介質(zhì)

如多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料等，可加工成板狀或管狀，孔隙很小且耐腐蝕，常用于過濾含有少量微粒的懸浮液。4）微孔纖維素薄膜和金屬薄膜介質(zhì)典型過濾設備：按操作方式分類：間歇過濾機、連續(xù)過濾機按操作壓強差分類：壓濾、吸濾和離心過濾實驗室用抽濾裝置板框壓濾機（間歇操作）轉(zhuǎn)筒真空過濾機（連續(xù)操作）過濾式離心機3、過濾設備1）實驗室用抽濾裝置2）板框壓濾機

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板框壓濾機的過濾推動力來自泵產(chǎn)生的液壓或進料貯槽中的氣壓。廣泛應用于培養(yǎng)基制備的過濾及霉菌、放線菌、酵母菌和細菌等多種發(fā)酵液的固液分離。適合于固體含量1-10%的懸浮液的分離。33板框壓濾機包括板和框，多做成正方形，角端均開有小孔，裝合壓緊后即構(gòu)成供濾漿或洗水流通的孔道。框的兩側(cè)覆以濾布，空框與濾布圍成了容納濾漿及濾餅的空間，濾板用以支撐濾布并提供濾液流出的通道。優(yōu)點過濾面積大，結(jié)構(gòu)簡單，價格低，動力消耗少，對不同過濾特性的發(fā)酵液適應性強。它最重要的特征是通過過濾介質(zhì)時產(chǎn)生的壓力降可以超過0.1MPa,這是真空過濾器無法達到的。缺點不能連續(xù)操作，設備笨重，勞動強度大，衛(wèi)生條件差，非過濾的輔助時間較長。3）轉(zhuǎn)筒真空過濾機轉(zhuǎn)筒真空過濾機是一種應用較為廣泛的連續(xù)操作過濾設備，其主體是一個能轉(zhuǎn)動的水平圓筒，圓筒表面裝有金屬網(wǎng)，網(wǎng)上覆蓋濾布，圓筒的下端浸入濾漿。優(yōu)點：轉(zhuǎn)筒真空過濾機可吸濾、洗滌、卸餅、再生連續(xù)化操作，生產(chǎn)能力大，勞動強度小缺點：輔助設備多，投資大，且由于真空過濾，推動力?。ú怀^8×104Pa），濾餅濕度大（20％～30％）。主要適用霉菌發(fā)酵液，對菌體細小、黏度大鋪助濾劑。對于濾餅阻力較大的物料適應能力較差。39結(jié)構(gòu)：轉(zhuǎn)鼓濾餅濾布濾網(wǎng)離心過濾機工作原理圖轉(zhuǎn)鼓(上有小孔，亦稱懸框)；濾網(wǎng)；濾布；機架。原理：

由于離心力作用，液體產(chǎn)生徑向壓差，通過濾餅、濾網(wǎng)及濾筐而流出。4）離心過濾機（二）離心分離對于濃度較小，粒徑較大，硬度較強的不溶物，可以采用過濾分離。優(yōu)點：分離速度快，分離效率高、液相澄清度好缺點：與過濾設備相比，設備投資高；能耗大；離心產(chǎn)生的固體濃縮物和過濾產(chǎn)生的濃縮不同。通常情況下離心只能得到一種較為濃縮的懸浮液或漿體。而過濾可獲得的水分含量較低的濾餅。41按速度和離心力：1、常速離心機

最大轉(zhuǎn)速8000rpm(r/min),相對離心力(RCF)104g以下,用于細胞、菌體和培養(yǎng)基殘渣等分離；2、高速（冷凍）離心機

1×104-2.5×104rpm，相對離心力104~105g,用于細胞碎片、較大細胞器、大分子沉淀物等分離；3、超速離心機

轉(zhuǎn)速2.5-8×104rpm，相對離心力5*105g；用于DNA、RNA蛋白質(zhì)、細胞器、病毒分離純化；檢測純度；沉降系數(shù)和相對分子量測定等。離心機的種類與用途按離心機的作用方式：斜角式平拋式管式蝶式螺旋式多室431）斜角式離心機是一類結(jié)構(gòu)最簡單的實驗室常用離心機指離心管腔與轉(zhuǎn)軸成一定傾角的轉(zhuǎn)子；

角度越大，沉降越結(jié)實，分離效果越好，角度越小，顆粒沉降距離短，沉降速度快，但分離效果差2）平拋式離心機平拋式離心機一類結(jié)構(gòu)簡單的實驗室常用的低中速離心機，轉(zhuǎn)速一般在3000-6000rpm。轉(zhuǎn)子活動管套內(nèi)的離心管，靜止時垂直掛在轉(zhuǎn)頭上，旋轉(zhuǎn)時隨著轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)動，從垂直懸吊上升到水平位置（約200—800rpm）。顆粒在水平轉(zhuǎn)子中的沉降是沿管子軸向移動。樣品便于收集，受振