第2單元 免疫沉淀類實(shí)驗(yàn)

第二單元免疫沉淀實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)

在瓊脂凝膠中，待檢人血清IgG和羊抗人IgG抗血清在不同孔內(nèi)各自向四周擴(kuò)散，在比例恰當(dāng)處形成肉眼可見的白色沉淀線，證明兩者發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)原理試劑健康人血清，用生理鹽水做1:5~1:40系列倍比稀釋、羊抗人IgG抗血清、10~15g/L瓊脂糖或瓊脂粉。儀器水浴箱、溫箱。材料載玻片、微量加樣器、打孔器、5ml吸管、吸球、濕盒等。實(shí)驗(yàn)器材和材料制備瓊脂凝膠：用生理鹽水配置10～15g/L瓊脂，隔水加熱煮沸備用。澆板：將載玻片置于水平臺(tái)上，用吸管吸取4~4.5ml融化的瓊脂傾注于玻片上，滴加時(shí)注意速度不要過快，要使瓊脂蓋滿整張玻片，使其均勻、飽滿，勿溢出并避免產(chǎn)生氣泡。打孔：待瓊脂凝固后，將梅花形打孔模板置于瓊脂板下，用直徑3mm的打孔器打孔，使其孔徑為3mm，孔距為4mm，孔要求圓整光滑，孔緣不能破裂，底部勿與載玻片脫離。加樣：用10μl微量加樣器分別取抗原、抗體加入孔中。中心孔加入抗體，周圍孔分別加入不同稀釋度的抗原。溫育：將加好樣的瓊脂凝膠板平放于濕盒中，37℃溫箱溫育24h，觀察沉淀線。實(shí)驗(yàn)方法操作示意圖澆板溫育打孔加樣結(jié)果判斷中央孔—抗體成分周圍孔—不同稀釋度的抗原成分（第1~5孔）第6孔—陰性對(duì)照123456

以出現(xiàn)沉淀線的正常人血清最高稀釋度為人血清IgG的擴(kuò)散效價(jià)。結(jié)果判斷北華大學(xué)王雪松該方法簡(jiǎn)便易行，結(jié)果穩(wěn)定可靠。根據(jù)抗原抗體相遇后所出現(xiàn)沉淀線的特征，對(duì)其進(jìn)行定性分析。若相鄰兩孔內(nèi)抗原成分完全相同，則形成完全相連的兩條沉淀線；若抗原完全不同，則形成交叉的兩條沉淀線；若抗原部分相同，則形成部分相連的兩條沉淀線；當(dāng)抗原存在多種成分時(shí)，則呈現(xiàn)多條沉淀線以至交叉反應(yīng)線，因此可根據(jù)沉淀線的位置、形狀、數(shù)目等，初步分析抗原和抗體的純度、濃度、擴(kuò)散速度等理化性狀。該方法除用于血清IgG的檢測(cè)以外，還曾用于診斷和分析某些疾病，如檢測(cè)AFP、HBsAg等，但敏感度低所需時(shí)間長(zhǎng)。

實(shí)驗(yàn)討論實(shí)驗(yàn)二單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)將一定量的羊抗人IgG抗血清成分混合于瓊脂凝膠中，制成含有特異性羊抗人IgG抗血清的瓊脂板，待凝固后打孔，并在相應(yīng)孔中加入待檢人血清IgG。使待檢血清在瓊脂板中向四周呈環(huán)狀擴(kuò)散，在兩者濃度比例恰當(dāng)處形成肉眼可見的白色沉淀環(huán)，沉淀環(huán)的直徑或面積與待檢人血清濃度呈正相關(guān)。同時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)免疫球蛋白或國(guó)際參考蛋白制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可用以定量檢測(cè)人血清IgG濃度。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)器材和材料試劑：待檢人血清、免疫球蛋白工作標(biāo)準(zhǔn)（IgG含量為10.10mg/ml）、羊抗人IgG抗血清（單擴(kuò)效價(jià)1:100）、瓊脂糖或瓊脂粉、生理鹽水、NaN3

