第17章 高效毛細管電泳

第十七章高效毛細管電泳分析法高效毛細管電泳（highperformancecapillaryelectrophoresis，HPCE）是近年來發(fā)展起來的一種高效、快速的分離分析技術，是經典電泳技術和現(xiàn)代微柱分離相結合的產物。HPCE已成為一種重要的分離分析方法，在生物、醫(yī)藥、化工、環(huán)保、食品等領域具有廣闊的應用前景。總的說來，HPCE具有如下優(yōu)點：1.高靈敏度采用電化學檢測器，最低檢測限可達10-19mol；2.高效HPCE每米理論塔板數(shù)為幾十萬，高者可達幾百萬甚至幾千萬；3.高速通常的分析時間不超過30min。有1.7min內分離19種陽離子及3min內分離30種陰離子的報道；4.樣品用量少只需nL（109L）級；5.低消耗每次分析只需少量（幾毫升）流動相，分析過程是在價格低廉的毛細管柱中進行；6.應用范圍廣從簡單的無機離子、有機離子到整個細胞，都可進行分離分析。具有“萬能”分析功能或潛力；一、基本裝置與原理HPCE是以高壓電場為驅動力，以毛細管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和（或）分配系數(shù)的不同而進行分離的一類新型液相分離技術。毛細管電泳一般由一個高壓電源，一根毛細管，一個檢測器及兩個緩沖液貯液槽及數(shù)據(jù)記錄系統(tǒng)組成，其儀器結構示意圖如圖

1234655圖1毛細管電泳裝置示意圖1．高壓電源2．檢測器3．液冷溫控毛細管4．數(shù)據(jù)記錄系統(tǒng)5．緩沖液槽6．緩沖液1.基本裝置HPCE的儀器結構比HPLC儀簡單，有高壓直流電源，進樣裝置，毛細管和檢測器。前三個部件均易實現(xiàn)，但由于HPCE采用了極小內徑的毛細管，進樣量很小，因此只有具有高靈敏度的檢測器，才能進行定性、定量分析。檢測器是HPCE儀的關鍵部件。

HPCE檢測器中應用較廣泛的是紫外-可見檢測器和電化學檢測器。迄今為止，除了原子吸收光譜、電感耦合等離子體發(fā)射光譜（ICP）及紅外光譜未用于HPCE外，熒光、電化學、質譜、激光類和其他類型檢測器（如折射率檢測器、同位素檢測器等）均已應用。目前應用較多并且已經商品化的是光學檢測器（紫外檢測器和熒光檢測器）和電化學檢測器（電導和安培）。電化學檢測器由于其靈敏度高、價廉、應用范圍廣，應用比較多。HPCE-MS聯(lián)用提供了一種分離和鑒定相結合的強有力的技術，將成為最有發(fā)展前途的技術之一。

2．基本原理在電解質溶液中，帶電粒子在電場作用下，以不同速度向其所帶電荷相反方向遷移的現(xiàn)象稱為電泳。電滲流（electroosmoticflow，EOF）是指管內溶液在外力電場作用下整體向一個方向運動的現(xiàn)象。HPCE通常采用的是石英毛細管柱，一般情況下（pH＞3），硅醇基（—SiOH）電離為硅氧基負離子（—SiO），使管壁表面帶負電，為了保持電荷平衡，溶液中水合離子（一般為陽離子）被吸附到表面附近，形成雙電層。當在毛細管兩端加高電壓時，雙電層中的陽離子向陰極移動，由于離子是溶劑化的，所以帶動了毛細管中溶液整體向陰極移動，產生電滲流。在不少情況下，電滲流的速度是電泳流速度的5～7倍。溶液中同時存在泳流和滲流，在不考慮相互作用的前提下，粒子在毛細管內電解質中的運動速度應當是電泳流速度（）和電滲流速度（）的矢量和，即

式中，E為電場強度，μ為淌度。正離子的運動方向和電滲流一致，因此最先流出；中性粒子的電泳流速度為“零”，其移動速度相當于電滲流速度；而負離子的運動方向和電滲流方向相反，但因電滲流速度一般都大于電泳流速度，故它將在中性粒子之后流出，各種粒子的分離情況見圖

+-------------------------------------------圖2毛細管分離示意圖在HPCE中電滲流的一個重要特點是具有平面流型，電滲的驅動力沿毛細管均勻分布，它使整個流體象一個塞子一樣以均勻的速度向前運動。而在HPLC中流體流型則是拋物線型的層流，其中心處速度是平均速度的2倍。電滲流的平面流型和HPLC中高壓泵驅動所產生的拋物線型層流的速度曲線不同，不會直接引起樣品組分區(qū)帶在柱內擴張，這是HPCE獲得高效分離的重要原因之一。HPCE是指所有在極細毛細管內進行的電泳新技術，它根據(jù)分離機理不同，具有多種分離模式，能夠提供多方面的信息。HPCE常用的分離模式包括：

二、常用分離模式又稱自由溶液毛細管電泳，是毛細管電泳中最基本、應用最廣泛的一種分離模式。在毛細管中僅填充緩沖溶液，基于溶質組分的遷移時間或淌度的不同而分離。前述基本原理即為CZE的基本原理。

