種子生活力和活力測定

第五章種子生活力和活力測定第五章種子生活力與活力測定本章講2節(jié)§1、種子生活力測定原理及方法§2、種子活力測定原理及方法第一節(jié)種子生活力測定的原理與方法在種子貿(mào)易中，時常需要在短時間內(nèi)把握種子批的生活力狀況，假設(shè)種子處于休眠狀態(tài)難以通過發(fā)芽測定得到結(jié)果，種子生活力測定可以滿足這一要求。一、種子生活力概念：種子生活力(seedviability)指種子發(fā)芽的潛在力量或種胚具有的生命力；種子生活力和發(fā)芽具有不同的含義：一些休眠種子在發(fā)芽試驗中不能發(fā)芽，但它是有生活力的，破除休眠后，能長成正常幼苗。而生活力反映的是種子發(fā)芽率和休眠種子百分率的總和。所以，種子生活力測定，反映的是種子批的最大發(fā)芽潛力。二、種子生活力測定的意義1、測定休眠種子的生活力收獲的或在低溫貯藏處于休眠狀態(tài)的種子，正常發(fā)芽條件下，其發(fā)芽力很低，這種狀況下，僅用發(fā)芽試驗測定其發(fā)芽率，就不行能測出種子的最高發(fā)芽率。必需進展生活力測定，了解種子的發(fā)芽潛力，合理利用種子?！苍鯓永茫俊巢シN之前對發(fā)芽率低而生活力高的種子，應(yīng)進展適當處理后播種。種子檢驗時，發(fā)芽試驗?zāi)┢谟蟹f不發(fā)芽的種子或硬實種子，就應(yīng)接著進展生活力測定；或破除休眠后做發(fā)芽試驗。2、快速推測種子的發(fā)芽力:休眠種子可借助于各種預(yù)處理打破休眠，進展發(fā)芽試驗，但時間較長；而種子貿(mào)易中，因時間緊迫，不行能承受標準發(fā)芽試驗來測定發(fā)芽力，由于發(fā)芽試驗所需的時間較長。如小麥8d，水稻14d，菠菜21d。而多數(shù)林木種子則需要更長的時間〔如月季15～25℃發(fā)芽，70d計算發(fā)芽率〕。這時，可用生物化學(xué)法測定種子生活力作為參考；而林木種子可用生活力來代替發(fā)芽力。種子生活力測定方法有四唑染色法、靛藍染色法、紅墨水染色法、軟X本節(jié)將重點介紹四唑染色法，并簡要介紹其他方法。三、四唑測定法〔GB〕(一)四唑測定法概述1、進展簡史四唑測定法于1942年由德國G.Lakon(萊康)教授制造，二戰(zhàn)期間傳人美國。ISTA1950年成立四唑測定技術(shù)委員會，1953年首次將四唑測定列入國際種子檢驗規(guī)程，主持編寫《四唑測定手冊》，經(jīng)過屢次ISTA會議爭論修改，于1984年正式公布發(fā)行。該手冊集合了650多個種屬的具體測定技術(shù)，是四唑測定的權(quán)威性參考書。目前國際和國家檢驗規(guī)程都將其列于正式檢驗工程，它是測定種子生活力公認的最有效的方法。2、四唑測定方法的特點四唑測定是一種世界公認、省時快速、結(jié)果牢靠的種子生活力測定方法。有以下幾個特點：原理牢靠，結(jié)果準確：主要是按胚的染色圖形來推斷種子的死與活，該技術(shù)已進展成熟。假設(shè)能正確使用四唑測定方法，四唑測定3～5％。不受休眠限制：利用種子內(nèi)部的復(fù)原反響顯色來推斷種子的死與活，不受休眠限制。方法簡便，省時快速：所需儀器設(shè)備和物品較少〔恒溫箱、培育皿、刀片、鑷子、放大鏡和四唑藥品等〕。