《泛解酸內(nèi)酯水解酶的固定化（論文）》

泛解酸內(nèi)酯水解酶的固定化研究TOC\o"1-3"\h\u28734引言 3260091.D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的固定化概述 4142391.1D-泛解酸內(nèi)酯概念 4255941.2酶的固定化方法 434751.2.1離子吸附法 47641.2.2凝膠包埋法 445032.試驗(yàn)與方法 422852.1實(shí)驗(yàn)器材 5108542.1.1菌種 573592.1.2培養(yǎng)基 5148102.1.3主要藥品 5237522.1.4主要儀器 5166902.2實(shí)驗(yàn)方法 5144672.2.1菌絲體發(fā)酵培養(yǎng) 5792.2.2粗酶液的制備 534202.2.3樹(shù)脂轉(zhuǎn)型 6122432.2.4載體選擇方法 6181202.2.5紅外光譜的測(cè)定 6136472.2.6酶的固定化方法 610823.結(jié)果 6271123.1D-泛解酸內(nèi)酯水解酶提取方法的選擇 770993.3固定化載體的選擇 738684.討論 7179554.1固定化條件 7108774.2固定化酶的酶學(xué)性質(zhì) 8272144.3固定化酶轉(zhuǎn)化工藝 82222參考文獻(xiàn) 9引言D-泛解酸內(nèi)酯水解酶具有很高的立體選擇性，可用于分離D-泛解酸內(nèi)酯。根據(jù)專利文獻(xiàn)，產(chǎn)生D-泛解酸內(nèi)酯的微生物主要有以下幾種：鐮刀菌、赤霉素、格列克拉菌、黑曲霉和圓柱藻等，其中尖孢鐮刀菌和串珠鐮刀菌已工業(yè)化[1]。D-泛酸內(nèi)酯是一種重要的醫(yī)藥中間體，主要用于合成維生素D-泛酸和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性D-泛酸鈣。D-泛醇和D-泛酸鈣分別與β-氨基丙醇和β-氨基丁酸反應(yīng)合成外消旋體并進(jìn)行拆分[2]。然而，這條路線在工業(yè)生產(chǎn)中還沒(méi)有報(bào)道。主要原因是該方法將損失近兩倍于β-氨基丙醇和β-氨基丁酸的成本，導(dǎo)致生產(chǎn)成本高。近年來(lái)，在國(guó)內(nèi)外D-泛酸和D-泛酸鈣工業(yè)中，首先分離DL-泛酸內(nèi)酯，直接合成D-泛酸醋及其中間體。D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的研究始于20世紀(jì)90年代。1994年從日本分離純化了尖孢鐮刀菌中的D-泛解酸內(nèi)酯，研究了該酶的反應(yīng)條件，確定了酶轉(zhuǎn)化的最佳反應(yīng)條件，同時(shí)測(cè)定了該酶的分子量和亞基組成[3]。2002年，Sakamoto等人在日本發(fā)表了真核生物D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的基因序列，并將修飾后的基因轉(zhuǎn)入原核生物細(xì)胞進(jìn)行過(guò)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物具有D-泛解酸內(nèi)酯的立體定向拆分活性。該表達(dá)產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)取得了良好的效果。本研究主要通過(guò)實(shí)驗(yàn)探究D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的固定化，選擇合適的固定化載體和固定化方法記憶固定化條件。為目前的D-泛解酸內(nèi)酯水解酶固定化提供一定的參考。1.D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的固定化概述1.1D-泛解酸內(nèi)酯概念D-泛解酸內(nèi)酯是生產(chǎn)D-泛酸鈣、D-泛酸、D-泛酸乙胺等泛酸系列產(chǎn)品的重要手性中間體，泛酸是B族維生素物質(zhì)，是輔酶a的組成部分，參與糖、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝。泛酸是輔酶A的輔酶，輔酶A是泛酸與3-磷酸腺苷、焦磷酸和r-賴乙胺的復(fù)合分子。因此，輔酶A在泛酸的生理功能中起著重要作用：它參與體內(nèi)脂肪酸降解、脂肪酸合成、檸檬酸循環(huán)、膽堿酯酶（一種神經(jīng)遞質(zhì)）乙基化、抗體合成（增強(qiáng)對(duì)病原體的抵抗力）等代謝。