第四章定量分析與分析方法驗(yàn)證

第四章藥物定量分析與分析方法驗(yàn)證

第一節(jié)

定量分析樣品的前處理方法

一、概述

1.為什么要對(duì)定量分析的樣品進(jìn)行前處理？

含鹵素有機(jī)藥物R-X（F，Cl,Br,I）金屬有機(jī)藥物R-O-Me（有機(jī)酸或酚的含金屬有機(jī)藥物金屬鹽；結(jié)合不牢固）

有機(jī)金屬藥物R-Me

（結(jié)合牢固）

2.常用的處理方法不經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法藥物分析中常用的分析方法經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法含鹵素有機(jī)藥物

含鹵素有機(jī)藥物系指藥物分子結(jié)構(gòu)中所含鹵素直接與芳環(huán)或脂肪鏈相連者，而不包括某些有機(jī)藥物的鹵酸鹽或氫鹵酸鹽結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：C—X（一）鹵原子的活潑性1.鹵原子與碳原子直接相連，鹵原子的活潑性和它直接相連的烴基的結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系（1）乙烯型鹵和芳鹵不活潑（2）烯丙型鹵和芐鹵活潑（3）鹵代烷型介于兩者之間2.分子中所含鹵原子的個(gè)數(shù)

分子中所含鹵原子的個(gè)數(shù)越多，活潑性越強(qiáng)，特別是同一碳上含多個(gè)鹵原子或一個(gè)苯環(huán)上含多個(gè)鹵原子時(shí)，活潑性增強(qiáng)更加明顯3.鹵素的種類I＞Br＞Cl＞F常見(jiàn)的含鹵素有機(jī)藥物三氯叔丁醇六氯對(duì)二甲苯泛影酸膽影酸碘他拉酸碘番酸碘苯酯I鹽酸胺碘酮諾氟沙星醋酸氟輕松磺溴酞鈉含金屬有機(jī)藥物的分析

含金屬的有機(jī)藥物：金屬原子不與碳原子直接相連，通常為有機(jī)酸及酚的金屬鹽或配位化合物如酒石酸銻鉀、葡萄糖酸銻鈉、富馬酸亞鐵

有機(jī)金屬藥物：金屬原子直接與碳原子以共價(jià)鍵相連，結(jié)合比較牢固如卡巴胂、醋酸苯汞、汞撒利酒石酸銻鉀硬脂酸鎂富馬酸亞鐵葡萄糖酸銻鈉卡巴胂醋酸苯汞汞撒利二、不經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法（一）直接測(cè)定法例如：富馬酸亞鐵

溶于熱稀礦酸，采用鈰量法，鄰二氮菲作指示劑

（二）經(jīng)水解后測(cè)定法

1.直接回流后測(cè)定法例如：三氯叔丁醇的含量測(cè)定

CCl3-C(CH3)2-OH+4NaOH(CH3)2CO+3NaCl+HCOONa+2H2ONaCl+AgNO3AgCl+NaNO3AgNO3+NH4SCNAgSCN+NH4NO3