測定方法也較為簡便，一般只需6～24h就能獲得結(jié)果。特別是同發(fā)芽試驗相比是很快的。4〕本錢低廉：由于四唑測定所需儀器、物品少和方法簡便，所以每個樣品測定所花本錢很低。四唑測定也有缺陷：對種子檢驗員閱歷和技能要求較高；結(jié)果不能供給休眠的程度。3、適用范圍：依據(jù)1996國際種子檢驗規(guī)程，四唑測定適用于以下范圍：〔p61〕(1)測定深度休眠種子；收獲后需馬上播種的種子；發(fā)芽緩慢的種子；要求估測發(fā)芽潛力的種子。另外，也適用于：(2)測定發(fā)芽末期未發(fā)芽種子的生活力，特別是疑心有休眠時。(3)測定種子收獲或加工過程中的種子損傷的緣由(如熱害、機械損傷、蟲蛀等)。(4)解決發(fā)芽試驗中存在的問題，如查明不正常幼苗產(chǎn)生的緣由；疑心殺菌劑、種子包衣的處理效果等。(二)、四唑測定法的原理有生活力的種子活細胞內(nèi)有脫氫酶，可與氧化復(fù)原反響指示劑：四唑〔無色〕反響而顯色，被復(fù)原成為紅色、穩(wěn)定的三苯基甲臘(triphenylformazam)?？梢罁?jù)四唑染成的顏色和部位，區(qū)分種子紅色的有生活力局部和無色的死亡局部。除了完全染色的有生活力種子和完全不染色的無生活力種子外，還可能消滅一些局部染色的種子。說明在不同部位存在面積大小不同的壞死組織。推斷種子有無生活力，主要看胚和胚乳不染色壞死組織的部位及面積大小，而不完全取決于染色的深淺。染色的深淺可以區(qū)分強健程度。即染色愈深，種子生活力愈旺盛。四唑染色是一酶促反響，反響不僅受酶活性的影響，還受底物濃度、反響溫度、pH(三)、四唑測定法應(yīng)用的化學(xué)試劑1、四唑四唑鹽類有多種，常用的是2，3，5—氯化三苯基四氮唑，｛英文2，3，5—triphenyltetrazo1iumchloride｝，縮寫為TTC?！?〕特性①白色或淡黃色粉劑，易溶于水，有微毒，使用時不要接觸〔少接觸〕。②見光易被復(fù)原成粉紅色，需用棕色瓶包裝，再裹一層黑紙。同樣，配好的四唑溶液也應(yīng)裝入棕色瓶里，暗處保存，種子染色也需在暗處和弱光處進展。四唑液濃度常用的四唑染色濃度為0.1％～1.0％(m/v)．一般來說:0.1％～0.5％的四唑溶液；整個胚、整粒種子需用1.0％的四唑溶液。pH:pH要求在6.5～7.5pH不在此范圍，反響不能正常進展。因此，對于游離酸含量高的四唑應(yīng)當用緩沖液配制。即一般國產(chǎn)的四唑游離酸含量高，要用緩沖液配制〔進口的可直接用蒸餾水配制〕。配制方法：稱取lg〔或0.1g〕四唑粉劑溶解于100mL磷酸緩沖1.0％〔0.1％〕的四唑溶液；當用酸度計測定時，假設(shè)四唑液的 pH值達不到要求，則可用稀NaOH或NaHCO3溶液加以調(diào)整。配好的四唑溶液應(yīng)保存在棕色瓶里，一般有效期可保持數(shù)個月。假設(shè)存放在冰箱里，有效期更長。2、磷酸緩沖液：其配方如下：ISTA及GB規(guī)程法：首先配兩種溶液，然后按比例混合即成。溶液I：稱取9.078gKH2PO4〔磷酸二氫鉀)溶解于l000ml蒸餾9.472gNa2HPO4〔磷酸氫二鈉)或11.876gNa2HPO4.2H2O溶解于1000mL蒸餾水之中。