DNA的復(fù)制與修復(fù)

DNA的復(fù)制與修復(fù)

基因(gene)是生命體遺傳信息的傳遞體，是編碼生物活性產(chǎn)物（蛋白質(zhì)或各種RNA）的DNA功能片段，其功能的體現(xiàn)遵循中心法則。

1958年，F(xiàn).Crick提出中心法則：

后來人們又發(fā)現(xiàn)，在宿主細(xì)胞中一些RNA病毒能以自己的RNA為模板復(fù)制出新的病毒RNA，還有一些RNA病毒能以其RNA為模板合成DNA，稱為逆轉(zhuǎn)錄這是中心法則的補(bǔ)充。

第一節(jié)DNA的復(fù)制生物體的遺傳信息儲存在DNA中，并通過DNA的復(fù)制由親代傳給子代。在子代的生長發(fā)育中遺傳信息自

DNA轉(zhuǎn)錄給RNA，然后翻譯成蛋白質(zhì)以執(zhí)行各種生命功能，使后代表現(xiàn)出與親代相似的遺傳性狀。子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式

全保留式半保留式混合式1.半保留復(fù)制的證明1.半保留復(fù)制的證明一、DNA的半保留復(fù)制

1.概念：

DNA在復(fù)制時，兩條鏈解開分別作為模板，在DNA聚合酶的催化下按堿基互補(bǔ)的原則合成兩條與模板鏈互補(bǔ)的新鏈，以組成新的DNA分子。這樣新形成的兩個DNA分子與親代DNA分子的堿基順序完全一樣。由于子代DNA分子中一條鏈來自親代，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻模@種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。

2.DNA的半保留復(fù)制實(shí)驗(yàn)依據(jù)

1958年Meselson&stahl用同位素示蹤標(biāo)記加密度梯度離心技術(shù)實(shí)驗(yàn),證明了DNA是采取半保留的方式進(jìn)行復(fù)制.梯度密度離心實(shí)驗(yàn)

——實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持半保留復(fù)制設(shè)想的。含重氮-DNA的細(xì)菌培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第一代繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第二代梯度離心結(jié)果重DNA普通DNA普通DNA輕DNAN15-DNAN15N14DNA按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。半保留復(fù)制的意義遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對的。二.DNA復(fù)制的起始點(diǎn)與方向1.復(fù)制起點(diǎn)（originori或o復(fù)制原點(diǎn)）：DNA復(fù)制都是在特定起始部位開始。這一特異部位稱為Ori。大多數(shù)原核生物基因組和細(xì)菌質(zhì)粒只有一個Ori位點(diǎn)，而真核生物染色體中有多個Ori。

Ori是以一條鏈為模板起始DNA合成的一段序列。一般由100-200個堿基對組成，富含A.T。

1983年，Zyskind等人比較了6種不同種類的細(xì)菌染色體復(fù)制起點(diǎn)的DNA序列（包括E.coli、鼠傷寒沙門氏菌、肝炎桿菌和一種海洋細(xì)菌等），發(fā)現(xiàn)它們具有共有序列,包括二個必需區(qū)域：一個是9bp重復(fù)序列，重復(fù)出現(xiàn)4次，能與起始蛋白DnaA特異結(jié)合，對于DNA復(fù)制的起始十分重要；另一個是3個連續(xù)出現(xiàn)的13bp序列，富含A和T，有利于雙螺旋DNA局部解旋并暴露兩條復(fù)制模板鏈。細(xì)菌的Ori結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：串聯(lián)重復(fù)序列(tandemrepeat):A-T

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)復(fù)制子:基因組中能單獨(dú)進(jìn)行復(fù)制的單位。每個起始點(diǎn)到終止點(diǎn)的區(qū)域?yàn)橐粋€復(fù)制子。單復(fù)制子:一般原核生物細(xì)胞多復(fù)制子：真核生物細(xì)胞核DNA。

真核生物（Eukaryote）:多復(fù)制起點(diǎn)即－－一個genome中有多個復(fù)制單位Replicationfork

富含AT&發(fā)夾結(jié)構(gòu)“呼吸作用”十分明顯

許多酶的結(jié)合位點(diǎn)一般由100-200個堿基對組成，富含A.T。ATrich2.DNA復(fù)制的方式雙向復(fù)制：大多數(shù)（等速進(jìn)行或異速進(jìn)行），形成兩個復(fù)制叉。單向復(fù)制：少數(shù)，形成一個復(fù)制叉。復(fù)制叉----復(fù)制開始后由于DNA雙鏈解開，在兩股單鏈上進(jìn)行復(fù)制，形成在顯微鏡下可看到的叉狀結(jié)構(gòu)，稱為復(fù)制叉。

復(fù)制眼（replicationeye）：電子顯微鏡下觀察正在復(fù)制的DNA,復(fù)制的區(qū)域形如一只眼睛.真核生物的多復(fù)制子多個復(fù)制眼DNA復(fù)制的方式復(fù)制叉起始點(diǎn)起始點(diǎn)起始點(diǎn)復(fù)制叉復(fù)制叉未復(fù)制DNA單向復(fù)制雙向復(fù)制復(fù)制的多模式

A.單起點(diǎn)、單方向（原核）B.多起點(diǎn)、單方向（真核）C.單起點(diǎn)、雙方向（原核）D.多起點(diǎn)、雙方向（真核）原核生物的染色體和質(zhì)粒、真核生物的細(xì)胞器DNA都是環(huán)狀雙鏈分子，它們都是單復(fù)制子，都在一個固定的起點(diǎn)開始復(fù)制，復(fù)制方向大多數(shù)是雙向的，少數(shù)是單向復(fù)制。多數(shù)是對稱復(fù)制，少數(shù)是不對稱復(fù)制（一條鏈復(fù)制后才進(jìn)行另一條鏈的復(fù)制）。（1）比較形象的－－θ

復(fù)制ZP41

雙鏈環(huán)狀DNA的復(fù)制眼可以形成一種θ結(jié)構(gòu)，形狀像希臘字母θ.稱θ形復(fù)制起始點(diǎn)復(fù)制叉的推進(jìn)

（2）

D-環(huán)型（D-loop）：

這也是一種單向復(fù)制的特殊方式。這種方式首先在動物線粒體DNA的復(fù)制中被發(fā)現(xiàn)。雙鏈環(huán)在固定點(diǎn)解開進(jìn)行復(fù)制。但兩條鏈的合成是高度不對稱的，一條鏈上迅速合成出互補(bǔ)鏈，另一條鏈則成為游離的單鏈環(huán)（即D-環(huán)）。（2）D環(huán)復(fù)制（不對稱復(fù)制）

線粒體和葉綠體DNA的復(fù)制方式。

ZP43圖2-22

WP411圖34-8（3）共價延伸方式或滾環(huán)式復(fù)制

這是單向復(fù)制的特殊方式。如ΦX174的雙鏈環(huán)狀DNA復(fù)制型（RF）就是以這種方式復(fù)制的。DNA的合成由對正鏈原點(diǎn)的專一性切割開始，所形成的自由5’端被從雙鏈環(huán)中置換出來并為單鏈DNA結(jié)合蛋白所覆蓋，使其3’—OH端在DNA聚合酶的作用下不斷延伸。共價延伸方式或滾環(huán)式復(fù)制