由于輔酶A的生理功能，泛酸的存在有利于各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用。因此，D-泛酸廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和飼料工業(yè)。其活性成分為右旋泛酸（維生素B3）的D-構(gòu)型，但由于泛酸的不穩(wěn)定性，其商業(yè)形態(tài)主要為D-泛酸鈣。D-泛酸（provitaminB5）是一種液態(tài)D-泛酸鈣，進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為泛酸。由于泛酸在ph3-5時(shí)比泛酸鹽具有更好的穩(wěn)定性，因此在多維生物溶液中用泛酸代替泛酸。1.2酶的固定化方法1.2.1離子吸附法采用離子效應(yīng)將酶固定在帶離子交換基的水不溶性載體上。除了具有離子交換基團(tuán)的多糖外，聚電解質(zhì)，如離子交換樹(shù)脂，也可以用作合成聚合物衍生物的載體。與上述共價(jià)結(jié)合法相比，離子結(jié)合法更方便，處理?xiàng)l件溫和，酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)和活性中心的氨基酸很少發(fā)生變化，因此可以得到高活性的固定化酶。但與共價(jià)鍵合等化學(xué)方法相比，載體與酶的鍵合依賴于庫(kù)侖相互作用，因而不夠牢固，易受所用緩沖液和反應(yīng)液pH值的影響。當(dāng)溶液的離子強(qiáng)度較高時(shí)，由于去屏蔽作用，酶會(huì)從載體上脫落。1.2.2凝膠包埋法在不溶性凝膠的空隙中嵌入酶的方法。操作中先將酶與單體混合，再加入引發(fā)劑使單體聚合，制備凝膠固定化酶。交聯(lián)多酚凝膠包封是第一種包埋技術(shù)。固定化酶包括胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、p-淀粉酶。后來(lái)，一些研究者用這種方法固定過(guò)氧化氫酶、糜蛋白酶、p-糖化酶。近年來(lái)，一些研究者利用海藻酸鈉和卡拉膠（k-卡拉膠）等天然材料進(jìn)行固定化?？ɡz是從卡拉膠中提取的一種多糖。酶的水溶液在40-60攝氏度的生理鹽水溶液中與卡拉膠混合。冷卻后形成凝膠，凝膠在0.3mol/L氯化鉀溶液中硬化，硬化后的凝膠形成合適大小的顆粒，即固定化酶。用單寧、戊二醛、己二胺等固化劑對(duì)固定化酶進(jìn)行處理，可以得到更穩(wěn)定的固定化酶。該方法適用于多種酶的固定化。2.試驗(yàn)與方法2.1實(shí)驗(yàn)器材2.1.1菌種腐皮鐮飽菌(Fl訴ratumAS3.4738)2.1.2培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基（察氏培養(yǎng)基）：NaNO30.3%,KCI0.05%，K2HPO40.1%,FeSO40.001%，MgS04.7H2O0.05%,庶糖3%，瓊脂2%，pH6.7,12rC滅菌15min。種子培養(yǎng)基：甘油2%，蛋白胨1%,酵母膏1%，玉米衆(zhòng)1%，pH6.7。發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油3%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，玉米菜0.5%，pH6.7。2.1.3主要藥品25%戊二酵水溶液、瓊脂粉、DL-泛解酸內(nèi)離標(biāo)準(zhǔn)品、D-泛解酸內(nèi)酯、可溶性淀粉、乙醇等。2.1.4主要儀器HYG-II型回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖床、HS-1300-V型超凈臺(tái)、AB204-S型分析天平、CHB型普通光學(xué)顯微鏡、高速冷凍離心機(jī)等。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)斜面和茄子瓶種子的培養(yǎng)取菌種封管在茄子瓶斜面上劃線接種，于28℃下培養(yǎng)5天，連續(xù)傳至3代，40C冰箱保存?zhèn)溆谩７N子培養(yǎng)用無(wú)菌水將茄子瓶斜面菌體細(xì)胞洗下，制成菌懸液(抱子數(shù)1.0X1護(hù)cell/mL-1.0X1Ogcell/mL)，30mL種子培養(yǎng)基接入3mLa28℃180r/min搖床震蕩培養(yǎng)16-18h，裝液量30mL/250mL。