1．毛細管區(qū)帶電泳（capillaryzoneelectrophoresis；CZE）

CZE的特點是操作簡便、快速、分離效率高、應用范圍廣，從理論上講適用于分離所有具有不同淌度的荷電粒子，分子量范圍從十幾的小分子離子到幾十萬的生物大分子。

膠束電動毛細管色譜又稱電動色譜（EKC），是電泳技術和色譜技術巧妙結合的分離新技術，既能分離離子型物質，又可分離中性物質。

2．膠束電動毛細管色譜（micellarelectrokineticcapillarychromatography；MECC）

MECC是在電泳分離緩沖溶液中加入離子型表面活性劑并形成膠束，使電中性物質能根據(jù)其在膠束相和緩沖溶液相中的分配系數(shù)不同而進行分離。MECC的分離原理包括膠束增溶和電遷移兩個過程。其分離介質包括兩相，一相是帶電的膠束（不固定于柱的準固定相），它具有與周圍緩沖溶液（流動相）不同的電泳速度，并且與被分離溶質相互作用（膠束增溶過程）；另一相是緩沖溶液相，在電場作用下，以電滲流的方式整體向陰極流動（電遷移過程）。例如，在緩沖溶液中加入十二烷基硫酸鈉形成膠束，因其表面帶負電，電泳方向與電滲相反，向陽極泳動。在緩沖溶液pH＞5時，電滲流速度大于膠束電泳速度，所以膠束的實際移動方向和電滲流方向相同，都向陰極移動。電中性溶質基于色譜分配原理，在高壓電場作用下移動的緩沖溶液相和膠束相之間進行分配，疏水性較強的溶質在膠束中的分配系數(shù)大，進入膠束中的溶質較多且較穩(wěn)定，相對于疏水性較弱的溶質遷移慢。因此，中性溶質按其疏水性不同，在兩相間的分配系數(shù)不同而得到分離。圖為MECC的分離原理示意圖。

○表示載體，表示溶質，→表示載體的電泳遷移，大空心箭頭表示電滲流+）（圖3電動色譜原理圖CGE是80年代后期發(fā)展起來的毛細管電泳的主要分離模式之一，它將凝膠電泳對生物大分子的高效分離能力和毛細管電泳的快速、微量和定量分析相結合，成為當今分離度極高的一種電泳分離技術。

3．毛細管凝膠電泳（capillarygelelectrophoresis，CGE）

在CGE中，溶質的分離依賴于溶質的凈電荷性質和分子大小兩個因素。在毛細管中裝入凝膠作支持物進行的電泳。凝膠具有多孔性的網(wǎng)絡結構，對溶質具有分子篩的作用。當帶電溶質在電場作用下通過凝膠的網(wǎng)絡結構時，將會對不同大小的溶質分子產生不同的阻力，使溶質按分子大小逐一分離。尤其對那些荷質比不隨分子大小而變的大分子如DNA等，沒有凝膠的篩分作用就不能分離。而且凝膠的粘度大，可減少溶質的擴散，使被分離組分峰形尖銳，能達到CE中最高的柱效。

CGE的關鍵是毛細管凝膠柱的制備，常用聚丙烯酰胺在毛細管內交聯(lián)制成凝膠柱，可分離分析蛋白質和DNA的分子量或堿基數(shù)，但制備麻煩，使用壽命短。若采用粘度低的線性聚合物，如甲基纖維素代替聚丙烯酰胺，可形成無凝膠但有篩分作用的無膠篩分（nongelsieving）介質?？杀苊饪张菪纬?，比凝膠柱制備簡單，壽命長，但分離效能較凝膠柱略差。

CGE在分子生物學和蛋白質化學上有著十分廣闊的應用。在分子生物學上實現(xiàn)了包括寡聚核苷酸純化、DNA測序和PCR產物的分析，在蛋白質化學方面用于多肽和蛋白質分子的分子量測定，原蛋白和結合蛋白的分離等。此外，CGE還可用于其它帶電物質的分離，并可通過加入手性試劑、離子對試劑、絡合試劑等添加劑改變分離的選擇性。

CIEF即是在毛細管里進行的等電聚焦過程。由于毛細管本身的抗對流性質，CIEF可在自由溶液中進行，也可在凝膠中進行。CIEF集傳統(tǒng)等電聚焦和毛細管電泳高效、快速、微量及柱上檢測等的優(yōu)點，在蛋白質、多肽的分離分析上有很好的應用前景。

4．毛細管等電聚焦（capillaryisoelectricfocusing；CIEF）

CIEF是根據(jù)蛋白質的等電點（pI）不同而進行分離的?；驹硎腔趦尚噪娊橘|在分離介質中的遷移造成的pH梯度，由此可以使蛋白質根據(jù)它們不同的等電點達到分離。采用兩性電解質混合物作為載體電解質，當在毛細管兩端加電壓時，pI大于兩性電解質混合物pH值的兩性電解質帶正電，向負極移動；pI小于兩性電解質混合物pH值的兩性電解質帶負電，向正極移動；當它們移至pH=pI值區(qū)帶時，凈電荷為零，不再移動。因此不同等電點的兩性電解質在電場中從陽極到陰極按pI值逐漸增加排序，形成穩(wěn)定的pH梯度，梯度中每一處的pH，取決于該處兩性電解質的pI值。同理，具有一定等電點的蛋白質順著這一梯度遷移到相當于其等電點的那個位置，并在此停下，產生非常窄的聚焦帶，并使不同等電點的蛋白聚焦在不同位置上。CIEF有極高的分辨率，通?？梢苑蛛x等電點差異小于0