2.用硫酸水解后測(cè)定法例如：硬脂酸鎂的含量測(cè)定

Mg(C17H35COO)2+H2SO4

MgSO4+2C17H35COOH

H2SO4+2NaOHNa2SO4

+2H2O

△△（三）經(jīng)氧化還原后測(cè)定法

1.堿性還原后測(cè)定例如：泛影酸的含量測(cè)定

2.酸性還原后測(cè)定例如：碘番酸的含量測(cè)定Zn還原后銀量法

3.利用藥物中可游離的金屬離子的氧化性測(cè)定含量

（1）含銻藥物例如：葡萄糖酸銻的含量測(cè)定

Sb5++2KISb3++2K+

++I2I2+2Na2S2O32NaI+Na2S4O6

（2）含鐵藥物

2Fe3++2KI2Fe2++2K++I2I2+2Na2S2O32NaI+Na2S4O6H+

三、經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法

濕法破壞

藥物分析中常用的有機(jī)破壞的方法有干法破壞

HNO3-HClO4法氧瓶燃燒法(一)濕法破壞HNO3-H2SO4法

H2SO4-硫酸鹽法

HNO3-H2SO4-HClO4法；H2SO4-H2O2；H2SO4-KMnO4(二)干法破壞加Na2CO3或MgO以助灰化；溫度控制在420℃

(三)氧燃瓶燃燒法

(oxygenflaskcombustionmethod)1.儀器裝置500ml,1000ml,2000ml,磨口、硬質(zhì)玻璃錐形瓶

2.稱樣固體樣；液體樣要求詳見(jiàn)P1633.燃燒分解操作法

4.吸收液的選擇用于X、S、Se等的鑒別、檢查、含量測(cè)定時(shí)多數(shù)是H2O或H2O-NaOH；少數(shù)為H2O-NaOH-H2O2.空心7mm50mm30mm尾部7mm13mm20mm25mm356mm166mm濾紙濾紙AGFEDCB氧瓶燃燒裝置應(yīng)用示例：碘苯酯的測(cè)定第二節(jié)定量分析方法特點(diǎn)

一、容量分析法（一）容量分析法的特點(diǎn)

操作簡(jiǎn)單、快速；比較準(zhǔn)確（RSD＜0.2%）；儀器普通易得。（二）容量分析法的計(jì)算問(wèn)題

1.滴定度（T）的概念每1mlmol溶液相當(dāng)于被測(cè)物質(zhì)的量(mg)2.滴定度的計(jì)算a

A+b

Bc

C+d

D

T=

M

×b

/

a×B

3.百分含量的計(jì)算（1）直接滴定法D%=V×F×T/W×100%

F=實(shí)際標(biāo)定的濃度/規(guī)定的濃度

（2）間接滴定法（回滴定法；剩余滴定法）

D%=（VO

–

VB)×F×T/W×100%

二、光譜分析法

（一）紫外-可見(jiàn)分光光度法（200nm～760nm)

靈敏度高，可達(dá)10-4g/ml～

10-7g/ml1.特點(diǎn)準(zhǔn)確度高，RSD（%）為2%～5%

儀器價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)單，易普及，應(yīng)用范圍廣。

2.朗伯-比耳定律A=ECLE1%1cm=ε×10/M3.儀器校正和檢定

波長(zhǎng)校正用汞燈中較強(qiáng)譜線237.38,253.65,275.28,296.73,313.16,334.15,365.02,404.66,425.83,546.07nm與576.96nm

或用儀器中氘燈的486.02nm與656.10nm進(jìn)行校正。吸收度的檢定：用K2CrO7(60mg)+0.005mol/LH2SO4液至1000ml

波長(zhǎng)(nm)235(最小)257(最大)313(最小)350(最大)

E1%1cm124.5144.048.62106.6

雜散光檢查：試劑濃度(g/ml)測(cè)定波長(zhǎng)透光率(%)

NaI1.00220nm＜0.8NaNO25.00340nm＜0.84.對(duì)溶劑的要求:220～240nm241～250nm251～300nm300nm以上溶劑+吸收池A＜0.41＜0.20＜0.10＜0.05

5.測(cè)定方法要求供試品溶液的A應(yīng)在0.3～0.7

對(duì)照品比較法：Cx=(Ax/Ar)Cr;含量%=Cx×D/W×100%

常用方法吸收系數(shù)法：含量%=Ax

/(E1%1cm

)r×100%

計(jì)算分光光度法：VA的三點(diǎn)校正法

（二）熒光分光光度法

靈敏度高，可達(dá)10-10g/ml～

10-12g/ml

在低濃度進(jìn)行測(cè)定，防止F與C不成正比及自熄滅作用

1.特點(diǎn)用基準(zhǔn)物溶液校正儀器靈敏度，防止樣品液熒光衰減靈敏度高，但干擾因素多。制備熒光衍生物，可提高其靈敏度和選擇性。用樣品量少，操作簡(jiǎn)單，方法快速，應(yīng)用范圍較廣。