由于復(fù)制時產(chǎn)生的滾環(huán)結(jié)構(gòu)形狀象σ，又稱σ復(fù)制。

病毒、細(xì)菌因子

ZP42圖2-21

cyclingamplification5‘3‘3‘3‘復(fù)制反應(yīng)可看成生長點(diǎn)沿著環(huán)狀的模板鏈滾動。在這個過程中，單鏈尾巴的延伸與雙鏈DNA的繞軸旋轉(zhuǎn)同步。復(fù)制一圈，就產(chǎn)生單位長度的線性DNA鏈，復(fù)制繼續(xù)進(jìn)行，可產(chǎn)生多單元線性DNA鏈。真核生物的染色體DNA是線形雙鏈分子，含有許多復(fù)制起點(diǎn)，因此是多復(fù)制子，每個復(fù)制子約有100-200Kbp。人體細(xì)胞平均每個染色體含有1000個復(fù)制子。

在鏈的延長過程中，鏈的游離3’-羥基，對進(jìn)入的脫氧核糖核苷三磷酸α-磷原子發(fā)生親核攻擊，生成3’5’-磷酸二酯鍵，并脫下焦磷酸。因此，每摻入一個核苷酸消耗2個高能磷酸鍵。

DNA聚合酶催化的鏈延長反應(yīng)3′5′模板鏈5′RNA引物子鏈3′3′5′5′3′3′5′5′3′第二節(jié).原核生物DNA的復(fù)制

有關(guān)的酶類

（1）DNA聚合酶（2）引物合成酶

和引發(fā)體

(3）DNA連接酶（4）DNA解鏈酶

(5）單鏈結(jié)合蛋白SSB(6）拓?fù)洚悩?gòu)酶

解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物酶和引發(fā)體DNA聚合酶ISSB3′3′5′3′5′5′RNA引物一.復(fù)制有關(guān)的酶

（一）.大腸桿菌DNA聚合酶

1.DNA聚合酶I單體酶，分子量109Kd，含一個Zn2+，每個細(xì)胞中含400個DNApol.Ⅰ（1）5’→3’聚合活性：與模板鏈結(jié)合，按堿基互補(bǔ)原則，催化3’5’磷酸二酯鍵的形成。但只能延伸DNA鏈。（2）3’→5’外切活性：校對的功能，從單鏈的3’末端切除不正確配對的核苷酸。（3）5’→3’外切活性：只作用于雙鏈DNA,從5’切除引物，也可以從5’端切除錯配堿基。

5’-3’聚合酶活性模板引物-3’OH3’→5’外切酶活性

DNA聚合酶的校對功能聚合酶錯配鹼基復(fù)制方向正確核苷酸5′5′5′3′3′3′切除錯配核苷酸3’-5’外切酶活性5'→3'外切酶活性從5’-P端依次切除，可連續(xù)切除只切配對的5’-P末端核苷酸既可切除脫氧核苷酸也可切除核苷酸2.DNA聚合酶II多亞基酶，分子量120Kd，約含100個/cell5’→3’聚合(活性很低)

只有DNApolⅠ的5%3’→5’外切酶活性無5'→3'外切酶活性?？赡茉贒NA的修復(fù)中起某中作用。

3.DNA聚合酶III寡聚酶，異二聚體，10-20個/cell，但催化的速度很快。目前認(rèn)為是合成新鏈DNA主要的酶，又稱復(fù)制酶。全酶由多個亞基組成，α、ε和θ三種亞基組成核心酶，

DNA多聚酶Ⅲ的結(jié)構(gòu)夾子裝置器全酶在DNA上的裝配分為三個階段：（1）一個β二聚體加上一個γ復(fù)合體識別引物模板形成一種前起始復(fù)合物。（2）DNA在于β,γ復(fù)合體結(jié)合的位點(diǎn)構(gòu)象發(fā)生改變，而對核心酶產(chǎn)生了高親和。使核心酶能與DNA結(jié)合。（3）τ二聚體結(jié)合核心聚合酶，使其二聚化。4.三種DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)和功能大腸桿菌三種DNA聚合酶比較DNA聚合酶Ⅱ分子量每個細(xì)胞的分子統(tǒng)計數(shù)5′-3′聚合酶作用3′-5′核酸外切酶作用5′-3′核酸外切酶作用

DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶Ⅲ（復(fù)合物）109，000400+++

120，000100++-

400，00010-20+++

比較項(xiàng)目

★DNA聚合酶有6個結(jié)合位點(diǎn)⑴模板DNA結(jié)合位點(diǎn)⑵引物結(jié)合位點(diǎn)⑶引物3’-OH位點(diǎn)、反應(yīng)位點(diǎn)⑷底物dNTP結(jié)合位點(diǎn)⑸5’→3’外切位點(diǎn)(pol.Ⅱ沒有

⑹

3’5’外切位點(diǎn)子鏈DNA延伸方向?yàn)槭裁粗荒苁?’3’？已知的DNA聚合酶只能使鏈按5’－3’方向生長5’

OHTCATCAC

5’

OH3’ppp

OHC++

ppi

進(jìn)化中保留的深刻的選擇與適應(yīng)的、化學(xué)及功能的根源

如果DNA的延伸方向是3’→5’ATCG

+

5’pppOH3’

G

pppOH

GATCG

5’pppOH3’ATCG

+

5’pppOH3’

G

pppOHG

5’pppa、因能量的需要，DNA的5’

端必須帶有PPP游離dNTP具有ppppppOH3’ATCG在0.2MNacl

的生理環(huán)境中，使dNTP難以聚合到DNA的5’端

需要其他機(jī)制以解脫b、堿基發(fā)生錯配后的校正……

費(fèi)時、費(fèi)能、增加脫磷酸、加磷酸的能量消耗

ATCG

pppOH+

pppAp

OHTCGpppOHTCGTCGpppOH（二）解螺旋酶與單鏈DNA結(jié)合蛋白

1.解旋酶利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈.與rep蛋白協(xié)同作用，將DNA兩條鏈解開。解螺旋酶沿著后隨鏈的5’→3’方向隨著復(fù)制叉的前進(jìn)而移動，而rep蛋白則在另一條模板鏈上沿3’→5’方向移動。解旋酶(helicase)2.單鏈DNA結(jié)合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB）又稱為雙螺旋去穩(wěn)定蛋白（helixdestabilizingprotein）由177個aa組成在E.coli

中以四聚存在分子量為74KDa作用與特點(diǎn)：1).能夠與單鏈DNA結(jié)合，降低天然DNA的Tm2).穩(wěn)定單鏈DNA，便于以其為模板復(fù)制子代DNA。3).保護(hù)單鏈，DNA避免核酸酶的降解。4).蛋白質(zhì)之間表現(xiàn)出協(xié)同性，第一個SSB

結(jié)合促進(jìn)了后續(xù)SSB與單鏈DNA分子的結(jié)合，直至全部單鏈DNA分子被SSB所覆蓋。但真核生物的SSB沒有此特點(diǎn)。（三）.DNA旋轉(zhuǎn)酶WP420屬DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ，可引入負(fù)超螺旋，消除復(fù)制叉前進(jìn)時帶來的扭曲張力。拓?fù)洚悩?gòu)酶分兩類：I和II，廣泛存在于原核生物和真核生物，既能水解，又能連接磷酸二酯鍵。拓?fù)洚悩?gòu)酶I使DNA的一條鏈發(fā)生斷裂和再連接，反應(yīng)無須供給能量，主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，與轉(zhuǎn)錄有關(guān)。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ使DNA的兩條鏈同時斷裂和再連接，當(dāng)它引入超螺旋時需要由ATP供給能量。分布在染色質(zhì)骨架蛋白和核基質(zhì)部，與復(fù)制有關(guān)。