發(fā)酵培養(yǎng)以5%接種量將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的種子接入裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，28℃，180r/min，培養(yǎng)48h。2.2.2粗酶液的制備菌絲體收集將培養(yǎng)好的發(fā)酵液用布氏漏斗抽濾，將所得菌絲體空氣吹干控制水分在30-40%所得菌絲冷凍保藏，備用。破壁提取取菌絲100g，冰浴環(huán)境下，球磨機(jī)轉(zhuǎn)速50r/min，研磨時(shí)間15min，得菌絲泥。加菌絲泥體積10倍量冰水稀釋，經(jīng)高壓勻質(zhì)機(jī)，壓力0.15MPa，勻質(zhì)破壁，10000r/min時(shí)間10min，冷凍離心上清即為酶液，冰箱冷藏，備用。超濾濃縮取上述酶液，在壓力0.15Mpa經(jīng)2000的超濾膜澄清，再在壓力0.15Mpa經(jīng)500000的超濾膜截留分子量50KD的蛋白，將超濾后的粗酶提取液放入冰箱保藏備用。2.2.3樹(shù)脂轉(zhuǎn)型樹(shù)脂轉(zhuǎn)型有靜態(tài)和動(dòng)態(tài)兩種方法，本實(shí)驗(yàn)采用靜態(tài)法把離子交換樹(shù)脂轉(zhuǎn)成C1型:取一定量的樹(shù)脂，經(jīng)去離子水清洗多次，再用4%NaOH浸泡4h后，去離子水清洗多次至中性，再用4%HC1浸泡4h，用去離子水清洗多次至中性，用2倍體積以上去離子水浸泡備用。2.2.4載體選擇方法取處理過(guò)的樹(shù)脂載體1g，分別加入適當(dāng)?shù)拿附庖汉瓦m當(dāng)?shù)腡ris-HCI緩沖液privateI-CACI溶液，在30℃120R/min恒溫水浴搖瓶中搖過(guò)夜，丟棄Tris-HCl緩沖液，反復(fù)洗滌，直至洗滌液中無(wú)酶活為止。分別測(cè)定固定化酶和上清液的酶活，計(jì)算固定化酶的回收率。2.2.5紅外光譜的測(cè)定將未經(jīng)酶吸附和酶吸附處理的樹(shù)脂在凍干機(jī)（-6q0c）中冷凍48小時(shí)。然后將凍干的樣品放入瑪瑙砂漿中，與磨碎的KBr混合，壓入透明片中，以250C.Kb:為背景光譜進(jìn)行紅外測(cè)試。2.2.6酶的固定化方法以戊二醛為交聯(lián)劑取一定量的預(yù)處理樹(shù)脂，用濾紙將表面水吹干，稱取1g樹(shù)脂放入250毫升三角瓶中，加入適量的Tris-HCl緩沖液和酶溶液，放入恒溫水浴搖瓶中吸附。吸附后放入4℃冰箱冷卻。待溫度與戊二醛相當(dāng)后，加入一定濃度的戊二醛溶液，緩慢攪拌。最后放入低溫恒溫反應(yīng)槽中交聯(lián)。交聯(lián)后用去離子水清洗樹(shù)脂，去離子水體積約為樹(shù)脂吸附劑體積的10倍，去除游離酶。清洗后的樹(shù)脂為固定樹(shù)脂。將固定化樹(shù)脂在一定pH的Tris-HCl緩沖液中浸泡，放入冰箱備用。以THP為交聯(lián)劑取一定量的80%（w/V）THPC溶液，加入95ml去離子水，在劇烈攪拌下，滴加一定濃度的KOH溶液5ml，保證THP和KOH為等摩爾反應(yīng)，然后快速加入0.5g預(yù)處理樹(shù)脂，緩慢攪拌5分鐘，用去離子水清洗樹(shù)脂3次后，加入一定量的Tris-HCl緩沖液（0.02mol/L），調(diào)節(jié)D-pan水解酸內(nèi)醋酸水解酶溶液的pH值，放入恒溫?fù)u瓶中一定時(shí)間，最后用去離子水清洗。所得樹(shù)脂為固定樹(shù)脂。用少許去離子水浸泡后放入冰箱備用。3.結(jié)果3.1D-泛解酸內(nèi)酯水解酶提取方法的選擇由于D-泛醇內(nèi)酯水解酶存在于增殖鐮刀菌（Fusariumproliferanumvar，proliferatumas3.4738）中，因此有必要破壁獲得d-泛醇內(nèi)酯水解酶。因此，根據(jù)2.3.2的方法提取D-泛解酸內(nèi)酯水解酶。表3-1幾種粗酶提取方法的對(duì)比提取方法提取前酶活力(U/g)提取后酶活力(U/g)酶活提取率(%)液氮研磨法0.230.1357.58超聲破碎法0.230.1253.79高壓均質(zhì)法0.230.1356.97由表3-1可知，高壓均質(zhì)法提取d-泮托拉酮水解酶的提取率為56.97%，液氮研磨法提取d-泮托拉酮水解酶的提取率為57.58%，兩種方法無(wú)顯著差異。但從菌絲體加工能力來(lái)看，高壓均質(zhì)法處理能力大（約2kg/h），超聲波破碎提取法和液氮研磨法處理能力小（約0.01kg/h）。