慢病毒載體的構(gòu)建

慢病毒載體的構(gòu)建背景知識病毒載體是一種常使用于分子生物學(xué)的工具，可將遺傳物質(zhì)帶入細胞，原理是利用病毒具有傳送其基因組進入其他細胞，進行感染的分子機制。可發(fā)生于完整活體（invivo）或是細胞培養(yǎng)（invitro）中?？蓱?yīng)用于基礎(chǔ)研究、基因療法或疫苗?；蜉d體系統(tǒng)病毒載體系統(tǒng)非病毒載體系統(tǒng)腺病毒載體反轉(zhuǎn)錄病毒載體腺伴隨病毒載體單純皰疹病毒載體慢病毒載體裸DNADNA-陽離子脂質(zhì)復(fù)合物DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物細胞內(nèi)包裝細胞外包裝DNA-陽離子多聚物DNA/RNA嵌合物背景知識病毒載體產(chǎn)生的原理：最簡單的做法是，將適當(dāng)長度的外源DNA插入病毒基因組的非必需區(qū)，包裝成重組病毒顆粒。為了增加病毒載體插入外源DNA的容量，除了可以刪除病毒的非必需基因外，還可以進一步刪去部分或全部必需基因，這些必需基因的功能由輔助病毒或包裝細胞系反式提供。病毒載體的包裝系統(tǒng)，即將外源基因包裝到病毒顆粒中，需要：宿主細胞病毒復(fù)制和包裝所必須的順式作用元件和外源基因的表達盒輔助元件，即病毒復(fù)制和包裝所必需的所有反式作用元件（輔助質(zhì)粒、輔助病毒、包裝細胞系等）背景知識病毒載體的要求：

1、攜帶外源基因并能包裝成感染性病毒顆粒

2、介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)移和表達

3、對機體不致病類型：

1、重組型病毒載體（可復(fù)制型；復(fù)制缺陷型）

2、無病毒基因的病毒載體（復(fù)制缺陷型）組成：

1、病毒復(fù)制和包裝元件

2、病毒基因

3、插入的外源基因或元件

4、病毒外殼/外膜容量：自身基因組大小的105%~110%病毒載體的純化：病毒可以看作是一個具有特定結(jié)構(gòu)的生物大分子。病毒的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，純化時不能采用蛋白質(zhì)變性和復(fù)性的方法，因為一旦病毒蛋白發(fā)生變性，或病毒結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，在體外就很難再重建成有感染性的病毒顆粒。因此，在病毒的純化過程中必須保持病毒的結(jié)構(gòu)不受破壞，并且監(jiān)測其感染活性。初始物的收集或制備：培養(yǎng)上清和細胞裂解液都可作為純化的初始物初始物的濃縮：可選用鹽析、超濾、透析等方法進行濃縮。目標(biāo)病毒的分離純化：氯化銫密度梯度離心法，柱層析法（親和層析法）背景知識

我們現(xiàn)在正在做的病毒載體是復(fù)制缺陷型的慢病毒載體（Lentiviralvector），分表達系統(tǒng)和干涉系統(tǒng)實驗基本流程：構(gòu)建含有目的基因的轉(zhuǎn)移載體與2個病毒包裝載體共轉(zhuǎn)染293FT細胞進行病毒的純化、滴度測定侵染目的細胞，表達或干涉目的基因材料：包裝載體：pMD2.G、psPAX2的質(zhì)粒表達系統(tǒng)：pWPXLd的質(zhì)粒干涉系統(tǒng)：pEN-hH1c、pDSL-hpUGIP的菌種制備感受態(tài)用的Top10、Stb13的菌種重組酶（Gateway?LRClonase?II）

293FT細胞（＜16代）

293FT細胞的培養(yǎng)基及其添加成分（Non-EssentialAminoAcids，L-Glutamine，pyeuvatesolutionandG418）制備感受態(tài)用的試劑我們用的慢病毒載體的2個包裝載體我們用的慢病毒載體表達系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移載體一、空載質(zhì)粒的驗證包裝載體及表達載體質(zhì)粒的驗證圖1用500ng的pMD2.G、psPAX2、pWPXLd質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Stb13的感受態(tài)菌種，培養(yǎng)后進行小提（圖A）并酶切驗證（圖B）ABMMM二、慢病毒載體的包裝病毒包裝的實驗流程（以6孔板為例）第一天：293FT鋪板（無抗生素；第二天細胞密度達到80%～90%）第二天：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染（轉(zhuǎn)移載體+psPAX2+pMD2.G）

6-10h換液后開始計時第三天：轉(zhuǎn)染24h后，轉(zhuǎn)染效率應(yīng)達到70%以上第四天：48h收獲含病毒的上清，0.45um濾膜過濾，同時向6孔板中加入2ml完全培養(yǎng)基；1份病毒液+2份完全培養(yǎng)基感染目的細胞第五天：72h再次收獲病毒上清，再次感染目的細胞第六天：一般感染48h后可見熒光包裝質(zhì)粒的其他參考比例CytoskeletalanchoringofGLASTdeterminessusceptibilitytobraindamage:anidentifiedroleforGFAP.(JBiolChem,2007,Oct.)慢病毒載體介導(dǎo)人IL-12基因修飾樹突狀細胞體外抗肺癌作用的研究（邸軍，吉林大學(xué)博士學(xué)位論文，2009年5月）shRNA:psPAX2:pMD2G=20:15:5Duox1isthemainsourceofhydrogenperoxideintheratthyroidcelllinePCCl3(ExpCellRes.,2007,Nov.1)人白細胞介素10基因慢病毒載體的構(gòu)建及重組(中國普通外科雜志，2008年8月)pWXLd:psPAX2:pMD2G=20:15:6三.滴度測定：稀釋計數(shù)法滴度單位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒顆粒數(shù)。”TU”為”transducingunits”的縮寫，中文為“轉(zhuǎn)導(dǎo)單位”，表示可以感染并進入到靶細胞中的病毒基因組數(shù)。第一天細胞準備將生長狀態(tài)良好的293T細胞消化計數(shù)后稀釋至1×105/ml，加入96孔板，100μl/孔，為每個病毒準備10個孔。放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第二天加病毒在EP管中做10倍梯度稀釋，連續(xù)10個稀釋度。稀釋方法如下：每種病毒準備10個1.5mlEP管，每管加入90μl培養(yǎng)液，往第一個管中加入10μl病毒原液，混勻后，吸取10μl加入第二個管混勻。依此類推，做十個稀釋度（10~10-8）。吸取96孔板中原有的培養(yǎng)基，加入含稀釋好的病毒液。并做好標(biāo)記。第三天追加培養(yǎng)液在每個孔再加入100μl完全培養(yǎng)液，利于細胞的生長。第五天觀察結(jié)果并計算滴度在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，并數(shù)出最后兩個有熒光的熒光細胞克隆數(shù)。假設(shè)為X和Y，則滴度（TU/ml）=（X+Y×10）×1000/2/X孔的病毒液的含量（μl）。Lip2000轉(zhuǎn)染293FT細胞的效率圖8Des2-1、psPAX2、pMD2G用Lip2000共轉(zhuǎn)293FT細胞，48h后檢測GFP的表達情況，如圖所示（4×）五、慢病毒載體的驗證1、室溫3000rpm離心5min，收集上清并過0.45μm的濾膜，以除去混有的細胞或細胞碎片2、將上清轉(zhuǎn)入超速離心管中,4℃、26000rpm超速離心2h。棄上清，用不含