第17章 高效毛細(xì)管電泳

第十七章高效毛細(xì)管電泳分析法高效毛細(xì)管電泳（highperformancecapillaryelectrophoresis，HPCE）是近年來發(fā)展起來的一種高效、快速的分離分析技術(shù)，是經(jīng)典電泳技術(shù)和現(xiàn)代微柱分離相結(jié)合的產(chǎn)物。HPCE已成為一種重要的分離分析方法，在生物、醫(yī)藥、化工、環(huán)保、食品等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景?？偟恼f來，HPCE具有如下優(yōu)點(diǎn)：1.高靈敏度采用電化學(xué)檢測(cè)器，最低檢測(cè)限可達(dá)10-19mol；2.高效HPCE每米理論塔板數(shù)為幾十萬，高者可達(dá)幾百萬甚至幾千萬；3.高速通常的分析時(shí)間不超過30min。有1.7min內(nèi)分離19種陽(yáng)離子及3min內(nèi)分離30種陰離子的報(bào)道；4.樣品用量少只需nL（109L）級(jí)；5.低消耗每次分析只需少量（幾毫升）流動(dòng)相，分析過程是在價(jià)格低廉的毛細(xì)管柱中進(jìn)行；6.應(yīng)用范圍廣從簡(jiǎn)單的無機(jī)離子、有機(jī)離子到整個(gè)細(xì)胞，都可進(jìn)行分離分析。具有“萬能”分析功能或潛力；一、基本裝置與原理HPCE是以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和（或）分配系數(shù)的不同而進(jìn)行分離的一類新型液相分離技術(shù)。毛細(xì)管電泳一般由一個(gè)高壓電源，一根毛細(xì)管，一個(gè)檢測(cè)器及兩個(gè)緩沖液貯液槽及數(shù)據(jù)記錄系統(tǒng)組成，其儀器結(jié)構(gòu)示意圖如圖

1234655圖1毛細(xì)管電泳裝置示意圖1．高壓電源2．檢測(cè)器3．液冷溫控毛細(xì)管4．?dāng)?shù)據(jù)記錄系統(tǒng)5．緩沖液槽6．緩沖液1.基本裝置HPCE的儀器結(jié)構(gòu)比HPLC儀簡(jiǎn)單，有高壓直流電源，進(jìn)樣裝置，毛細(xì)管和檢測(cè)器。前三個(gè)部件均易實(shí)現(xiàn)，但由于HPCE采用了極小內(nèi)徑的毛細(xì)管，進(jìn)樣量很小，因此只有具有高靈敏度的檢測(cè)器，才能進(jìn)行定性、定量分析。檢測(cè)器是HPCE儀的關(guān)鍵部件。

HPCE檢測(cè)器中應(yīng)用較廣泛的是紫外-可見檢測(cè)器和電化學(xué)檢測(cè)器。迄今為止，除了原子吸收光譜、電感耦合等離子體發(fā)射光譜（ICP）及紅外光譜未用于HPCE外，熒光、電化學(xué)、質(zhì)譜、激光類和其他類型檢測(cè)器（如折射率檢測(cè)器、同位素檢測(cè)器等）均已應(yīng)用。目前應(yīng)用較多并且已經(jīng)商品化的是光學(xué)檢測(cè)器（紫外檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器）和電化學(xué)檢測(cè)器（電導(dǎo)和安培）。電化學(xué)檢測(cè)器由于其靈敏度高、價(jià)廉、應(yīng)用范圍廣，應(yīng)用比較多。HPCE-MS聯(lián)用提供了一種分離和鑒定相結(jié)合的強(qiáng)有力的技術(shù)，將成為最有發(fā)展前途的技術(shù)之一。

2．基本原理在電解質(zhì)溶液中，帶電粒子在電場(chǎng)作用下，以不同速度向其所帶電荷相反方向遷移的現(xiàn)象稱為電泳。電滲流（electroosmoticflow，EOF）是指管內(nèi)溶液在外力電場(chǎng)作用下整體向一個(gè)方向運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象。HPCE通常采用的是石英毛細(xì)管柱，一般情況下（pH＞3），硅醇基（—SiOH）電離為硅氧基負(fù)離子（—SiO），使管壁表面帶負(fù)電，為了保持電荷平衡，溶液中水合離子（一般為陽(yáng)離子）被吸附到表面附近，形成雙電層。當(dāng)在毛細(xì)管兩端加高電壓時(shí)，雙電層中的陽(yáng)離子向陰極移動(dòng)，由于離子是溶劑化的，所以帶動(dòng)了毛細(xì)管中溶液整體向陰極移動(dòng)，產(chǎn)生電滲流。在不少情況下，電滲流的速度是電泳流速度的5～7倍。溶液中同時(shí)存在泳流和滲流，在不考慮相互作用的前提下，粒子在毛細(xì)管內(nèi)電解質(zhì)中的運(yùn)動(dòng)速度應(yīng)當(dāng)是電泳流速度（）和電滲流速度（）的矢量和，即