DNA雙鏈重新連接DNA雙鏈穿過DNA的釋放重復(fù)起始DNA雙鏈斷裂拓?fù)洚悩?gòu)酶II的作用機(jī)制WP34-19（四）引物合成酶(Primase)本質(zhì)上是一種依賴DNA的RNA聚合酶（DDRP），該酶以DNA為模板，聚合一段RNA短鏈引物，以提供自由的3’-OH，使子代DNA鏈能夠開始聚合。5′3′5′3′5′

5′RNAprimer（五）

DNA連接酶（ligase）WP417催化兩段DNA之間的連接

a、切刻的3’－OH和5’－P相鄰。

b、切刻各自堿基處于配對狀態(tài)基礎(chǔ)上雙鏈中的單鏈缺口。

c.需要能量原核（ATP、NAD）真核（ATP）

d.只連Nick，不連Gap。

作用機(jī)制是分三步進(jìn)行：1、E＋ATP→E－AMP＋ppi

在E.coli中，

E＋NAD→E－AMP＋NMN（煙酰胺單核苷酸）2、E-AMP上的AMP轉(zhuǎn)移到DNA的5’-PO4上使其活化3、活化的5’－PO4與相鄰的3’－OH作用形成3‘－5’磷酸二酯鍵，并釋放出AMP。二.DNA復(fù)制的機(jī)制

（一）半不連續(xù)性和岡崎片段

1.半不連續(xù)復(fù)制：DNA聚合酶催化的方向是5’→3’。DNA的一條鏈?zhǔn)?/p>

3’→5’，以這條鏈為模板，合成的方向5’→3’隨復(fù)制叉的移動能連續(xù)合成，稱為領(lǐng)頭鏈或先導(dǎo)連；以DNA的另一條鏈?zhǔn)?’→3’為模板，由于聚合方向是5’→3’，因此隨復(fù)制叉的移動不能連續(xù)合成，稱隨從鏈或滯后鏈。

岡崎片段與半不連續(xù)復(fù)制（okazaki1968年）2.岡崎片段：

岡崎用電子顯微鏡看到了DNA復(fù)制過程中出現(xiàn)一些不連續(xù)片段，這些不連續(xù)片段只存在于DNA復(fù)制叉上其中的一股。后來就把這些不連續(xù)的片段稱為岡崎片段。1968年，發(fā)現(xiàn)岡崎片段。細(xì)菌：1Kb-2Kb真核：100-200bp（二）.復(fù)制過程

1.復(fù)制的起始★大腸桿菌起始復(fù)制所需蛋白質(zhì)：WP422表34-4DNaA

在原點(diǎn)處打開雙螺旋DNaB

使DNA解旋，活化引物合成酶DNaC

DNaB結(jié)合在原點(diǎn)所需HuDNA結(jié)合蛋白，刺激起始引物合成酶（DNaG）合成RNA引物SSB結(jié)合單鏈DNARNA聚合酶促進(jìn)DNaA的活性旋轉(zhuǎn)酶松馳DNA扭曲張力（1）引物合成酶和引發(fā)體

細(xì)胞內(nèi)，DNA的復(fù)制需要RNA引物，引物合成酶或RNA聚合酶可合成6-10個堿基的RNA引物?！顳NA復(fù)制為什么要用RNA引物？⑴DNA聚合酶在開始形成一個新的磷酸二酯鍵前，總是檢查前一個堿基是否正確，這就決定了它不能從頭開始合成。⑵從模板復(fù)制最初幾個核酸時，堿基堆積力和氫鍵都較弱，易發(fā)生錯配。沒有與模板形成穩(wěn)定雙鏈，DNA聚合酶的3’→5’校對功能難發(fā)揮作用。引物合成酶：

RNA聚合酶DnaG

引發(fā)：當(dāng)DNA的雙螺旋解開后，合成

RNA引物的過程。引發(fā)體（dnaB、dnaC、n、n”n’I）由蛋白因子（如dnaB等）識別復(fù)制起始點(diǎn)，并與其他蛋白因子以及引物合成酶一起組裝形成引發(fā)體。引發(fā)體沿著模板鏈5’→3’方向移動（與復(fù)制叉移動的方向相同）。

WP424

zP45復(fù)制起始區(qū)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是：（1）富含A－T，這可能和雙鏈易于解開起始復(fù)制有關(guān)；（2）含有多個回文結(jié)構(gòu)（9－14個GATC）

11個GATC較保守,GATC中的“A”已甲基化;（3）具有4個串聯(lián)的9個堿基反向重復(fù)順序，作為蛋白結(jié)合位點(diǎn)；（4）此順序的右側(cè)毗鄰區(qū)域有兩個啟動子，其可能的作用是：①轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生引物；②產(chǎn)生復(fù)制必要的蛋白；③產(chǎn)生調(diào)節(jié)功能的RNA；④起轉(zhuǎn)錄激活作用。首先，DnaA（攜ATP）與Ori處的識別位點(diǎn)（9bp重復(fù)序列）緊密結(jié)合，形成起始復(fù)合物；Hu蛋白通過與DNA結(jié)合，使之彎曲，使DnaA與A－T富含區(qū)相接觸，使其解鏈，形成開放復(fù)合物；單鏈結(jié)合蛋白（SSB）與解開的單鏈結(jié)合。DnaA還能指導(dǎo)DnaB－DnaC復(fù)合物結(jié)合到解鏈區(qū)形成前引發(fā)復(fù)合物，DnaC的功能是運(yùn)送DnaB蛋白，DnaB具螺旋酶活性，使螺旋解旋，暴露出引物形成位點(diǎn)，DnaB同時引導(dǎo)引物合成酶的結(jié)合形成引發(fā)體，合成RNA引物。結(jié)合Ori區(qū)，具ATP酶活性促進(jìn)DnaB形成起始復(fù)合物

DNA解螺旋酶運(yùn)輸DnaBDNA引物合成酶促進(jìn)起始復(fù)合物形成（2）復(fù)制起始：WP421

ZP45

簡單步驟：

*

轉(zhuǎn)錄激活*DnaA

識別并結(jié)合復(fù)制起點(diǎn)，DnaB－DnaC

六聚體與oriC

形成預(yù)引發(fā)體

*

DnaG加入形成引發(fā)體（oriC引發(fā)體），合成引物RNA*引物合成后，DNApol

組裝到引發(fā)的RNA

上，完成復(fù)制體的組裝DNA聚合酶Ⅲ識別復(fù)制起點(diǎn)并附著上去，由其β亞單位辨認(rèn)引物，新鏈的第一個脫氧核苷酸與引物的3-OH形成磷酸二酯鍵，開始復(fù)制。

拓?fù)洚悩?gòu)酶松弛螺旋。

后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)：

?

細(xì)菌中先導(dǎo)鏈的合成受轉(zhuǎn)錄抑制劑的抑制?

后隨鏈的合成不受轉(zhuǎn)錄抑制劑限制原因：

?

先導(dǎo)鏈的起始需要RNApol的轉(zhuǎn)錄激活

?