。儀器：水浴箱、溫箱。材料：載玻片、微量加樣器、打孔器、5ml吸管、吸球、三角燒瓶、濕盒半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙等。實(shí)驗(yàn)方法制備抗體瓊脂凝膠:用生理鹽水配置10～15g/L瓊脂，加0.01%（0.1g/L）NaN3，隔水加熱煮沸瓊脂，置56℃水浴中備用。吸取99ml已融化的瓊脂于三角燒瓶中，置56℃水浴中保溫，將預(yù)溫的羊抗人IgG抗血清1ml與瓊脂充分混合，繼續(xù)保溫于56℃水浴中備用。澆板:將清潔干燥的載玻片置于水平臺(tái)上，用吸管吸取充分混勻的抗體瓊脂4~4.5ml傾注于玻片上，置室溫冷卻凝固。要求澆板時(shí)要均勻、平整、無氣泡、薄厚均勻。打孔:待瓊脂凝固后，用打孔器打孔，孔徑3mm，孔距10~12mm。要求孔打得圓整光滑，孔緣不能破裂，底部勿與玻片分離。加樣:稀釋人免疫球蛋白工作標(biāo)準(zhǔn)品：取凍干人免疫球蛋白工作標(biāo)準(zhǔn)品1支加蒸餾水0.5ml，待完全溶解后，用生理鹽水稀釋成不同的稀釋度。其稀釋范圍為1:5、1:10、1:20、1:40，IgG相應(yīng)含量為2020、1010、505、252mg/L。稀釋待檢血清：將待檢血清用生理鹽水做1:40稀釋。用微量加樣器分別吸取各稀釋度的人免疫球蛋白工作標(biāo)準(zhǔn)品10μl加入到標(biāo)準(zhǔn)抗原孔，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。再用同樣的方法吸取已稀釋好的待檢血清10μl加入到待檢血清孔。

擴(kuò)散:將加好樣的瓊脂凝膠板平放于濕盒中，37℃溫箱溫育24h，觀察結(jié)果。如果沉淀環(huán)不清晰，可用生理鹽水浸泡2~3h。操作示意圖澆板擴(kuò)散打孔加樣12345678結(jié)果判斷第1、2、3、4、5孔—標(biāo)準(zhǔn)蛋白第6、7孔—待檢抗原第8孔—陰性對(duì)照結(jié)果判斷繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以各稀釋度工作標(biāo)準(zhǔn)的沉淀環(huán)直徑為橫坐標(biāo)，相應(yīng)孔中的IgG含量為縱坐標(biāo)，在半對(duì)數(shù)紙上按Fahey法繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果判定：待測(cè)標(biāo)本中所含抗原量根據(jù)標(biāo)本孔的沉淀環(huán)直徑查標(biāo)準(zhǔn)曲線，將查得的Ig含量乘以標(biāo)本的稀釋倍數(shù)，即待檢標(biāo)本血清中Ig的實(shí)際含量。實(shí)驗(yàn)討論單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)方法簡(jiǎn)便、易于操作，且重復(fù)性和線性均可信賴。但敏感度稍差，觀察結(jié)果所需時(shí)間較長(zhǎng)，每次需做參考血清對(duì)照，不可一次做成，長(zhǎng)期使用。應(yīng)用此方法除檢測(cè)人血清IgG含量外，還可用于健康人群或患者血清中IgA、IgM、補(bǔ)體、白蛋白、蛋白酶等蛋白質(zhì)含量的定量測(cè)定。北華大學(xué)王雪松實(shí)驗(yàn)三對(duì)流免疫電泳

在偏堿性的緩沖液和適當(dāng)?shù)闹绷麟妶?chǎng)中，抗原和抗體的擴(kuò)散具有一定的特點(diǎn)。在pH8.6以上的緩沖液中，大部分蛋白質(zhì)抗原解離帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極泳動(dòng)；而大部分抗體屬于IgG，在此種pH條件下只帶微弱的負(fù)電荷，由于其分子量大，暴露的極性基團(tuán)少，在電場(chǎng)中泳動(dòng)緩慢，且受電滲作用的影響，帶正電荷的液體推動(dòng)抗體分子向負(fù)極泳動(dòng)。由此抗原、抗體就達(dá)到了定向?qū)α鳎趦烧呦嘤銮冶壤线m時(shí)便形成肉眼可見的白色沉淀線。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)器材和材料試劑：人血清、抗人血清、pH8.60.05mol/L巴比妥緩沖液、用巴比妥緩沖液配置1%瓊脂。儀器：電泳槽、電泳儀、水浴箱。材料：孔型模板、打孔器、濾紙、紗布條、微量加樣器、載玻片、吸管、吸球等。制備巴比妥瓊脂凝膠：取出一清潔載玻片，用75%乙醇沖洗干凈，晾干備用。將1%巴比妥瓊脂融化后，置56℃水浴中備用。用吸管吸取4~4.5ml瓊脂溶液滴加于玻片上，室溫放置，待凝固后打孔，孔徑3mm，孔距10mm。加樣：用微量加樣器分別吸取抗原10μl加入陰極側(cè)孔內(nèi)，抗體10μl加入陽(yáng)極側(cè)孔內(nèi)，所加樣品切勿外溢。電泳：將加樣完畢的瓊脂板置電泳槽的支架上，抗原孔置陰極端，抗體孔置陽(yáng)極端，電泳槽內(nèi)加pH8.6的0.05mol/L巴比妥緩沖液至電泳槽的三分之二處，瓊脂板兩端分別用鹽橋與緩沖液相連?？刂贫穗妷簽?~6V/cm板長(zhǎng)，電泳30~60min。電泳完畢后，切斷電源。實(shí)驗(yàn)方法操作示意圖澆板電泳打孔加樣兩孔之間形成的白色沉淀線即為抗原抗體復(fù)合物。AgAb﹣﹢AgAb