式中，E為電場(chǎng)強(qiáng)度，μ為淌度。正離子的運(yùn)動(dòng)方向和電滲流一致，因此最先流出；中性粒子的電泳流速度為“零”，其移動(dòng)速度相當(dāng)于電滲流速度；而負(fù)離子的運(yùn)動(dòng)方向和電滲流方向相反，但因電滲流速度一般都大于電泳流速度，故它將在中性粒子之后流出，各種粒子的分離情況見圖

+-------------------------------------------圖2毛細(xì)管分離示意圖在HPCE中電滲流的一個(gè)重要特點(diǎn)是具有平面流型，電滲的驅(qū)動(dòng)力沿毛細(xì)管均勻分布，它使整個(gè)流體象一個(gè)塞子一樣以均勻的速度向前運(yùn)動(dòng)。而在HPLC中流體流型則是拋物線型的層流，其中心處速度是平均速度的2倍。電滲流的平面流型和HPLC中高壓泵驅(qū)動(dòng)所產(chǎn)生的拋物線型層流的速度曲線不同，不會(huì)直接引起樣品組分區(qū)帶在柱內(nèi)擴(kuò)張，這是HPCE獲得高效分離的重要原因之一。HPCE是指所有在極細(xì)毛細(xì)管內(nèi)進(jìn)行的電泳新技術(shù)，它根據(jù)分離機(jī)理不同，具有多種分離模式，能夠提供多方面的信息。HPCE常用的分離模式包括：

二、常用分離模式又稱自由溶液毛細(xì)管電泳，是毛細(xì)管電泳中最基本、應(yīng)用最廣泛的一種分離模式。在毛細(xì)管中僅填充緩沖溶液，基于溶質(zhì)組分的遷移時(shí)間或淌度的不同而分離。前述基本原理即為CZE的基本原理。

1．毛細(xì)管區(qū)帶電泳（capillaryzoneelectrophoresis；CZE）

CZE的特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、快速、分離效率高、應(yīng)用范圍廣，從理論上講適用于分離所有具有不同淌度的荷電粒子，分子量范圍從十幾的小分子離子到幾十萬的生物大分子。

膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜又稱電動(dòng)色譜（EKC），是電泳技術(shù)和色譜技術(shù)巧妙結(jié)合的分離新技術(shù)，既能分離離子型物質(zhì)，又可分離中性物質(zhì)。

2．膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（micellarelectrokineticcapillarychromatography；MECC）

MECC是在電泳分離緩沖溶液中加入離子型表面活性劑并形成膠束，使電中性物質(zhì)能根據(jù)其在膠束相和緩沖溶液相中的分配系數(shù)不同而進(jìn)行分離。MECC的分離原理包括膠束增溶和電遷移兩個(gè)過程。其分離介質(zhì)包括兩相，一相是帶電的膠束（不固定于柱的準(zhǔn)固定相），它具有與周圍緩沖溶液（流動(dòng)相）不同的電泳速度，并且與被分離溶質(zhì)相互作用（膠束增溶過程）；另一相是緩沖溶液相，在電場(chǎng)作用下，以電滲流的方式整體向陰極流動(dòng)（電遷移過程）。例如，在緩沖溶液中加入十二烷基硫酸鈉形成膠束，因其表面帶負(fù)電，電泳方向與電滲相反，向陽(yáng)極泳動(dòng)。在緩沖溶液pH＞5時(shí)，電滲流速度大于膠束電泳速度，所以膠束的實(shí)際移動(dòng)方向和電滲流方向相同，都向陰極移動(dòng)。電中性溶質(zhì)基于色譜分配原理，在高壓電場(chǎng)作用下移動(dòng)的緩沖溶液相和膠束相之間進(jìn)行分配，疏水性較強(qiáng)的溶質(zhì)在膠束中的分配系數(shù)大，進(jìn)入膠束中的溶質(zhì)較多且較穩(wěn)定，相對(duì)于疏水性較弱的溶質(zhì)遷移慢。因此，中性溶質(zhì)按其疏水性不同，在兩相間的分配系數(shù)不同而得到分離。圖為MECC的分離原理示意圖。