而后隨鏈的起始由引發(fā)酶（引物合成酶）合成引物，而引發(fā)酶不受轉(zhuǎn)錄抑制劑的抑制

DnaA

DnaB、DnaCDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶引物合成酶SSB3535引發(fā)體和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物合成酶和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。

2.DNA鏈的延長

復(fù)制的延長指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。前導(dǎo)鏈只需要一個RNA引物，后隨鏈的每一個岡崎片段都需要一個RNA引物，鏈的延長反應(yīng)由DNApol.Ⅲ催化。實(shí)驗(yàn)證據(jù)：Reiji等的實(shí)驗(yàn)證據(jù)－－每一岡崎片段都產(chǎn)生一個RNA－DNA接頭AOHPOHXP＊HYP＊H甲苯處理E.coli培養(yǎng)于標(biāo)記的dNTP和未標(biāo)記的NTP中分離DNA用稀堿處理，發(fā)現(xiàn)片斷末端有放射性標(biāo)記。RNADNA堿性水解發(fā)生在3’，5’－磷酸二酯鍵的磷酸基與C－5’之間，因此，

［32P］轉(zhuǎn)移到了核苷酸上去。H引發(fā)一旦完成，DNA聚合酶就在RNA引物的3’－OH端按照模板鏈的堿基順序，以堿基互補(bǔ)的規(guī)則延伸DNA鏈。無論原核還是真核生物，前導(dǎo)鏈?zhǔn)前?’3’方向連續(xù)合成，后隨鏈的延伸也是按53’，但不是連續(xù)合成，而是先合成多個RNA引物，再延伸為多個岡崎片段，最后連接起來。

E-coli前導(dǎo)鏈和后隨鏈的合成都是由DNApolⅢ

催化。WP423后隨鏈的模板折迭180。成環(huán)狀點(diǎn)繞在DNApolⅢ的一個催化亞基上，使后隨鏈合成的方向與前導(dǎo)鏈平行，前導(dǎo)鏈和后隨鏈3’－末端的生長點(diǎn)都靠近于催化亞基，二條鏈的合成都在DNApolⅢ的催化下同時進(jìn)行。DNA聚合酶III二聚體模型不對稱的結(jié)構(gòu)表明了所示的復(fù)制叉的結(jié)構(gòu)。一個催化核心和每一條DNA模版鏈結(jié)合。全酶沿著模版在前導(dǎo)鏈上連續(xù)的滑動；而后隨鏈的模版需要被穿過，DNA上形成了一個環(huán)。DnaB創(chuàng)造了一個解旋點(diǎn)，并且沿著DNA向“前方”（沿著模版后隨鏈上5’-3’的方向）滑動。聚合酶III核心酶大腸桿菌復(fù)制體結(jié)構(gòu)示意圖聚合酶I聚合酶III核心酶滯后鏈前導(dǎo)鏈解螺旋酶引物合成酶RNA引物引發(fā)體拓?fù)洚悩?gòu)酶II-夾子-聚體-夾子-復(fù)合物RNA引物單鏈結(jié)合蛋白（SSB）在一個岡崎片段初始化之后，后隨鏈的核心復(fù)合物在合成一條新鏈的時候?qū)捂溎０鎻摩聤A板中拉過。當(dāng)岡崎片段合成完畢后脫落，釋放環(huán).在下一個初始位點(diǎn),核心復(fù)合物（或者很可能是同一個核心復(fù)合物）會和β夾板結(jié)合開始新的一個片斷的合成。DnaB是推動復(fù)制叉前進(jìn)的解旋酶,同時當(dāng)它和DnaG引發(fā)酶反應(yīng)的時候又會形成引發(fā)體，這是他的雙重特性。當(dāng)引發(fā)體在合適的位點(diǎn)形成后，引物合成開始，然后引發(fā)酶被釋放。引物RNA的長度通常在8-14個堿基之間。很顯然，DNA聚合酶III負(fù)責(zé)替代引發(fā)酶。（3）復(fù)制終止WP424

環(huán)狀DNA，復(fù)制叉相遇即終止。線性DNA,有特定的終止序列。

1、環(huán)形DNA復(fù)制的終止環(huán)狀DNA復(fù)制時，可在離起始點(diǎn)180。相遇，即兩個復(fù)制叉同時到達(dá)一個部位。環(huán)狀雙鏈DNA復(fù)制終止后，兩個子代DNA分子互相絞鏈在一起，不能立即分開，需要借助拓?fù)洚悩?gòu)酶在其中一條DNA鏈上打開缺口，使兩個子代DNA分子分離，然后再把缺口連接起來。OriginTerminusDaughterDNA

structure有些環(huán)狀DNA分子內(nèi)含有終止位點(diǎn)，一個復(fù)制叉先到達(dá)該處停下來，然后另一個復(fù)制叉也到達(dá)該部位。如E-coliDNA中有二個終止位點(diǎn)（T1和T2），T1使反時針方向移動的復(fù)制叉終止，T2使順時針方向移動的復(fù)制叉終止。Tus蛋白識別T1和T2位點(diǎn)，并與之結(jié)合，可能阻止DnaB（螺旋酶）的解鏈作用，阻礙復(fù)制叉的前進(jìn)。它是E-coli復(fù)制終止所必需的因子，但終止子不是必需的。A.終止序列：

T1序列：terE

terD

terAT2序列：terF

terB

terC每個區(qū)域只對一個方向的復(fù)制叉起作用

B.專一性終止蛋白

E.coli

中由Tusgene編碼（terminusutilizationsubstance）通過抑制DNA螺旋酶而發(fā)揮終止作用.ter兩復(fù)制叉相遇處大約50-100bp未被復(fù)制。線性DNA復(fù)制時，當(dāng)復(fù)制叉到達(dá)分子末端時，復(fù)制即終止，兩個子代DNA分子自行分開。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，酵母細(xì)胞染色體復(fù)制完成后，也需要TopoⅡ的作用才能使子代DNA分開。4、RNA引物的切除與缺口的填補(bǔ)DNApolⅠ的5’→3，外切活力（或RNaseH)，切除RNA引物。DNApolⅠ的5’→3，合成活性補(bǔ)齊缺口。

DNA連接酶：催化相鄰的雙鏈片斷的連接

小結(jié)：⑴DNA解螺旋酶解開雙鏈DNA。⑵SSB結(jié)合于DNA單鏈。⑶DNA旋轉(zhuǎn)酶引入負(fù)超螺旋，消除復(fù)制叉前進(jìn)時帶來的扭曲張力。⑷DNA引物酶(在引發(fā)體中)合成RNA引物。⑸DNApol.Ⅲ在兩條新生鏈上合成DNA。⑹DNApolⅠ切除RNA引物，并補(bǔ)上DNA。⑺DNA連接酶連接一個個岡崎片段。

DNA復(fù)制過程中，聚合酶對dTTP和dUTP的分辨能力不是很高,有少量dUTP摻入DNA鏈中，此時，U-糖苷酶、AP內(nèi)切酶、DNApolⅠ、DNAligase共同作用，切除尿嘧啶，接上正確的堿基。(三）復(fù)制的忠實(shí)性

a、DNA聚合酶的高度專一性（嚴(yán)格遵循堿基配對原則，錯配率為

10-9-10-10）

b、DNA聚合酶的校對功能（錯配堿基被3’-5’外切酶切除）

c、起始時以RNA作為引物，減少了錯配

。(RNA引物最終被降解而避免最終避免由于最初幾個核苷酸的復(fù)制錯誤導(dǎo)致的致死突變!）第二節(jié).真核細(xì)胞的DNA復(fù)制多個起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)果蠅5000replicons

