第3節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用

第三節(jié)

細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用一、植物細(xì)胞培養(yǎng)與次生代謝產(chǎn)物制備植物細(xì)胞培養(yǎng)定義：

指在離體條件下，將愈傷組織等置于液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，得到分散游離的懸浮細(xì)胞，通過(guò)繼代培養(yǎng)使細(xì)胞增殖，從而獲得大量細(xì)胞群體的一種技術(shù)。（一）大規(guī)模植物細(xì)胞培養(yǎng)1.單細(xì)胞制備方法

（1）機(jī)械法：（2）酶解法：（3）愈傷組織誘導(dǎo)法：高頻振蕩使愈傷組織分散成單個(gè)細(xì)胞（二）大規(guī)模植物細(xì)胞培養(yǎng)1.懸浮培養(yǎng)

將細(xì)胞接種于液體培養(yǎng)基中并保持良好的分散狀態(tài).特點(diǎn):與培養(yǎng)液充分接觸,促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)吸收和氣體供應(yīng);細(xì)胞增殖快,獲得高濃度細(xì)胞.（二）大規(guī)模植物細(xì)胞培養(yǎng)2.固定化培養(yǎng)

將游離細(xì)胞包埋在支持物內(nèi)部或表面進(jìn)行培養(yǎng)的一種方法.特點(diǎn):維持細(xì)胞良好的穩(wěn)定性。方法：

吸附固定法、離子/共價(jià)交聯(lián)法、共價(jià)結(jié)合法、包埋法、微囊化等。3.大規(guī)模植物細(xì)胞的生物反應(yīng)器（1-1）機(jī)械攪拌式反應(yīng)器優(yōu)點(diǎn)：混合性能好傳氧效率高操作彈性大可用于細(xì)胞高密度培養(yǎng)；缺點(diǎn)：剪切力大。（1-1）機(jī)械攪拌式反應(yīng)器攪拌式反應(yīng)器結(jié)構(gòu)示意圖1—攪拌器；2—罐體；3—夾套；4—攪拌軸；5—壓出管；6—支座；7—人孔；8—軸封；9—傳動(dòng)裝置

典型的攪拌結(jié)構(gòu)（1-2）非機(jī)械攪拌式反應(yīng)器

非攪拌式反應(yīng)器所產(chǎn)生的剪切力較小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單。其主要類型有鼓泡式反應(yīng)器、氣升式反應(yīng)器等氣體攪拌式反應(yīng)器氣升式反應(yīng)器鼓泡式反應(yīng)器1—分布格板；2—夾套；3—?dú)怏w分布器；4—塔體；5—擋板；6—塔外換熱器；7—液體捕集器；8—擴(kuò)大段（1-3）組合式反應(yīng)器利用“優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)”原則，將兩種反應(yīng)器結(jié)合起來(lái)研究出組合式反應(yīng)器。帶有低速攪拌的氣升式發(fā)酵罐可彌補(bǔ)低氣速時(shí)混合性差的弱點(diǎn)。（1-4）光生物反應(yīng)器（1-5）轉(zhuǎn)鼓式生物反應(yīng)器（2-1）固定化培養(yǎng)的生物反應(yīng)器——流化床兩類:液-固兩相氣-液-固三相優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞與流體能充分混合、接觸。不足：細(xì)胞與流體碰撞易傷細(xì)胞（2-2）固定化培養(yǎng)生物反應(yīng)器——固定化床固定床生物反應(yīng)器兩類:填充床反應(yīng)器涓流床反應(yīng)器（三）植物細(xì)胞培養(yǎng)制備代謝產(chǎn)物

細(xì)胞代謝產(chǎn)物包括初級(jí)代謝產(chǎn)物與次級(jí)代謝產(chǎn)物.1.初級(jí)代謝產(chǎn)物：

通過(guò)初級(jí)代謝產(chǎn)生的維持細(xì)胞生命活動(dòng)必需的物質(zhì)。如：AA、核苷酸、多糖、維生素等。2.次級(jí)代謝產(chǎn)物：

通過(guò)次級(jí)代謝合成的分子結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的小分子化合物。如：抗生素、生物堿、毒素等。（三）植物細(xì)胞培養(yǎng)制備代謝產(chǎn)物次級(jí)代謝產(chǎn)物的利用：

（1）藥用：如紫杉醇、生物堿類、萜類等（2）食品、食品添加劑：如胡蘿卜素、甜菊苷、辣椒素等。（3）殺蟲劑、殺菌劑：如萬(wàn)壽菊細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物農(nóng)藥噻吩烷、葫蘆巴培養(yǎng)產(chǎn)物藍(lán)魚藤酮等。（4）飼料、精細(xì)化工產(chǎn)品：（四）生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的細(xì)胞株要求分散好,適合于大規(guī)模懸浮培養(yǎng);均一性好,大小與生理狀況一致;生長(zhǎng)快;目標(biāo)產(chǎn)物含量高;細(xì)胞遺傳性能穩(wěn)定.二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)與表達(dá)制備藥用蛋白