然后取溶液I：23以上比較麻煩，也可用北美官方種子檢驗規(guī)程：AOSA規(guī)程法：在1000mL蒸餾水中參加5.450gNaH2PO43.790gNa2HPO43、乳酸苯酚透亮液：用于染色后的小粒豆類和牧草種子，經(jīng)四唑染色后使種皮、稃殼或胚乳變得透亮，以便透過這些局部清楚地觀看其胚的染色狀況。配法：20mL乳酸＋20mL苯酚(假設(shè)苯酚是結(jié)晶形式，則需溶化為液體)＋40mL20mL該藥液有毒性，在使用時防止觸及皮膚或衣服等。配制時最好戴塑膠薄膜手套，并在通風櫥里操作?！菜摹?、四唑測定法的程序參照 96版《國際種子檢驗規(guī)程》及95GB:1、試驗樣品：隨機數(shù)取凈種子100粒，2～4次重復(fù)〔GB2～4次重復(fù)，ISTA4〕2、種子預(yù)處理〔預(yù)措預(yù)濕〕目的：大局部種子在測定前都需經(jīng)過預(yù)處理。目的：使種子加快和充分吸濕，軟化種皮，便利樣品預(yù)備，促進酶的活化，以提高染色的均勻度、鑒定的牢靠性和正確性。由于種子吸濕后，切開、針挑種皮或切開養(yǎng)分組織變得簡潔，而干種子則工作困難，并且活細胞內(nèi)的酶尚未活化，染色效果不良。因此，預(yù)措預(yù)濕對正確測定是很重要的。預(yù)措：指在種子預(yù)濕前除去種子外部的附屬物。包括剝?nèi)ス麣ず驮诜N子非要害部位弄破種皮。如水稻種子需脫去稃殼；花生剝?nèi)ス麣?；豆科硬實種子需刺破種皮等。留意：預(yù)措不能損傷種子內(nèi)部胚的主要構(gòu)造。而大多數(shù)種子則不需預(yù)措處理。預(yù)濕：是四唑染色測定的必要步驟。由于吸賬種子一般比干種子不易裂開，比較簡潔切開或刺破種皮。目前常用預(yù)濕方法有二種：①緩慢吸濕：將種子放在紙上或紙間吸濕。適用于：直接浸在水中簡潔裂開的種子；已經(jīng)劣變的種子〔陳種子〕；過分枯燥的種子。緩慢吸濕，能較好地解決吸濕和供氧的沖突。GB規(guī)定：像大豆、菜豆、蔥、花生等種子要求緩慢紙床預(yù)濕。禾谷類種子既可水浸預(yù)濕，也可緩慢紙床預(yù)濕。緩慢預(yù)濕可承受下面兩種方法：a紙床上預(yù)濕：小粒豆類種子，如苜蓿、三葉草等種子。b紙卷或紙間預(yù)濕：像大豆、菜豆、豌豆等種子。②快速水浸預(yù)濕：將種子完全浸入水中，充分吸脹。由于種子直接浸入水中，吸水快、吸水均勻，可縮短預(yù)濕時間。適用于種子直接浸入水中，不會造成組織裂開的種子。包括水稻、麥類、玉米等。浸種溫度一般承受20℃～30℃水溫。具體種類和浸種時間見《農(nóng)作物種子四唑染色技術(shù)規(guī)定》。3、染色前的種子處理種子在染色前需將胚的主要構(gòu)造和活的養(yǎng)分組織暴露出來，利于四唑溶液滲透，便于正確鑒定?！瞤63圖5－1〕說明種子不同切法的部位，常見的有以下幾種：不須樣品預(yù)備：a、種皮滲水性良好的小粒豆類種子〔如紫花苜蓿和小扁豆等〕，染色時就能隨著四唑溶液的滲入而吸脹，并在染色后剝?nèi)シN皮就可正確鑒定。這類種子不須樣品預(yù)備。b、大粒豆類：可承受緩慢吸濕后不須樣品預(yù)備?！踩绮硕购痛蠖沟取车谌旧笥^看鑒定前也需剝?nèi)シN皮，以便鑒定更為牢靠?！?〕沿胚縱切取半粒：適用于具有直立胚的大粒禾本科種子。如玉米、麥類和水稻等種子。方法：沿胚縱切，使胚的主要構(gòu)造暴露出來，取其一半用于染色觀看。〔3〕剝?nèi)シN皮：棉花、十字花科種子需剝?nèi)シN皮或內(nèi)膜；瓜類也剝?nèi)シN皮。