綜合考慮，如果在大型工礦生產(chǎn)中采用高壓均質(zhì)法，是必然的。因此，選擇高壓均質(zhì)法作為粗酶的提取方法。與粉碎前的菌絲相比，粉碎后的菌絲體結(jié)構(gòu)明顯減少，而且還存在一個(gè)小片段結(jié)構(gòu)，說(shuō)明粉碎效果較好。超濾是一種加壓膜過(guò)濾。其工作原理是使膜側(cè)（原液中）的大溶質(zhì)分子保持恒壓，而小溶質(zhì)分子則滲透到膜的另一側(cè)，從而達(dá)到分離、純化和濃縮產(chǎn)品的目的。超濾技術(shù)適用于生物大分子發(fā)酵產(chǎn)物的提取、純化和濃縮。該工藝具有成本低、操作方便、條件溫和、酶活性好、產(chǎn)品回收率高等優(yōu)點(diǎn)。3.3固定化載體的選擇本研究選用6種有代表性的樹(shù)脂D-3520,D-152.D-380,N-KA9,AB-8,ADS-76種材料按上述方法，加酶量為6U/g樹(shù)脂，在300C,PH為7.5，恒溫吸附4h，然后測(cè)定固定化酶活和酶活回收率。其固定化效果如表3-2。表3-2載體對(duì)固定化酶活力的影響樹(shù)脂D-3520D-152D-380N-KA9AB-8ADS-7酶活回收率33.1754.3056.8740.7344.1750.17酶活(U/g載體)42.762.873.12從表3-2可以看出，離子交換樹(shù)脂比吸附樹(shù)脂具有更大的優(yōu)勢(shì)。這可能是由于吸附樹(shù)脂，沒(méi)有官能團(tuán)，D-泛酸內(nèi)水解酶的吸附只依賴于較大的比表面積，作用分?jǐn)?shù)很弱，或酶的蛋白質(zhì)含量太小，導(dǎo)致空間滲漏或酶的失活吸附過(guò)強(qiáng)所致，因此酶活性和活性回收率普遍較低。但是，離子交換樹(shù)脂對(duì)酶的吸附依賴于離子鍵、氫鍵和范德華引力，與吸附樹(shù)脂相比，吸附力強(qiáng)，不易脫落。通過(guò)戊二醛的交聯(lián)處理，提高了酶的穩(wěn)定性，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)。所選樹(shù)脂中，弱堿性陰離子交換樹(shù)脂D380具有較高的固定化酶活性和回收率。結(jié)果表明，D380固定化效果最好。4.討論4.1固定化條件在300cd-380、n-ka9和pH值為7.5的條件下，在恒溫吸附4h后，比較了d-3520、d-152、AB-8和es-v-1六種樹(shù)脂吸附d-泛素內(nèi)切酶的酶活和酶回收率。結(jié)果表明，D-380具有良好的吸附效果，固定化酶活力可達(dá)4u/g樹(shù)脂，酶活力回收率可達(dá)66.7%。4.2固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定了固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)：固定化酶的最適溫度為400℃，比游離酶高100℃，熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性都有一定程度的提高；固定化酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)kn為28.2mmol/L，比游離酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)kn高2.0mmol/L比報(bào)道的酶高6.8倍。4.3固定化酶轉(zhuǎn)化工藝考慮到D-泛解酸內(nèi)酯是一種混合旋轉(zhuǎn)的化合物，當(dāng)D-泛解酸內(nèi)酯用于生成D-泛解酸時(shí)，D-泛解酸內(nèi)酯也會(huì)在適當(dāng)?shù)臈l件下自發(fā)水解，并發(fā)生一些其它的副反應(yīng)，從而在反應(yīng)體系中增加額外的產(chǎn)物，使下一步的分離成為可能提取更困難。因此，研究固定化酶轉(zhuǎn)化為底物的工藝具有重要意義。為了最大限度地提高固定化酶水解D-泛解酸內(nèi)酯的能力，對(duì)酶水解條件進(jìn)行了優(yōu)化。主要研究了以下幾個(gè)方面：（1）底物溶液的濃度。（2）固定化酶的添加量。（3）固定化酶的PH值。（4）固定化酶的溫度。（5）水解反應(yīng)時(shí)間。（6）水解過(guò)程中的攪拌速度。最后，確定了固定化D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的最佳水解條件。參考文獻(xiàn)[1]王亞慧,侯海榮,陳明濤,孫春