○表示載體，表示溶質(zhì)，→表示載體的電泳遷移，大空心箭頭表示電滲流+）（圖3電動(dòng)色譜原理圖CGE是80年代后期發(fā)展起來的毛細(xì)管電泳的主要分離模式之一，它將凝膠電泳對(duì)生物大分子的高效分離能力和毛細(xì)管電泳的快速、微量和定量分析相結(jié)合，成為當(dāng)今分離度極高的一種電泳分離技術(shù)。

3．毛細(xì)管凝膠電泳（capillarygelelectrophoresis，CGE）

在CGE中，溶質(zhì)的分離依賴于溶質(zhì)的凈電荷性質(zhì)和分子大小兩個(gè)因素。在毛細(xì)管中裝入凝膠作支持物進(jìn)行的電泳。凝膠具有多孔性的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，對(duì)溶質(zhì)具有分子篩的作用。當(dāng)帶電溶質(zhì)在電場(chǎng)作用下通過凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)時(shí)，將會(huì)對(duì)不同大小的溶質(zhì)分子產(chǎn)生不同的阻力，使溶質(zhì)按分子大小逐一分離。尤其對(duì)那些荷質(zhì)比不隨分子大小而變的大分子如DNA等，沒有凝膠的篩分作用就不能分離。而且凝膠的粘度大，可減少溶質(zhì)的擴(kuò)散，使被分離組分峰形尖銳，能達(dá)到CE中最高的柱效。

CGE的關(guān)鍵是毛細(xì)管凝膠柱的制備，常用聚丙烯酰胺在毛細(xì)管內(nèi)交聯(lián)制成凝膠柱，可分離分析蛋白質(zhì)和DNA的分子量或堿基數(shù)，但制備麻煩，使用壽命短。若采用粘度低的線性聚合物，如甲基纖維素代替聚丙烯酰胺，可形成無凝膠但有篩分作用的無膠篩分（nongelsieving）介質(zhì)?？杀苊饪张菪纬桑饶z柱制備簡(jiǎn)單，壽命長(zhǎng)，但分離效能較凝膠柱略差。

CGE在分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)化學(xué)上有著十分廣闊的應(yīng)用。在分子生物學(xué)上實(shí)現(xiàn)了包括寡聚核苷酸純化、DNA測(cè)序和PCR產(chǎn)物的分析，在蛋白質(zhì)化學(xué)方面用于多肽和蛋白質(zhì)分子的分子量測(cè)定，原蛋白和結(jié)合蛋白的分離等。此外，CGE還可用于其它帶電物質(zhì)的分離，并可通過加入手性試劑、離子對(duì)試劑、絡(luò)合試劑等添加劑改變分離的選擇性。

CIEF即是在毛細(xì)管里進(jìn)行的等電聚焦過程。由于毛細(xì)管本身的抗對(duì)流性質(zhì)，CIEF可在自由溶液中進(jìn)行，也可在凝膠中進(jìn)行。CIEF集傳統(tǒng)等電聚焦和毛細(xì)管電泳高效、快速、微量及柱上檢測(cè)等的優(yōu)點(diǎn)，在蛋白質(zhì)、多肽的分離分析上有很好的應(yīng)用前景。

4．毛細(xì)管等電聚焦（capillaryisoelectricfocusing；CIEF）

CIEF是根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）不同而進(jìn)行分離的?；驹硎腔趦尚噪娊橘|(zhì)在分離介質(zhì)中的遷移造成的pH梯度，由此可以使蛋白質(zhì)根據(jù)它們不同的等電點(diǎn)達(dá)到分離。采用兩性電解質(zhì)混合物作為載體電解質(zhì)，當(dāng)在毛細(xì)管兩端加電壓時(shí)，pI大于兩性電解質(zhì)混合物pH值的兩性電解質(zhì)帶正電，向負(fù)極移動(dòng)；pI小于兩性電解質(zhì)混合物pH值的兩性電解質(zhì)帶負(fù)電，向正極移動(dòng)；當(dāng)它們移至pH=pI值區(qū)帶時(shí)，凈電荷為零，不再移動(dòng)。因此不同等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)在電場(chǎng)中從陽(yáng)極到陰極按pI值逐漸增加排序，形成穩(wěn)定的pH梯度，梯度中每一處的pH，取決于該處兩性電解質(zhì)的pI值。同理，具有一定等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)順著這一梯度遷移到相當(dāng)于其等電點(diǎn)的那個(gè)位置，并在此停下，產(chǎn)生非常窄的聚焦帶，并使不同等電點(diǎn)的蛋白聚焦在不同位置上。CIEF有極高的分辨率，通?？梢苑蛛x等電點(diǎn)差異小于0