在抗原和抗體兩孔之間形成的白色沉淀線即為抗原抗體復(fù)合物。如果沉淀線不夠清晰，于濕盒中37℃保溫?cái)?shù)小時(shí)，可增強(qiáng)沉淀線的清晰度。結(jié)果判斷

北華大學(xué)王雪松此方法簡(jiǎn)便、快捷。敏感性比雙向免疫擴(kuò)散法高8~16倍。需要選擇高特異性、高親和力的抗體，否則結(jié)果難以判斷。對(duì)流免疫電泳在臨床常用于某些抗原的定性檢測(cè)（如AFP、HBsAg等），同時(shí)也可用于抗原的半定量測(cè)定，或根據(jù)沉淀線的位置、形狀對(duì)抗原和抗體進(jìn)行相對(duì)濃度的分析。由于該方法分辨率差，當(dāng)多種抗原抗體系統(tǒng)同時(shí)存在時(shí)，形成的沉淀線常重疊，難以分辨。實(shí)驗(yàn)討論實(shí)驗(yàn)四抗原物質(zhì)的變化及性質(zhì)分析（設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)）

是指能夠刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，并能與相應(yīng)免疫應(yīng)答的產(chǎn)物在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的物質(zhì)?？乖拍顚?shí)驗(yàn)原理

大分子的抗原物質(zhì)在細(xì)胞和生物體的生命活動(dòng)過程中，起著十分重要的作用，生物的某些結(jié)構(gòu)和性狀都與這些物質(zhì)有關(guān)?，F(xiàn)代分子生物學(xué)經(jīng)常采用一些方法對(duì)大分子物質(zhì)進(jìn)行有目的的改造，如鹽析、甲醛處理、加熱、紫外線照射、超聲波等，如處理不當(dāng)這些物質(zhì)會(huì)發(fā)生性質(zhì)上的改變而凝結(jié)起來，這種凝結(jié)是不可逆的，而且會(huì)影響蛋白的性質(zhì)。我們的目的為尋求是否有簡(jiǎn)單的方法對(duì)處理過程中蛋白的性質(zhì)進(jìn)行監(jiān)控，以觀察處理前后抗原物質(zhì)的性質(zhì)變化。首先制備出未處理抗原物質(zhì)的抗體，用該抗體與處理前和處理后的物質(zhì)分別進(jìn)行免疫反應(yīng)，觀察處理前后抗原性是否發(fā)生變化。然后制備出處理后抗原物質(zhì)的另一抗體，用該抗體與處理前和處理后的抗原物質(zhì)分別進(jìn)行免疫反應(yīng)，觀察抗原性是否有變化。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提示實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提示通過了解抗原性的變化進(jìn)一步推斷大分子抗原物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能是否有新的改變。在試驗(yàn)過程中，通過類似雙擴(kuò)的方法，觀察各種抗原和抗體之間的反應(yīng)及變化。

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34玻片上方兩孔分別為未處理抗原（1）和未處理抗原制備的抗體（2）；玻片下方兩孔分別為處理后抗原制備的抗體（3）和處理后抗原（4）。