平均40Kb（酵母）哺乳動物平均100Kb

一.真核細(xì)胞的DNA聚合酶

WP424ZP48

DNA聚合酶αDNA聚合酶δDNA聚合酶γDNA聚合酶β、DNA聚合酶ε-參與引物的合成-參與前導(dǎo)鏈、后隨連的合成-參與線粒體DNA的合成-參與DNA的修復(fù)-參與后隨連的合成1.真核生物DNA聚合酶⑴DNA聚合酶α:多亞基，有引物合成酶的活性、聚合酶的活性，無外切酶活性。⑵DNA聚合酶β:主要在DNA損傷的修復(fù)

中起作用。⑶DNA聚合酶γ:從線粒體得到，可能與

線粒體DNA的復(fù)制有關(guān)。⑷DNA聚合酶δ:持續(xù)合成DNA,有3’→5’外切活力,真核DNA的復(fù)制酶。而在真核生物中，RNA引物的去除，由一種特殊的核酸酶來水解，而岡崎片段仍由DNA聚合酶來延長。二.真核生物復(fù)制過程中的核小體結(jié)構(gòu)核小體的結(jié)構(gòu)（200bp左右）在真核生物的復(fù)制子上，親代染色體的核小體被逐個打開，組蛋白以完整的八聚體形式直接轉(zhuǎn)移到子代DNA的前導(dǎo)鏈上，新合成的組蛋白與后隨鏈組裝成核小體。因此，DNA的復(fù)制是半保留的，而組蛋白則是全保留的。

αβγδε亞基數(shù)44425分子量（KD)＞25036-38160-300170256細(xì)胞內(nèi)定位核核線粒體核核5′→3′聚合活性＋＋＋＋＋3′→5′外切活性－－－－－

功能復(fù)制、引發(fā)修復(fù)復(fù)制復(fù)制復(fù)制

αβγδε亞基數(shù)44425分子量（KD)＞25036-38160-300170256細(xì)胞內(nèi)定位核核線粒體核核5′→3′聚合活性＋＋＋＋＋3′→5′外切活性－－－－－

功能復(fù)制、引發(fā)修復(fù)復(fù)制復(fù)制復(fù)制

αβγδε亞基數(shù)44425分子量（KD)＞25036-38160-300170256細(xì)胞內(nèi)定位核核線粒體核核5′→3′聚合活性＋＋＋＋＋3′→5′外切活性－－－－－

功能復(fù)制、引發(fā)修復(fù)復(fù)制復(fù)制復(fù)制

αβγδε亞基數(shù)44425分子量（KD)＞25036-38160-300170256細(xì)胞內(nèi)定位核核線粒體核核5′→3′聚合活性＋＋＋＋＋3′→5′外切活性－－－+－

功能復(fù)制、引發(fā)修復(fù)復(fù)制延長鏈復(fù)制，解螺旋酶活性修復(fù)

ε

δ真核生物DNA的復(fù)制WP426

ZP49（1）組蛋白的合成在細(xì)胞核中與DNA復(fù)制同步進(jìn)行（2）組蛋白八聚體在DNA復(fù)制時并不離開親本DNA鏈。（3）組蛋白八聚體以全保留方式傳給子代（4）組蛋白八聚體先與前導(dǎo)鏈結(jié)合。

放線菌酮cycloheximideA.蛋白質(zhì)合成抑制劑（放線菌酮）抑制實(shí)驗(yàn)

組蛋白八聚體以全保留方式傳給子代組蛋白八聚體先與導(dǎo)鏈結(jié)合。新老八聚體在子代鏈上的分布復(fù)制原點(diǎn)老新先導(dǎo)鏈后隨鏈

DNA復(fù)制需要引物，但在線形DNA分子末端不可能通過正常的機(jī)制在引物被降解后合成相應(yīng)的片段.如果沒有特殊的機(jī)制合成末端序列，染色體就會在細(xì)胞傳代中變得越來越短。這一難題是通過端粒酶的發(fā)現(xiàn)才得到了澄清。端粒(telomere)指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)。功能?維持染色體的穩(wěn)定性?維持DNA復(fù)制的完整性結(jié)構(gòu)特點(diǎn)?末端DNA序列是多次重復(fù)的富含G、C堿基的短序列。形式為：5’（TxGy）n，3’(AxCy)n，x和y一般為1-4。

TG常比AC鏈長，形成3’單鏈末端。

TTTTGGGGTTTTGGGG…三.端粒的復(fù)制端粒末端的重復(fù)序列，通過端粒酶將其加到染色體末端。端粒酶含有RNA和蛋白質(zhì)合酶兩種組分，RNA分子約150bp，含有多個CyAx重復(fù)序列，RNA分子用作端粒TxGy鏈合成的模板。端粒酶是一種反轉(zhuǎn)錄酶，它只合成與酶自身的RNA模板互補(bǔ)的DNA片段，使復(fù)制以后的線形DNA分子的末端保持不變。端粒合成的一種模型

3′5′TTTTGGGGTTTTG5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCAAA3′5′TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCAAATTGGGTGGGT3′5′AATTTTG5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCAGTTTTG整合和雜交移位和再雜交繼續(xù)延伸WP426DNA聚合酶復(fù)制子鏈進(jìn)一步加工非標(biāo)準(zhǔn)G-G配對回折

人類體細(xì)胞的端粒長度，隨個體年齡增加而逐漸縮短。細(xì)胞每分裂一次，端粒縮短50-200bp，短至1-4Kbp時，細(xì)胞就停止分裂。若能重建端粒，則細(xì)胞可以永遠(yuǎn)分裂。惡性腫瘤細(xì)胞端粒酶表達(dá)多。端粒酶抑制劑-抗癌治療的新靶點(diǎn)。細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂細(xì)胞衰老端粒酶永生化抗腫瘤靶點(diǎn)抗衰老

端粒酶重新引入a、復(fù)制子的大小:EukaryoticDNA: 平均100kbProkaryoticDNA: >1000kbb、岡崎片段

EukaryoticDNA: 100-200bpProkaryoticDNA:1000-2000bpc、復(fù)制速度

EukaryoticDNA: 3,000bp/minProkaryoticDNA: 50,000bp/min原核生物和真核生物DNA復(fù)制的比較1.Semi-conservativereplication2.Semi-discontinuousrepliction3.DNAhelicase,SSB4.RNApriming5.校正閱讀（Proofreading）1.復(fù)制起點(diǎn)（單、多）2.復(fù)制子（大小、多少）3.復(fù)制叉移動的速度(900/50nt/S)4.岡崎片段的大小5.端粒和端粒酶6.DNA聚合酶Polymerases相同點(diǎn)：不同點(diǎn)：三.真核和原核DNA細(xì)胞復(fù)制比較第三節(jié).逆轉(zhuǎn)錄作用WP493

ReverseTranscription1、概念

以RNA為模板合成DNA，這與通常轉(zhuǎn)錄過程中遺傳信息從DNA到RNA的方向相反，故稱為逆轉(zhuǎn)錄作用。RNADNA

逆轉(zhuǎn)錄酶2、逆轉(zhuǎn)錄酶

(reversetranscriptase)