2.熒光分析儀有二個(gè)單色光器—激發(fā)單色光器與發(fā)射單色光器；且激發(fā)光源、樣品池和檢測(cè)器成直角。3.含量測(cè)定常用的方法對(duì)照品比較法:Ci=(Ri-Rib)/(Rr-Rrb)×CrCh.P收載地高辛片、利血平片、洋地黃毒苷片。

三、色譜分析法

按分離原理分為：吸附；分配；離子交換；排阻色譜方法分類按分離方法分為：PC；TLC；柱色譜；GC，HPLC。（一）HPLC法

1.對(duì)HPLC儀器一般要求色譜柱、流動(dòng)相按品種項(xiàng)下要求。色譜柱的理論板數(shù)：n=5.54(tR/Wh/2)22.系統(tǒng)性試驗(yàn)分離度：R=2（tR1–tR2)/(W1+W2);要大于1.5

拖尾因子：T=W0.05h/2d1

應(yīng)在0.9～

1.05

內(nèi)標(biāo)法加校正因子測(cè)定供試品中主成分含量3.測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法外標(biāo)法測(cè)定供試品中主成分含量外標(biāo)一點(diǎn)法

應(yīng)用示例：

RP-HPLC法測(cè)定鹽酸黃酮哌酯片含量，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法如頭孢拉??；頭孢羥氨芐；頭孢唑啉鈉用外標(biāo)一點(diǎn)法

（二）GC法

1.對(duì)GC儀器一般要求載氣為氮?dú)?；色譜柱為填充或毛細(xì)管柱色譜柱的理論板數(shù)：n=5.54(tR/Wh/2)22.系統(tǒng)性試驗(yàn)分離度：R=2（tR1–tR2)/(W1+W2);要大于1.5

拖尾因子：T=W0.05h/2d1

應(yīng)在0.9～

1.05

內(nèi)標(biāo)法加校正因子測(cè)定供試品中主成分含量

3.測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法外標(biāo)法測(cè)定供試品中主成分含量外標(biāo)一點(diǎn)法應(yīng)用示例：

Ch.P(2000)收載的月桂卓酮、維生素E及其片劑、注射劑、甲酚皂溶液等均采用GC法中的內(nèi)標(biāo)法加校正因子測(cè)定含量。

第三節(jié)藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證一、準(zhǔn)確度

是指用該方法測(cè)定結(jié)果與真實(shí)值接近的程度，用回收率表示（一）含量測(cè)定方法的準(zhǔn)確度

1.原料藥可用已知純度對(duì)照品或樣品進(jìn)行測(cè)定；或與已建準(zhǔn)確度的另一方法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較。

2.制劑要考察輔料對(duì)回收率的影響。采用在空白輔料中加入原料對(duì)照品的方法作回收率試驗(yàn)，然后計(jì)算RSD。具體做法：測(cè)定高、中、低三個(gè)濃度，n=3,共9個(gè)數(shù)據(jù)來(lái)評(píng)價(jià)回收率的RSD＜2%；用UV和HPLC發(fā)時(shí)，一般回收率可達(dá)98%～102%；容量法可達(dá)99.7%～100.3%

（二）數(shù)據(jù)要求

回收率%=（測(cè)定平均值—空白值）/加入量×100%

要求制備高、中、低三濃度的樣品，各測(cè)定3次。應(yīng)報(bào)告已知加入量的回收率，或測(cè)定結(jié)果平均值與真實(shí)值之差及其可信限。

二、精密度是指在規(guī)定的測(cè)試條件下，同一個(gè)均勻樣品，經(jīng)多次測(cè)定結(jié)果之間的接近程度。

（一）精密度表示方法

1.偏差(deviation,d)d=測(cè)得值-平均值=Xi-X

2.標(biāo)準(zhǔn)偏差（standarddeviation,SD或S）

S=[(∑Xi–X)2/(n-1)]1/23.相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(relativestandarddeviation,RSD)也稱變異系數(shù)