1962年開始，用于生物醫(yī)學(xué)研究，生產(chǎn)酶制劑，生長(zhǎng)因子，疫苗，單抗等。如：纖溶酶原激活劑（t-PA）、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）、乙肝疫苗（HbsAg）、干擾素（IFN）、白介素（IL）等（一）病毒疫苗生產(chǎn)：Vero細(xì)胞培養(yǎng)DMEM培養(yǎng)基胎牛血清其他成分錐形瓶逐級(jí)放大培養(yǎng)加堿（碳酸氫鈉）加糖（葡萄糖）灌注培養(yǎng)液微載體5L種子罐培養(yǎng)培養(yǎng)液50L生物反應(yīng)器接種狂犬病毒出液口收獲病毒（二）基因工程藥物生產(chǎn)——重組干擾素（IFN）定義：

由病毒或誘生劑刺激機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生的具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的糖蛋白。

種類：

IFN-α——白細(xì)胞產(chǎn)生；IFN-β——成纖維細(xì)胞產(chǎn)生；IFN-γ——致敏T細(xì)胞產(chǎn)生干擾素作用機(jī)制干擾素的生產(chǎn)：傳統(tǒng)方法：從人血液中的白細(xì)胞內(nèi)提取每300L血液才能提取1mg

基因工程：將干擾素基因轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中。每千克培養(yǎng)液可提取20-40mg。我國(guó)的基因工程重組IFN有:

α1b(如賽若金:科興\軍事預(yù)防科學(xué)院等)α2b(如安達(dá)芬:長(zhǎng)春生物等)細(xì)胞IFN誘生劑產(chǎn)生特異性因子，使阻抑蛋白滅活干擾素基因解除抑制IFN基因活化產(chǎn)生干擾素體內(nèi)干擾素產(chǎn)生機(jī)制:重組干擾素生產(chǎn)機(jī)制干擾素生產(chǎn)車間實(shí)例：（1）過(guò)程1表示可以通過(guò)人工合成方法獲得干擾素基因。其主要步驟可概括為：由干擾素中_______順序推導(dǎo)出__________順序，再進(jìn)一步推導(dǎo)出_______順序。人工合成的干擾素基因在實(shí)驗(yàn)室可通過(guò)_____技術(shù)進(jìn)行人工擴(kuò)增。氨基酸mRNA的堿基基因的堿基PCR實(shí)例：（2）過(guò)程2需要的工具酶有__________________。（3）欲將大腸桿菌b篩選出來(lái)，應(yīng)利用基因表達(dá)載體（重組DNA分子）上的_____。（4）干擾素不能在高溫環(huán)境中保存，其原因是_____________________________。限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶標(biāo)記基因干擾素是蛋白質(zhì)，高溫下會(huì)變性（三）單克隆抗體生產(chǎn)1.何謂單克隆抗體？

通過(guò)B細(xì)胞雜交瘤技術(shù),獲得特異性針對(duì)某一種抗原決定簇的細(xì)胞克隆，產(chǎn)生均一性的抗體.

單克隆抗體技術(shù)的核心是用骨髓瘤細(xì)胞(myelomacell)與經(jīng)特定抗源免疫刺激的B淋巴細(xì)胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合得到雜交瘤細(xì)胞(hybridomacell)，雜交瘤細(xì)胞既能象骨髓瘤細(xì)胞那樣在體外無(wú)限增殖，又具有B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。因此，單克隆抗體技術(shù)又稱為雜交瘤技術(shù)(hybridomatechnology）。2.雜交瘤技術(shù)的基本原理2.雜交瘤技術(shù)的基本原理實(shí)例：下圖為某同學(xué)根據(jù)雜交瘤技術(shù)的方法，設(shè)計(jì)的生產(chǎn)破傷風(fēng)桿菌抗體的實(shí)驗(yàn)方案。請(qǐng)據(jù)圖回答：

（1）該方案能達(dá)到預(yù)期效果嗎？

。原因是沒有將抗原注入小鼠體內(nèi)，無(wú)法獲得產(chǎn)生單一抗體的效應(yīng)B細(xì)胞

不能（2）圖中②為

過(guò)程，常用

作為誘導(dǎo)劑。該細(xì)胞繼承了

，因此不僅能

，還有

本領(lǐng)。（3）圖中③進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，目的是

。

細(xì)胞融合和篩選滅活的病毒雙親細(xì)胞的遺傳物質(zhì)大量繁殖產(chǎn)生特異性抗體在體外條件下大量增殖（4）在制備破傷風(fēng)桿菌抗體的過(guò)程中，進(jìn)行了兩次篩選，其目的不同，②是通過(guò)篩選獲得

，④是通過(guò)篩選獲得

。（5）圖中⑤的培養(yǎng)能獲得

細(xì)胞，便于大規(guī)模培養(yǎng)。雜交瘤細(xì)胞能產(chǎn)生特定