方法是：將預(yù)濕后的整個種皮剝?nèi)ァ?、四唑染色將處理好的種子放在小燒杯內(nèi)，然后參加適宜濃度的四唑溶液，以漂浮種子為度，移至肯定溫度的黑暗恒溫箱內(nèi)進展染色反響。染色時間：因種子種類、樣品預(yù)備方法、生活力的強弱、四唑溶液濃度、pH值和溫度等因素的不同而有差異，其中溫度影響最大。在20～45℃5℃，其染色時間可削減一半。例如：30℃適宜染色時間為6h，35℃3h，40℃1.5h35℃35℃染色：玉米、麥類等禾谷類種子0.5～1h3～4h剝?nèi)シN皮染色的種子2～3h具體見《農(nóng)作物種子四唑染色技術(shù)》。到達規(guī)定時間或染色已很明顯時，倒去四唑液，用水沖洗。假設(shè)到達規(guī)定時間種子染色仍不夠完全，可適當延長染色時間。5、鑒定前處理書上簡單不進展處理的種子，觀看前要適當處理使胚部暴露出來，具體處理方法規(guī)程中都有：〔p201-204〕如一些小粒豆類、棉籽沿胚中軸縱切；瓜類除去種皮和內(nèi)膜；大粒豆類〔大豆、菜豆、花生〕：除去種皮，掰開子葉，露出胚芽。大粒種子可直接用肉眼或放大鏡觀看；小粒種子最好用10～100倍體視鏡觀看。6、觀看鑒定測定結(jié)果的牢靠性取決于檢驗人員對染色組織和部位的正確識別、工作閱歷等綜合運用力量。觀看鑒定的主要目的是區(qū)分有生活力和無生活力種子。一般鑒定原則：a、但凡胚的主要構(gòu)造染成鮮紅色，為有生活力種子。b、但凡胚的主要構(gòu)造局部不染色，不染色局部超過允許范圍，為不正常種子。c、但凡完全不染色的為死種子。不正常種子和死種子均作為無生活力種子。觀看的部位：①禾谷類：主要觀看胚芽、胚軸、胚根、盾片。鑒別標準：除完全染色的為有生活力種子外，以下有殘缺的種子也有生活力：a、盾片上部或下部任一端不染色的局部＜1/3b、胚根的頂端：玉米1/3不染色；水稻、高粱2/3不染色；麥類大局部不染色，但不定根的原始體須染色。理解：胚芽必需染色，胚根不染色可以長出次生根。②豆類：有生活力的種子允許不染色的最大面積：a、胚根頂端不染色：花生為1/3；蠶豆為2/3；其他為1/2.b、子葉頂端不染色：花生為1/4；蠶豆為1/3；其他為1/2.c1/4，蠶豆除外。1/2；子葉頂端不染色允許1/2?！才哐勘匦枞旧尝芷渌N屬：〔棉屬、蕓苔屬等〕1/3子葉頂端1/3不染色。〔胚芽必需染色〕P70圖5－2小麥種子四唑測定結(jié)果的鑒定標準〔單子葉〕：圖中黑色局部表示染成紅色，有生活力組織，白色局部表示不染色的死組織。1－6有發(fā)芽力：1．整個胚染成鮮紅色；2～5．盾片末端不染色；胚根尖端不染色；7－16胚根3/4以上不染色8．胚芽不染色；〔一點也不行〕9．盾10．胚軸不染色；11．盾片末端和胚芽尖端不染色;12．胚的上半部不染色；13．盾片不染色；14．盾片、胚根和胚根鞘不染色；15．染成模16．整個胚不染色。圖5-3大豆種子四唑測定結(jié)果的鑒定結(jié)果標準1－31．胚染成鮮紅色；僅子葉遠離胚芽局部少量未染色;僅子葉下部和邊緣少許不染色；4－6子葉上部重要部位未染色；〔面積少也不行〕5．胚根主要部位不染色；6．子葉一半以上未染色。1農(nóng)作物種子四唑染色技術(shù)規(guī)定7、結(jié)果計算與處理依據(jù)樣品胚部的顯色狀況，分別計算各重復(fù)有生活力種子的百分率。