三種功能依賴DNA指導(dǎo)下的DNA聚合酶活力依賴RNA的DNA聚合酶活力核糖核酸酶H活力模板：RNA或DNA

以自身病毒類型的RNA為模板時，該酶的反轉(zhuǎn)錄活力最大，但是帶有適當(dāng)引物的任何種類的RNA都能作為合成DNA的模板。引物：RNA或DNA底物：dNTP二價陽離子：Mg2+或Mn2+逆轉(zhuǎn)錄過程中cDNA的合成

依賴RNA的DNA聚合酶核糖核酸酶H活力依賴DNA的DNA聚合酶前病毒負(fù)鏈正鏈3.反轉(zhuǎn)錄過程

當(dāng)致癌RNA病毒侵染宿主細(xì)胞時，病毒RNA及反轉(zhuǎn)錄酶一起進(jìn)入宿主細(xì)胞，病毒自身帶入的反轉(zhuǎn)錄酶使RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA。以病毒RNA為模板，合成互補(bǔ)的（-）DNA。核糖核苷酸酶H專一切除切除RNA—DNA雜種分子中的RNA。以（-）DNA鏈為模板，合成（+）DNA鏈,成為cDNA。反轉(zhuǎn)錄病毒只有整合到宿主染色體DNA后,才具有侵染性。前病毒DNA進(jìn)行復(fù)制,用其負(fù)鏈(依賴DNA的RNA聚合酶)轉(zhuǎn)錄出功能基因RNA、基因組RNA，合成病毒蛋白。

基因組RNA和病毒蛋白在胞質(zhì)中組裝成新病毒粒子，轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜，通過出芽方式釋放新病毒粒子。逆逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期生活周期RNA衣殼被膜逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)譯整合入宿主細(xì)胞染色體DNA進(jìn)入細(xì)胞丟失被膜丟失衣殼逆轉(zhuǎn)錄RNARNAcDNA衣殼蛋白被膜蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶互補(bǔ)的DNA第四節(jié)DNA的損傷及修復(fù)

WP427ZP51一些物理化學(xué)因子如紫外線、電離輻射和化學(xué)誘變劑均可引起DNA損傷，破壞其結(jié)構(gòu)與功能。然而在一定條件下，生物機(jī)體能使這種損傷得到修復(fù)。一.損傷的兩種類型：1.單個堿基改變影響DNA序列但不改變DNA的整體結(jié)構(gòu)。ZP54圖2-30

當(dāng)DNA雙鏈被分開時不影響轉(zhuǎn)錄或復(fù)制。所以這些改變通過DNA序列變化的后果對更多的世代產(chǎn)生破壞作用。這種影響是由于一個堿基轉(zhuǎn)變成了另一個堿基，而此堿基不能與原互補(bǔ)堿基正常配對。

如胞嘧啶脫氨基作用(自發(fā)地或化學(xué)誘變劑)產(chǎn)生一個錯配的U·G對；而一個復(fù)制錯誤即插入腺嘌呤代替胞嘧啶從而產(chǎn)生一個A·U對。通過在一個堿基上共價添加一個小基團(tuán)從而改變其堿基配對也能產(chǎn)生相似的結(jié)果。這些改變可以導(dǎo)致非常小的結(jié)構(gòu)扭曲(像U·G對的例子)或非常明顯的改變(象A·G對的例子)，但是共同的特征是這種錯配在下一次復(fù)制前就結(jié)束了。2.結(jié)構(gòu)扭曲產(chǎn)生物理性的損傷。

DNA一條鏈上堿基之間或相對鏈上堿基之間的共價連接能夠抑制復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。研究最多的例子是紫外線照射效應(yīng)，該效應(yīng)能在兩個毗鄰的胸腺嘧啶堿基之間引入共價鍵，產(chǎn)生圖中的鏈內(nèi)嘧啶二聚體。在一個堿基上添加一個巨大的加合物破壞雙螺旋結(jié)構(gòu)也可產(chǎn)生相似結(jié)果。紫外線可使DNA分子中同一條鏈上兩個相鄰的胸腺嘧啶堿基之間形成二聚體（TT），兩個T以共價鍵形成環(huán)丁烷結(jié)構(gòu)。CT、CC間也可形成少量二聚體（CT、CC），使復(fù)制、轉(zhuǎn)錄受阻。目前已知有5種酶修復(fù)系統(tǒng)：

光復(fù)活校正修復(fù)切除修復(fù)重組修復(fù)

SOS反應(yīng)后四種不需要光，又稱為暗修復(fù)一.光復(fù)活（直接修復(fù)）

WP428

1949年已發(fā)現(xiàn)光復(fù)活現(xiàn)象，可見光（最有效400nm）可激活光復(fù)活酶，此酶能分解由于紫外線形成的嘧啶二聚體。高等哺乳動物沒有此酶。

P252圖12-13紫外線損傷的光復(fù)活過程

NNCH3OORHPHROOCH3NNNNCH3OORHHNNCH3OORPUVTT光復(fù)活酶

1.形成嘧啶二聚體2、光復(fù)合酶結(jié)合于損傷部位3、酶被可見光激活4、修復(fù)后酶被釋放DNA紫外線損傷的光修復(fù)二.切除修復(fù)ZP53WP429在一系列酶的作用下，將DNA分子中受損傷部分切除，并以完整的那一條鏈為模板，合成出切去部分，DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)。1.結(jié)構(gòu)缺陷的修復(fù)（核苷酸切除修復(fù)）：ZP53（1）核酸內(nèi)切酶識別DNA損傷部位，在其附近將其切開。（2）核酸外切酶切除損傷的DNA。（3）DNA聚合酶修復(fù)。（4）DNA連接酶連接。2.E.coli切除修復(fù)的uvr系統(tǒng)包括3個基因：uvrA

，B，C，編碼一個修復(fù)核酸內(nèi)切酶的成分。（1)UvrAB組分識別嘧啶二聚體和其他較大的損傷。然后UvrA解離(需要ATP)，（2）UvrC

與UvrB

結(jié)合。UvrBC

重組使損傷兩邊都產(chǎn)生一個切口，UvrC

在損傷5’端的第8個核苷酸處切開，UvrB

在3’端的第5個核苷酸處切開，需要ATP。切除的DNA長度平均約為12-13個核苷酸，（人類切除的DNA長度27-29個）。

UvrD

是一個解旋酶，能使DNA解旋以釋放兩個切口之間的單鏈。UvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶ⅠOHP是細(xì)胞內(nèi)最重要和有效的修復(fù)機(jī)制，主要由DNA-polⅠ和連接酶完成。DNA連接酶ATPE.coli的切除修復(fù)機(jī)制DNA聚合酶ε真核2.無嘌呤無嘧啶修復(fù)(堿基切除修復(fù))

甲基磺酸甲酯可使鳥嘌呤第7位氮原子烷基化，活化β—糖苷鍵，造成脫嘌呤作用；酸也能使DNA脫嘌呤。

DNA復(fù)制時，DNA聚合酶對dTTP和dUTP分辨力不高，有少量dUTP摻入DNA鏈。細(xì)胞中的尿嘧啶-N-糖苷酶可以切掉尿嘧啶。腺嘌呤脫氨形成次黃嘌呤時也可以被次黃嘌呤-N-糖苷酶切掉次黃嘌呤。對于無嘌呤無嘧啶位點(diǎn)（AP位點(diǎn)）的損傷的修復(fù)方法：