有哪些理化因素能夠?qū)е驴乖园l(fā)生變化，變化的特點(diǎn)和意義是什么？免疫電泳的方法是否可以用于觀察抗原物質(zhì)性質(zhì)的變化？

是否能設(shè)計(jì)定量觀察大分子抗原物質(zhì)抗原性變化的實(shí)驗(yàn)？結(jié)果討論提綱北華大學(xué)王雪松臨床見習(xí)免疫比濁分析系統(tǒng)見習(xí)要點(diǎn)掌握該系統(tǒng)的技術(shù)流程及其質(zhì)量控制；熟悉速率散射比濁分析系統(tǒng)的基本原理；了解免疫比濁分析系統(tǒng)的種類和原理?；驹砩⑸浔葷岱ㄊ侵秆厮捷S向反應(yīng)液照射一定波長(zhǎng)的光，當(dāng)光線通過反應(yīng)體系時(shí)，由于抗原抗體反應(yīng)形成的免疫復(fù)合物微粒子對(duì)光發(fā)生折射、反射及透射，使水平方向的光發(fā)生偏轉(zhuǎn)，產(chǎn)生散射光。光線偏轉(zhuǎn)的角度與發(fā)射光的波長(zhǎng)和反應(yīng)液中抗原抗體復(fù)合物顆粒的大小及多少密切相關(guān)。一般儀器采用不同波長(zhǎng)的光源兩套光路，分別在90°和180°散射角檢測(cè)小、中和大分子物質(zhì)。所謂速率是指在單位時(shí)間內(nèi)，抗原抗體反應(yīng)形成復(fù)合物的速度。速率散射比濁法是測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)免疫復(fù)合物形成的最快時(shí)間段的散射信號(hào)值，當(dāng)抗體量大于抗原量時(shí)，形成的免疫復(fù)合物為小分子不溶性顆粒，產(chǎn)生的散射信號(hào)最強(qiáng)，形成的速率散射信號(hào)值也最大。免疫濁度分析系統(tǒng)基本技術(shù)流程圖

開機(jī)依次打開主機(jī)電源、電腦及打印機(jī)開關(guān)，儀器自行啟動(dòng)，完成初始化和自檢，即可開始工作參數(shù)設(shè)置試劑裝載校準(zhǔn)標(biāo)本裝載標(biāo)本測(cè)定結(jié)果查詢與傳送結(jié)果報(bào)告設(shè)置儀器項(xiàng)目和單位等相關(guān)參數(shù)將試劑盒放入試劑艙內(nèi)，根據(jù)已定程序掃描相關(guān)信息按已設(shè)定的參數(shù)和程序進(jìn)行校準(zhǔn)將標(biāo)本放入標(biāo)本架，根據(jù)已定程序輸入工作單按已設(shè)定的參數(shù)和程序進(jìn)行測(cè)定按已設(shè)定的參數(shù)和程序查看并傳送結(jié)果以標(biāo)準(zhǔn)模式報(bào)告結(jié)果并給予解讀和對(duì)臨床提供建議儀器示意圖①試劑區(qū)②試劑針③樣本區(qū)和稀釋液④加樣針⑤反應(yīng)區(qū)⑥清洗工作站124365124365檢測(cè)菜單（舉例介紹，并不包含全部）自身免疫性疾病免疫球蛋白A(IGA)免疫球蛋白G(IGG)免疫球蛋白M(IGM)補(bǔ)體C3(C3)補(bǔ)體C4(C4)輕鏈(KAP)輕鏈(LAM)Free輕鏈*Free輕鏈*C-反應(yīng)蛋白(CRP)觸珠蛋白(HPT)備解素B因子(PFB)類風(fēng)濕因子(RF)炎癥狀態(tài)監(jiān)測(cè)白蛋白(ALB)-酸性糖蛋白(AAG)抗胰蛋白酶(AAT)銅藍(lán)蛋白(CER)C-反應(yīng)蛋白(CRP)觸珠蛋白(HPT)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎類風(fēng)濕因子(RF)C-反應(yīng)蛋白(CRP)抗鏈球菌溶血素O(ASO)ADNase-B腎功能監(jiān)測(cè)尿微白蛋白(MA)尿免疫球蛋白(IGU)尿轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRU)1微球蛋白(A1M)2巨球蛋白(AMG)2微球蛋白*胱抑素C*傳染病抗DNA酶B(DNB)抗鏈球菌溶血素O(ASO)2微球蛋白*貧血抗凝血酶III(AT3)鐵蛋白(FER)轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF)觸珠蛋白(HPT)免疫功能障礙評(píng)估免疫球蛋白A(IGA)免疫球蛋白E(IGE)免疫球蛋白