GB/T3543.7-1995對試驗樣品的規(guī)定至少200粒：即2～4次重復(fù)。查重復(fù)間的最大允許差距:X1X2X3X4→求平均數(shù)X〔GB：但生活力有二、三次重復(fù)值；而發(fā)芽試驗無二、三次重復(fù)值〕XX≤容許差距結(jié)果正確用X表示。【例】測某種子生活力，三次重復(fù)95％、96％、98％。X＝96.3％；98－95＝37。95％、99％。X＝97％99－95＝4＜容許差距6?！参濉沉粢馐马棧嚎v切禾谷類種胚時，肯定要沿胚中部縱切，使切面顯示胚的各局部構(gòu)造，否則會消滅鑒定誤差。1、假設(shè)切面不正假設(shè)保存大的：胚芽是完整的，染色時間短，胚芽可能不染色。其他地方染色均勻，也屬正常有生活力的種子。假設(shè)保存小的：胚芽與盾片有縫，只要其他局部染色深、均勻，也有生活力。2、切面粗糙：切時剝開，局部細胞被撕開，細胞被破壞，表層細胞不染色。所以切面要光滑。這時染成乳白色與不染色是有區(qū)分的。〔p71離體胚培育法:主要測定發(fā)芽緩慢或休眠期長的種子生活力，主要用于林木種子，農(nóng)作物種子用的少?！乘?、染料染色法〔GB中無，了解〕同p73(一)測定原理〔TTC法：活細胞染成紅色；本法相反：活細胞不染色〕有生活力的種子，其活細胞原生質(zhì)膜具有選擇透性，當種子浸入染料后，染料大分子不能進入活細胞內(nèi)，其胚部活組織不能被染料染色；而死的種胚原生質(zhì)膜喪失選擇吸取力量，故可被染料染色。(二)測定方法1、靛藍染色法適用于豆類、谷類、棉花、瓜類和林木等大粒種子的生活力測定。試劑為靛藍：藍色粉劑，能緩慢溶于水。測定方法如下：(1)種子預(yù)處理：〔100×2〕先將種子去殼，浸入30℃水中，充分吸賬。浸種時間：小麥、大麥、大豆、豌豆和向日葵等為3h，4h6h，蓖麻、紅麻、大麻等7h；黍8h；水稻12h；玉米20h。然后，禾谷類沿胚中線縱切；雙子葉種子剝?nèi)シN皮，以備染色用。靛藍染色：將處理好的種子置于小燒杯內(nèi)，參加靛藍溶液漂浮種子。濃度：縱切種子用0.1％溶液，剝?nèi)シN皮種子用0.2％溶液。15min，油菜、芝麻、紅麻和大麻等30min，大豆、亞麻、向日葵、蓖麻、花生和棉籽等60min，3h。觀看鑒定：取出種子，用清水沖洗后馬上進展觀看鑒定。凡種胚不染色或染成淺藍色的、胚根尖端或少局部子葉染色的，為有生活力種子；凡種胚全部染成藍色的，或胚根、胚軸、胚芽、子葉等大局部染成藍色的，為無生活力種子。2．紅墨水染色法測定原理、種子預(yù)處理、染色時間等與靛藍染色法根本一樣。不同點：染成的顏色不同，死胚染成紅色，活種子胚不染色。測定時用剛開瓶的紅墨水，紅墨水與水的比例：小麥、玉米、大豆和棉花等為1：60；大麥以1：120為宜。到達規(guī)定染色時間后取出種子，用清水沖洗，馬上鑒定。五、軟X〔檢驗員讀本無〕《1996國際種子檢驗規(guī)程》增加了X射線測定技術(shù)，國內(nèi)沒列入國標〔93〕。軟X0.0l～0.05nm，穿透力弱?！矙C械工業(yè)部〕湘西探傷廠產(chǎn)的HY-35型農(nóng)用X光機。主要用于：作物種子成熟度的觀看〔水稻、花生〕種子隱蔽害蟲的檢驗〔進口林木種子隱蔽害蟲〕農(nóng)作物種子生活力測定〔軟X射線滲鋇造影法〕(一)測定原理活細胞的原生質(zhì)膜具有選擇透性，而死傷組織喪失選擇透性。