AP核酸內(nèi)切酶切開，核酸外切酶切除包括AP位點(diǎn)核苷酸在內(nèi)的小片斷DNA，DNA聚合酶I修復(fù)合成新片斷，DNA連接酶連接。DNA的損傷和切除修復(fù)堿基丟失堿基缺陷或錯配結(jié)構(gòu)缺陷切開核酸內(nèi)切酶核酸外切酶切除DNA聚合酶DNA連接酶AP核酸內(nèi)切酶核酸外切酶切開切除修復(fù)連接糖苷酶三.重組修復(fù)切除修復(fù)發(fā)生在DNA復(fù)制之前，而當(dāng)DNA發(fā)動復(fù)制時尚未修復(fù)的損傷部位，可以先復(fù)制，再重組修復(fù)。受損傷的DNA在進(jìn)行復(fù)制時，跳過損傷部位，在子代DNA鏈與損傷相對應(yīng)部位出現(xiàn)缺口。通過分子間重組，從完整的母鏈上將相應(yīng)的堿基順序片段移至子鏈的缺口處，然后再用合成的多核苷酸來補(bǔ)上母鏈的空缺，此過程即重組修復(fù)。并非完全校正。重組修復(fù)至少需要4種酶組分。重組基因recA編碼一種分子量為40000的蛋白質(zhì)，它具有交換DNA鏈的活力。RecA蛋白被認(rèn)為在DNA重組和重組修復(fù)中均起關(guān)鍵作用。此外，修復(fù)合成還需要DNA聚合酶和連接酶。DNA的重組修復(fù)胸腺嘧啶二聚體復(fù)制核酸酶及重組蛋白修復(fù)復(fù)制DNA聚合酶DNA連接酶重組

四.錯配修復(fù)（校讀作用）

WP428ZP52如果修復(fù)的目標(biāo)是由于突變產(chǎn)生的一個正常堿基的錯誤配對堿基，那就會引出一個問題：修復(fù)系統(tǒng)本身并不知道哪個是野生型堿基哪個是突變體！它所看到的只是兩個不合適配對的堿基，兩個堿基中的一個是切除修復(fù)的靶位。5-甲基胞嘧啶脫氨基作用變成胸腺嘧啶后，由一個特殊的系統(tǒng)可以恢復(fù)其正確的序列。脫氨基作用產(chǎn)生了一個G·T對，修復(fù)系統(tǒng)偏向于其變?yōu)镚·C對(而不是A·T)。VSP系統(tǒng)負(fù)責(zé)這種反應(yīng)，它包括可以從G·T中去除T的mutL

、S系統(tǒng)。當(dāng)大腸桿菌復(fù)制過程中發(fā)生錯配時，區(qū)別原始DNA鏈?zhǔn)强尚械摹am基因編碼腺嘌呤甲基化酶，此酶負(fù)責(zé)5’GATC序列中A的甲基化。DNA在復(fù)制起始時幾秒鐘，母鏈就會甲基化，剛結(jié)束時，只有原始親本鏈帶有甲基。在剛合成的鏈等待引進(jìn)甲基期間的半甲基狀態(tài)可用于區(qū)分模板鏈和原始鏈。修復(fù)機(jī)制1）MutS二聚體特異性地識別并結(jié)合到錯配位點(diǎn)，MutL二聚體與MutS二聚體結(jié)合，水解ATP沿DNA鏈移動，識別GAmTC

序列后，使DNA形成環(huán)狀。2）MutH核酸內(nèi)切酶與MutSL復(fù)合物結(jié)合。然后核酸內(nèi)切酶切割未甲基化的鏈，從GATC位點(diǎn)到錯配位點(diǎn)之間的序列被切除。3）切除可以按5’-3’方向進(jìn)行(利用RecJ或內(nèi)切核酸酶VII)，也可以按3’-5’方向進(jìn)行(利用內(nèi)切核酸酶I或內(nèi)切核酸酶X)，解旋酶進(jìn)行輔助。4）鏈的切除可達(dá)1000個核苷酸以上，新鏈?zhǔn)怯蒁NA聚合酶III合成的，DNA連接酶連接完成。五.誘導(dǎo)修復(fù)和應(yīng)急反應(yīng)（SOS反應(yīng)）

WP431ZP55★誘導(dǎo)修復(fù)是細(xì)胞DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷或DNA復(fù)制系統(tǒng)受到抑制的緊急情況下，為求得生存而出現(xiàn)的一系列誘導(dǎo)性修復(fù)，稱ＳＯＳ修復(fù)。50年代，Weigle發(fā)現(xiàn)如果將經(jīng)UV照射的λ噬菌體感染經(jīng)UV輕度照射的E.coli可以看到噬菌體的存活數(shù)和突變型都比感染不經(jīng)UV照射的E.coli為高(W-效應(yīng)）。這一事實(shí)說明經(jīng)UV輕度照射的E.coli細(xì)胞中誘導(dǎo)出現(xiàn)一種對于噬菌體DNA損傷修復(fù)的功能，可是在修復(fù)的過程中卻帶來了基因突變。（w-誘變效應(yīng)）

★SOS反應(yīng)誘導(dǎo)的修復(fù)系統(tǒng)包括避免差錯的修復(fù)（無差錯修復(fù)）和傾向差錯的修復(fù)。★避免差錯的修復(fù)：SOS反應(yīng)能誘導(dǎo)光復(fù)活、切除修復(fù)和重組修復(fù)中某些關(guān)鍵酶和蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，從而加強(qiáng)光復(fù)活、切除修復(fù)和重組修復(fù)的能力，這屬于避免差錯的修復(fù)?！飪A向差錯的修復(fù)：

SOS反應(yīng)還能誘導(dǎo)產(chǎn)生缺乏校對功能的DNA聚合酶(DNA聚合酶IV和V)

，它能在DNA損傷部位進(jìn)行復(fù)制而避免了死亡，可是卻帶來了高的突變率，這屬于傾向差錯的修復(fù)。1.SOS反應(yīng)是由RecA蛋白和LexA阻遏物相互作用引起的。

RecA蛋白不僅在同源重組中起重要作用，而且它也是SOS反應(yīng)的最初發(fā)動因子。在有單鏈DNA和ATP存在時，RecA蛋白被激活而表現(xiàn)出蛋白水解酶的活力，它能分解λ噬菌體的阻遏蛋白和LexA蛋白。LexA蛋白（22Kd）許多基因的阻遏物，

當(dāng)它被RecA的蛋白水解酶分解后就可以使一系列基因得到表達(dá)其中包括紫外線損傷的修復(fù)基因uvrA、uvrB、uvrC（分別編碼核酸內(nèi)切酶的亞基）以及recA和lexA基因本身，還有單鏈結(jié)合蛋白基因ssb，與λ噬菌體DNA整合有關(guān)的基因himA、與誘變作用有關(guān)的基因umuDC、dinB(分別編碼DNApolV、DNApolIV)，與細(xì)胞分裂有關(guān)的基因sulA，ruv。2.SOS反應(yīng)過程：1）誘導(dǎo)前:LexA阻遏蛋白,RecA蛋白可少量的合成.2）誘導(dǎo)：X-射線，紫外線，烷化劑，黃曲霉素等造成DNA損傷，（單鏈DNA是誘導(dǎo)信號，使RecA蛋白激活，并結(jié)合上去，分解LexA阻遏蛋白和λ阻遏蛋白，使與SOS有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，合成蛋白，進(jìn)行SOS修復(fù)。3）誘導(dǎo)狀態(tài)：修復(fù)基因uvrA、uvrB、uvrC（分別編碼核酸內(nèi)切酶的亞基，加強(qiáng)切除修復(fù)，sulA細(xì)胞分裂有關(guān)。4）恢復(fù)狀態(tài):由于修復(fù)使原有信號消失，誘導(dǎo)物不再存在，RecA蛋白重新回到不激活狀態(tài)SOS反映有關(guān)的基因又被阻遏。SOS反應(yīng)的機(jī)制未誘導(dǎo)的細(xì)胞靶基因lexA基因被LexA

