測(cè)定α淀粉酶活力的方法

試驗(yàn)五 激活劑、抑制劑、溫度及PH對(duì)酶活性的影響一、目的要求 通過(guò)試驗(yàn)加深對(duì)酶性質(zhì)的生疏，了解測(cè)定α-淀粉酶活力的方法。二、試驗(yàn)原理生物催化劑催化生化反響時(shí)具有：催化效率好、有高度的專一性、反響條件溫順、催化活力與輔基，輔酶，金屬離子有關(guān)等特點(diǎn)。能提高酶活力的物質(zhì)，稱為激活劑。激活劑對(duì)酶的作用有肯定的選擇性，其種類多為無(wú)機(jī)離子和簡(jiǎn)潔的有機(jī)化合物。使酶的活力中心的化學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化，導(dǎo)致酶的催化作用受抑制或喪失的物質(zhì)稱為酶抑制劑。氯離子為唾液淀粉酶的激活劑，銅離子為其抑制劑。應(yīng)留意的是激活劑和抑制劑不是確定的，有些物質(zhì)在低濃度時(shí)為某種酶的激活劑，而在高濃度時(shí)則為該酶的30%濃度時(shí)可抑制唾液淀粉酶的活性。酶促反響中，反響速度到達(dá)最大值時(shí)的溫度和PH值稱為某種酶作用時(shí)的最適溫度和PH值。溫度對(duì)酶反響的影響是雙重的：一方面隨著溫度的增加，反響速度也增加，直至最大反響速度為止；另一方面隨著溫度的不斷上升，而使酶逐步變性從而使反響速度降低。同樣，反響中某一PH范圍內(nèi)酶活力可達(dá)最高，在最適PH的兩側(cè)活性突然下降，其變化趨勢(shì)呈鐘形曲線變化。食品級(jí)α-淀粉酶是一種由微生物發(fā)酵生產(chǎn)而制備的微生物酶制劑，主要由枯草芽孢桿菌、PH、對(duì)α-淀粉酶屬水解酶，作為生物催化劑可隨機(jī)作用于直鏈淀粉分子內(nèi)部的α-1,4糖苷鍵，快速地將直鏈淀粉分子切割為短鏈的糊精或寡糖，使α-淀粉酶為液化淀粉酶。α-淀粉酶不能水解淀粉支鏈的α-1,6糖苷鍵，因此最終水解產(chǎn)物是麥芽糖、葡萄糖和α-1,6本試驗(yàn)通過(guò)淀粉遇碘顯藍(lán)色，糊精按其分子量的大小遇碘顯紫藍(lán)、紫紅、紅棕色，較小的〔少于6個(gè)葡萄糖單位α-淀粉酶作用于淀粉基質(zhì)的水解過(guò)程，從而了解酶的性質(zhì)以及動(dòng)力學(xué)參數(shù)。三、激活劑和抑制劑對(duì)唾液淀粉酶活力的影響〔一〕試劑及材料1、1：30唾液淀粉酶配置 用蒸餾水漱口，1min后收集唾液，以1：30倍蒸餾水稀釋。2、0.2%可溶性淀粉 稱取可溶性淀粉0.2g，預(yù)加20mL蒸餾水調(diào)勻，然后倒入80mL沸水中，連續(xù)煮沸至溶液透亮，冷卻后補(bǔ)水至100mL。3、1%NaCl溶液 稱取1.0g氯化鈉，加水溶解稀釋至100mL。4、1%CuSO4溶液 稱取1.0g硫酸銅，加水溶解稀釋至100mL。5、標(biāo)準(zhǔn)稀碘液 稱取11g碘，22g碘化鉀，置研缽中，參加適量的水研磨至碘完全溶解，并加水稀釋定容至500mL。吸取2mL上述碘液，參加10g碘化鉀，用水稀釋至500mL。〔二〕儀器設(shè)備 電熱恒溫水浴鍋。〔三〕操作方法取試管3根，編號(hào)后按下表配置試驗(yàn)樣液。試管 0.2%可溶 1%NaC 1%CuSO4 蒸餾水 混勻，放入 1：30唾液淀粉酶序號(hào)性淀粉l37水浴中12.0mL1.0mL//保溫10min。1.0mL22.0mL/1.0mL/馬上參加唾1.0mL32.0mL//1.0mL液淀粉酶。1.0mL用點(diǎn)滴管并不斷從試管中吸取樣液于比色白瓷板，用稀碘液檢驗(yàn)試管內(nèi)淀粉被淀粉酶水解的程度，記錄各試管內(nèi)樣液遇碘不顯藍(lán)色的先后挨次，解釋試驗(yàn)現(xiàn)象的緣由。四、溫度與PH值對(duì)α-液化淀粉酶活力的影響〔一〕試劑與材料12%可溶性淀粉溶液 稱取可溶性淀粉2.0g〔預(yù)先在105℃烘干預(yù)加20mL蒸餾水調(diào)勻，然后傾入80mL沸水中煮沸至溶液透亮，冷卻后定容至100mL。