用氯化鋇〔BaCl2〕溶液浸種滲透后：凡有生活力的種子不吸取鋇〔Ba＋＋〕離子；無生活力的種子鋇〔Ba＋＋〕就會滲入種子細胞內(nèi)部。軟X射線造影時，由于重金屬離子能猛烈吸取x射線：把這種滲鋇狀況不同的種子置于軟X光機曝光造影：在熒光屏上〔印成相片后〕：死傷組織，滲入鋇離子吸取了X射線，較為黑暗；活種子較為光明。在底片上相反：死組織較透亮；而活組織較為黑暗。(二)測定方法種子預(yù)濕隨機數(shù)取凈種子200粒，每重復(fù)50粒。在室溫下清水中浸泡2～16h充分吸賬；對直接浸水簡潔裂開的種，可先進展緩慢預(yù)濕后再浸16h，然后取出種子用濾紙吸去種子外表的水分。造影劑處理凡不能透過活細胞的半透膜，而又能滲入死細胞內(nèi)部的重金屬鹽類，均可作為造影劑。常用的造影劑是BaCl2:造影效果好；價格廉價；使用便利。將預(yù)濕好的種子放入20％的BaC12溶液中，處理時間一般為1～2h?！灿衩琢４鬄?.5h1.5h1h〕。留意：應(yīng)嚴格把握BaC12浸種時間，過長、過短都會影響測定的正確性。將種子取出放入網(wǎng)兜，用自來水沖洗，再用吸水紙吸干種子外表的水分，60～70℃1h。軟x射線攝影:可進展透視攝影；或熒光觀看〔僅限于大粒種子〕。我國主要應(yīng)用Hy—35型農(nóng)用x光機。曝光條件：電壓〔kv〕=30千伏，電流〔mA〕=3毫安。2040照耀劑量和透過率太大，反差不明顯，影像不清楚。照耀劑量太少，不同厚度的組織均不能通過，沒有產(chǎn)生造影效果。因此，必需在實際測定中確定最正確攝影條件。常用膠片有：國產(chǎn)8DIN〔定〕黑白片，經(jīng)濟適用、可放大，可印相。X也可用4號相紙〔GB21〕直接印相，可供自己看。攝影時，在暗室內(nèi)剪取適當大小的膠片，裝入黑紙袋內(nèi)，置于攝影臺上，將種子放在黑紙袋上排好攝影。影像鑒定在暗室用D-72顯影液顯影和酸性定影液定影。鑒定原則：在照片上〔熒光屏上〕：種胚黑色的，為無生活力種子；種胚白色的，為有生活力種子。在膠片上〔底片上〕：種胚透亮的，為無生活力種子；種胚黑色的，為有生活力種子?？傊?，軟x射線造影技術(shù)具有多方面的用途：①既能測定種子生活力，不受種子休眠限制。與四唑相比，具有不破壞性樣品的優(yōu)點。②也能觀看種子內(nèi)部害蟲和機械損傷，區(qū)分飽滿與空癟、蟲蛀等。r=0.995.特別適用于：番茄、西瓜和黃瓜等扁平種子生活力分析。本節(jié)重點：種子生活力的概念；四唑染色技術(shù)的原理。其次節(jié)種子活力測定原理及方法種子活力〔seedvigor〕是種子質(zhì)量的重要指標之一，與種子田間出苗質(zhì)量親熱相關(guān)?；盍y定經(jīng)過幾十年的爭論，已取得了重大進展。在美國和歐洲，很多種子公司把活力測定作為常規(guī)的檢驗工程，但國內(nèi)沒被列于國標。一、種子活力的概念種子活力的定義長期得不到統(tǒng)一，不同學(xué)者有不同的定義，經(jīng)過271977ISTAp751、種子活力是打算種子或種子批在發(fā)芽和出苗期間的活性水平和行為的那些種子特性的綜合表現(xiàn)。表現(xiàn)好的為高活力種子，表現(xiàn)差的為低活力種子。北美官方種子分析家協(xié)