(coefficientofvariation,CV)RSD=標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值×100%=S/X×100%（二）重復(fù)性、中間精密度及重現(xiàn)性1.重復(fù)性在相同條件下,由一個(gè)分析人員測(cè)定所得結(jié)果的精密度.2.中間精密度在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室，不同時(shí)間由不同分析人員用不同設(shè)備測(cè)定結(jié)果的精密度。

3.重現(xiàn)性在不同實(shí)驗(yàn)室由不同分析人員測(cè)定結(jié)果的精密度。（三）數(shù)據(jù)要求

應(yīng)報(bào)告S或SD、RSD和可信限。用統(tǒng)計(jì)學(xué)的可信性分析(t或f）。

三、專屬性是指在其他成分(如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等)可能存在下，采用的方法能準(zhǔn)確測(cè)定出被測(cè)物的特性。鑒別反應(yīng)、雜質(zhì)檢查、含量測(cè)定方法，均應(yīng)考察其專屬性。

（一）鑒別反應(yīng)應(yīng)能與其它共存的物質(zhì)或相似化合物區(qū)分，不含被測(cè)組分的樣品均應(yīng)呈現(xiàn)負(fù)反應(yīng)。

（二）含量測(cè)定和雜質(zhì)測(cè)定色譜法和其他分離法，應(yīng)附代表性的圖譜，以說(shuō)明專屬性。

圖中應(yīng)注明各組分的位置，色譜法中分離度應(yīng)符合要求。在能獲得雜質(zhì)的情況下，可加到試樣中，考察對(duì)結(jié)果的干擾。在雜質(zhì)和降解物不能獲得的情況下，可用以驗(yàn)證方法和藥典方法進(jìn)行對(duì)照；也可用對(duì)試樣加速破壞的方法，比較兩種方法。

四、檢測(cè)限（limitofdetection,

LOD)

是指試樣中被測(cè)物能被檢測(cè)出的最低濃度或量，是限度檢驗(yàn)指標(biāo)。它無(wú)需測(cè)定，只要指出高于或低于該規(guī)定的濃度或量即可。（一）常用的方法

1.非儀器分析目視法用已知濃度被測(cè)物，試驗(yàn)出能被可靠地檢測(cè)出的最低濃度或量。

2.儀器分析方法

UV法：LOD=f.3S空

=C樣/A樣×

3S空

Flu法：LOD=f.3S空

=C樣/(F樣-F空)×

3S空

GC和HPLC法：

LOD=S/N=2或3

（二）數(shù)據(jù)要求應(yīng)附測(cè)試圖，說(shuō)明測(cè)試過(guò)程和檢測(cè)限結(jié)果。

五、定量限（limitofquantitation,

LOQ)

是指樣品中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低量，其測(cè)定結(jié)果應(yīng)具一定準(zhǔn)確度和精密度。雜質(zhì)和降解產(chǎn)物進(jìn)行定量測(cè)定時(shí)，要求

LOQ.常用信噪比法確定定量限，一般以S/N=10時(shí)相應(yīng)的濃度進(jìn)行測(cè)定。

六、線性

是指在設(shè)定的范圍內(nèi)，測(cè)試結(jié)果與試樣中被測(cè)物濃度直接呈正比關(guān)系的程度。

UV法：首先制備一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)系列，濃度點(diǎn)n=5;A=0.3～.0.7

建立回歸方程C=aA+b;r＞0.9999。

HPLC法：制備一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)系列，濃度點(diǎn)n=5～7;以C對(duì)h或A或與內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比，建立回歸方程r＞0.9999。

七、范圍

是指達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性、測(cè)試方法適用的高低限度或量的區(qū)間。

原料藥和制劑含量測(cè)定：范圍應(yīng)為測(cè)試濃度的80%-～

120%。

制劑含量均勻度檢查：范圍應(yīng)為測(cè)試濃度的70%-～

130%。