2、PH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0磷酸氫二鈉–檸檬酸緩沖溶液〔1〕0.2mol/mLNa2HPO4 稱取35.60gNa2HPO4.2H2O100mL?！?〕使用酸度計(jì)，用檸檬酸調(diào)整至所需的PH值。3、供試酶液的制備 稱取固體α-液化淀粉酶1.00g，參加PH6.0磷酸氫二鈉–檸檬酸緩沖溶液100mL(緩沖液的參加量視酶活力大小而定掌握酶解反響在5-10min內(nèi)完成)，于40℃恒溫水浴中活化0.5小時(shí)然后用3000rpm/min離心機(jī)離心分別5min，酶提取液于冰箱保存，供試驗(yàn)用。4、標(biāo)準(zhǔn)比色液〔CoCl.6H2O〕40.2439g0.4748500mL。乙液：稱取鉻黑T40.00mg，溶解并定容至100mL。使用時(shí)取甲液40.0mL、乙液5.0mL，混合。混合比色液宜放置冰箱保存，使用7天后重配置。5、標(biāo)準(zhǔn)稀碘液?！捕硟x器設(shè)備 電熱恒溫水浴鍋?！踩巢僮鞣椒?2、不同溫度對(duì)α-液化淀粉酶活力的影響取4根Φ25×200mm試管，按下表配制反響溶液。試管序號(hào)試管序號(hào)12342%可溶性淀粉20.0mL20.0mL20.0mL20.0mLPH6.0緩沖液5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL把四根試管分別放入50℃、60℃、70℃、80℃恒溫水浴中預(yù)熱10min分別加供試酶液0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL反響完成時(shí)間記50℃60℃70℃80℃錄〔min〕參加供試酶液后，馬上用秒表或手表記時(shí)，充分要?jiǎng)?，定時(shí)用點(diǎn)滴管從各反響試管中分別吸取1-2滴反響液，滴入預(yù)先盛有2/3稀碘液的比色白瓷板孔穴內(nèi)，從淀粉遇碘顯色的變化狀況，跟蹤淀粉在淀粉酶作用下被水解的過(guò)程，當(dāng)穴內(nèi)顏色反響由紫色漸漸變?yōu)榧t棕色，與標(biāo)準(zhǔn)比色液的顏色一樣時(shí)，即達(dá)反響終點(diǎn)，記錄酶解反響完成所需時(shí)間。3、不同PH值對(duì)α-液化淀粉酶活力的影響取5根Φ25×200mm試管，按下表配制反響溶液。序號(hào)2%可溶性淀粉緩沖溶液供試酶液 反響完成時(shí)間記〔min〕120mLPH4.0 5.0恒溫水0.5mLmL浴60℃320mLPH6.0 5.0mL預(yù) 熱10min。0.5mL420mLPH7.0 5.00.5mLmL520mLPH8.0 5.00.5mLmL試管其它操作與溫度對(duì)酶活力影響試驗(yàn)一樣。試管五、結(jié)果計(jì)算和爭(zhēng)論淀粉酶活力單位定義為 在肯定條件下，1g酶制劑1小時(shí)內(nèi)液化可溶性淀粉的克數(shù)。酶活力單位(U/g)=60200.021 nt 0.5——可溶性淀粉的用量m；——酶解反響完成所需的時(shí)間mi；——測(cè)定時(shí)稀釋酶液用量m；——可溶性淀粉溶液的濃度；n——酶制劑稀釋倍數(shù)1、不同溫度對(duì)α-液化淀粉酶活力影響的結(jié)果記錄試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果50℃60℃70℃80℃2、不同pH值對(duì)α-液化淀粉酶活力影響的結(jié)果記錄試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果pH4.0pH6.0pH7.0pH8.0分別以PH值、溫度為橫坐標(biāo)，以酶活力單位為縱坐標(biāo)，繪制PH值—酶活力單位、溫度—酶活力單位圖。爭(zhēng)論分析試驗(yàn)結(jié)果。六、思考題1、從試驗(yàn)操