第七章蛋白質(zhì)的分離純化

Chapter7Protein的分離、純化和表征一、Protein的酸堿性質(zhì)（一）Protein的兩性解離★1、主鏈上兩個末端α—NH2和α—COOH的解離2、側(cè)鏈上基團的解離（二）Protein的等電點（PI）1、定義：使蛋白質(zhì)分子所帶正電荷與負電荷相等，即凈電荷為零時的溶液的pH值稱為PI(isoelectricpoint).2、當(dāng)pH值>PI時，蛋白質(zhì)帶負電荷當(dāng)pH值<PI時，蛋白質(zhì)帶正電荷當(dāng)pH值=PI時，蛋白質(zhì)帶凈電荷為零3、等電點沉淀法用于分離純化蛋白質(zhì)電泳分離正極移動負極移動不移動電泳二、Protein的高分子性質(zhì)1、穩(wěn)定性因素（299頁）：（1）膠體性質(zhì)（丁達爾現(xiàn)象、布郎運動）；

（2）形成水化膜；（3）雙電離層2、通透性：不易透過半透膜，可用透析的方法將蛋白質(zhì)分子與其它小分子物質(zhì)分離，純化蛋白質(zhì)。3、沉降系數(shù)（S）：蛋白質(zhì)在一定的溶劑中，經(jīng)超速離心沉降，單位力場中的沉降速度即該蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)，它表示沉降分子的大小特性。三、Protein的變性與復(fù)性

1、定義：蛋白質(zhì)在一定的理化因素的影響下，三維構(gòu)象破壞，理化性質(zhì)發(fā)生改變和生物學(xué)活性喪失，叫變性作用（denaturation)。其本質(zhì)是高級結(jié)構(gòu)破壞、一級結(jié)構(gòu)不變。蛋白質(zhì)的復(fù)性：消除理化因素的影響，生物活性恢復(fù)或部分恢復(fù)。加熱凝固變性不可逆。2、意義：生產(chǎn)和保存蛋白制品；消毒；提純等應(yīng)用。四、Protein的沉淀（precipitation)沉淀蛋白質(zhì)的方法有（一）鹽溶鹽析：中式鹽，如硫酸銨，（降低蛋白質(zhì)與水的親和力）；（二）有機溶劑沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等（破壞蛋白質(zhì)膠粒上的水化層）；（三）重金屬鹽沉淀法：產(chǎn)生重金屬蛋白鹽沉淀；

（四）生物堿試劑和某些酸類沉淀法：鞣酸、苦味酸、硝酸等（五）加熱變性沉淀法五、Protein的顏色反應(yīng)（一）茚三酮反應(yīng)：在pH5~7的溶液中，與茚三酮共熱可產(chǎn)生藍紫色物質(zhì)，用于蛋白質(zhì)的定性和定量。（二）雙縮脲反應(yīng)：與雙縮脲試劑（即堿性銅溶液）反應(yīng)生成紫紅色絡(luò)合物，只與兩個以上肽鍵化合物的特征反應(yīng)?？捎糜诘鞍踪|(zhì)定性、定量或蛋白質(zhì)水解程度的測定。（三）酚試劑反應(yīng)：與酚試劑（磷鉬酸—磷鎢酸化合物）作用生成藍色物質(zhì)，再用比色法定性和定量，其靈敏度比雙縮脲反應(yīng)高100倍。六、Protein吸收光譜的特點Phe、Tyr、Trp具有吸收紫外光的能力，最大的吸收峰為280nm處，此外，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵可引起200~220nm的最大光吸收，可用于蛋白質(zhì)的定性和定量。七、Protein分子的免疫學(xué)特性免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)和功能◆八、Protein的分離純化及鑒定（一）Protein的提?。?00頁）1、選材：2、破碎：常用的方法有研磨法、超聲波法、凍融法和酶解法等機械破碎法。3、提取：（二）Protein的分離純化1、鹽析法：中性鹽分級沉淀法，常用的鹽為硫酸銨。不同的蛋白質(zhì)由于所帶的電荷和水化程度不同，鹽析時所需的鹽的濃度也不相同，因而可以將不同的蛋白質(zhì)加以分離。2、等電點沉淀法：凈電荷為零，分子之間的靜電排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。該法適用于在等電點pH穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。3、有機溶劑沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等（保持低溫），破壞蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)的溶解度降低而沉淀。

4、凝膠過濾（303頁）（凝膠層析）(gelfiltrationchromatography):又叫分子篩層析，常用的凝膠有交聯(lián)葡聚糖(sephadex)、聚丙烯酰胺凝膠(Bio-gelP)和瓊脂糖凝膠(Bio-gelA)等。常用于大分子物質(zhì)的分離純化，以及蛋白質(zhì)樣品的脫鹽和蛋白質(zhì)分子量的測定等。5、離子交換層析：6、密度梯度（區(qū)帶）離心：常用蔗糖密度梯度。此外，有透析法、超過濾法、萃取法、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和等電聚焦電泳、超速離心、親和層析等。TheEnd蛋白質(zhì)與氨基酸、多肽一樣，能夠發(fā)生兩性解離（兩性電解質(zhì)），也有等電點（PI）。陽離子交換劑本身帶負電荷，陰離子交換劑本身帶正電荷。（221頁）此法又稱為分子篩層析。凝膠過濾所用的介質(zhì)是由交聯(lián)葡萄糖、瓊脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝膠珠。凝膠珠的內(nèi)部是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。Sephadex-葡聚糖凝膠G10-G200Sepharose-瓊脂糖凝膠2B,4B,6BSephacryl-丙烯酰胺葡聚糖凝膠S100,S200,S300,S400SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量（SDS學(xué)名為十二烷基磺酸鈉）SDS（十二烷基磺酸鈉）是一種陰離子型表面活性劑，它能夠與蛋白質(zhì)多肽鏈中的氨基酸殘基按大約12比例結(jié)合。這樣，每一個蛋白質(zhì)分子都因為結(jié)合了許多的SDS而帶有大量的負電荷，而蛋白質(zhì)分子原有的電荷則可以忽略。由于所有的蛋白質(zhì)顆粒都帶有大量的負電荷，而且它們的電荷密度也大體相同，因此，Eq值接近一個常數(shù)。所以該法主要利用了蛋白質(zhì)分子量大小不同而分離蛋白質(zhì)。等電聚焦電泳：兩性電解質(zhì)載體由多烯多胺與丙烯酸加合得到，在電場作用下能形成連續(xù)的梯度。電泳在等電點時蛋白質(zhì)比較穩(wěn)定，其物理性質(zhì)如導(dǎo)電性、溶解度、粘度、滲透壓等皆最小。因此