蛋白質(zhì)部分阻遏recA基因被LexA

蛋白質(zhì)部分阻遏（40個不同的位點(diǎn)被阻遏）LexA(阻遏物)

RecA(輔蛋白酶)靶基因表達(dá)lexA靶基因表達(dá)

但產(chǎn)物被分解recA大量表達(dá)RecA促使分解LexA誘導(dǎo)的細(xì)胞單鏈DNAATP3.SOS反應(yīng)與細(xì)胞分裂4.SOS反應(yīng)與DNA復(fù)制：兩種特殊形式的復(fù)制

A.依賴于發(fā)生變化的DNA聚合酶(無3’5’

的外切酶活力）的復(fù)制突變酶引入非配對堿基的量是正常酶的10倍。產(chǎn)生變異。

B.不依賴于蛋白質(zhì)合成而發(fā)動的DNA復(fù)制

SOS誘導(dǎo)物能使復(fù)制體解體的酶不出現(xiàn)或通過激發(fā)RecA蛋白分解這種酶。5.SOS修復(fù)的生理意義：

DNA修復(fù)、導(dǎo)致變異SOS反應(yīng)廣泛存在于原核生物和真核生物，它是生物在極為不利的環(huán)境中求得生存的一種基本功能。然而癌變有可能也是通過SOS反應(yīng)造成的，因?yàn)槟芤餝OS反應(yīng)的作用劑通常都具有致癌作用，如X-射線，紫外線，烷化劑，黃曲霉素等，這種修復(fù)特異性低，對堿基的識別、選擇能力差。通過SOS修復(fù)，復(fù)制如能繼續(xù)，細(xì)胞是可存活的。然而DNA保留的錯誤較多，導(dǎo)致較廣泛、長期的突變。遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變而引起的遺傳信息改變，均可稱為突變。在復(fù)制過程中發(fā)生的DNA突變稱為DNA損傷(DNAdamage)。從分子水平來看，突變就是DNA分子上堿基的改變。

第五節(jié).基因突變一.突變的概念○基因突變（genemutation）：是指一個基因內(nèi)部可以遺傳的結(jié)構(gòu)改變，是基因分子內(nèi)部在某種條件作用下所發(fā)生的一個或幾個核苷酸的改變，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)蛋白或酶的改變，從而影響有機(jī)體的大小、品質(zhì)、顏色、結(jié)構(gòu)和生長率等性狀的改變?；蛲蛔円话阍谌旧w結(jié)構(gòu)上是看不到的，所以又稱點(diǎn)突變（pointmutation）?！鹜蛔凅w（mutant）或稱突變型：由于基因突變而表現(xiàn)突變性狀的細(xì)胞或個體。

維多利亞女王與尼古拉二世

英國女王維多利亞。她帶有血友病的基因，并將其傳給了她的兒女。血友病是一種遺傳性凝血障礙疾病，患者可能因很小的傷口而出血不止導(dǎo)致死亡。血友病在女性一般表現(xiàn)為隱性遺傳，較少發(fā)病，但會傳給后代；在男性則表現(xiàn)為顯性遺傳，顯示出病癥。維多利亞女王在科堡主持的一次歐洲王室成員集會，與會者有17人是她的后裔，其中有她的孫女亞歷山德拉（21），她同俄國沙皇尼古拉二世結(jié)婚，導(dǎo)致他們的兒子患有血友病。

突變的類型（一）自發(fā)突變★在自然狀況產(chǎn)生的突變

1.在DNA復(fù)制中造成錯誤

1）錯義突變（誤義突變）——指DNA分子中堿基的替換，使蛋白質(zhì)分子中某一種氨基酸轉(zhuǎn)換為另一種氨基酸的突變類型。堿基替換有兩種類型：轉(zhuǎn)換：一個嘧啶堿取代另一個嘧啶堿，或一個嘌呤堿取代另一個嘌呤堿，這種置換方式稱為轉(zhuǎn)換。顛換：一個嘧啶堿取代另一個嘌呤堿，或一個嘌呤堿取代另一個嘧啶堿，這種置換方式稱為顛換。例如人的正常血紅蛋白（HbA）變成廉形紅細(xì)胞貧血（HbS）以及地中海貧血（HbC），到人的血紅蛋白的β鏈的第六位氨基酸一個堿基改變引起的基因突變。

1949年波林發(fā)現(xiàn)鐮刀型細(xì)胞貧血癥（病人的紅血細(xì)胞為鐮刀形）與血紅蛋白結(jié)構(gòu)異常相關(guān)。

2）移碼突變在DNA鏈中插入或缺失一個或幾個堿基引起閱讀框改變，造成氨基酸改變或終止密碼子位置改變。3）無義突變（nonsensemutation）：是指由于突變而使其某一編碼子突變?yōu)榻K止密碼子（UGA,UAG，UGG）。4）缺失、插入和框移缺失：一個堿基或一段核苷酸鏈從

DNA大分子上消失。插入：原來沒有的一個堿基或一段核苷酸鏈插入到DNA大分子中間?？蛞仆蛔兪侵溉?lián)體密碼的閱讀方式改變，造成蛋白質(zhì)氨基酸排列順序發(fā)生改變。

缺失或插入都可導(dǎo)致框移突變。谷酪蛋絲5’……GCA

GUA

CAU

GUC……丙纈組纈正常5’……GAG

UAC

AUG

UC……缺失C缺失引起框移突變重排DNA分子內(nèi)較大片段的交換，稱為重組或重排。

2自發(fā)損傷自然產(chǎn)生的對DNA的損傷引起的基因突變。（1）脫嘌呤：堿基和脫氧核糖間的糖苷鍵受損，引起一個嘌呤從DNA上脫落。（2）脫氨基：胞嘧啶脫氨基后變?yōu)槟蜞奏ぃ纬蒅-C對變?yōu)锳-T對。（3）氧化性損傷堿基：活潑氧化物對DNA本身的氧化損傷，也能引起突變。

H

HA

H

C

CT

T

A

G

T

C氧化（二）、誘發(fā)突變1.物理因素誘變只限于各種電離輻射和非電離輻射1）電離輻射誘變

包括射線、射線和中子等粒子輻射，還包括r射線和射線等電磁波輻射。中子的誘變效果最好。2.化學(xué)因素誘變

1)簡史

1941年第一次發(fā)現(xiàn)芥子氣可以誘發(fā)基因突變。

1943年第一次發(fā)現(xiàn)氨基甲酸乙酯(NH2COO2H5）可以誘發(fā)染色體結(jié)構(gòu)的變異

2)化學(xué)誘變的特點(diǎn)某些化學(xué)藥物的誘變作用是有特異性的，即一定性質(zhì)的藥物能夠誘發(fā)一定類型的變異?；瘜W(xué)因素3）化誘物質(zhì)的種類與作用機(jī)理

A.烷化劑：甲基磺酸乙酯[EMS，CH3