中國藥典無菌檢查法課件

2005年版《中國藥典》

無菌檢查遼寧省藥品檢驗(yàn)所抗生素室李冰2009.7一、2005年版無菌檢查法特點(diǎn)二、無菌檢查法概念三、2005年版增、修訂內(nèi)容四、供試品的無菌檢查法五、菌種

一、2005年版無菌檢查法特點(diǎn)完善檢查方法增加試驗(yàn)的可操作性方法更具科學(xué)性，提高檢出率，保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性縮小與先進(jìn)國家藥典的無菌檢查法的差別三、增、修訂內(nèi)容

無菌檢查法的設(shè)施及環(huán)境、培養(yǎng)基名稱、培養(yǎng)基種類及用途、培養(yǎng)基制備及裝量、培養(yǎng)基滅菌及貯藏、培養(yǎng)基的適用性檢查、試驗(yàn)用菌株、最小檢驗(yàn)量、方法驗(yàn)證、培養(yǎng)時間、結(jié)果判斷

1、無菌檢查的設(shè)施及環(huán)境

⑴試驗(yàn)環(huán)境應(yīng)在潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單項(xiàng)流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行、其全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作。

規(guī)定應(yīng)定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈級的檢測。

隔離系統(tǒng)按相關(guān)的要求進(jìn)行驗(yàn)證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。

⑵隔離系統(tǒng)的應(yīng)用

應(yīng)用隔離系統(tǒng)重要的兩方面：一是保護(hù)產(chǎn)品免受外源性污染，包括操作人員、操作環(huán)境及外包裝等的污染，保證無菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，實(shí)現(xiàn)一次檢出的要求;二是保護(hù)操作人員免受實(shí)驗(yàn)過程中的有害物質(zhì)帶來的污染。

3、培養(yǎng)基的制備、裝量培養(yǎng)基可按處方制備，亦可使用按該處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的裝量與容器高度的比例應(yīng)符合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基氧化層（粉紅色）不超過培養(yǎng)基深度1/2。供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層顏色不得超過培養(yǎng)基深度的1/5，否則，須經(jīng)100℃水浴加熱至粉紅色消失（不超過20分鐘），迅速冷卻，只限加熱一次。4、滅菌所有培養(yǎng)基、稀釋液及沖洗液的滅菌程序均應(yīng)驗(yàn)證，方可采用。防止滅菌不徹底或過渡滅菌

5、培養(yǎng)基的貯存制備好的培養(yǎng)基應(yīng)在2-25℃、避光保存保存在非密閉容器中，應(yīng)在3周內(nèi)使用

(一般指配制的）。保存在密閉容器中，可在1年內(nèi)使用（一般指商品化的）。⑵靈敏度檢查①菌種金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC（B）26003]銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）[CMCC（B）10104]枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis)「CMCC(B)63501」生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）[CMCC（B）64941]白色念珠菌（Candidasporogenes）[CMCC（B）98001]黑曲霉（Asperjillusniger）[CMCC（F）98003]

②菌液制備試驗(yàn)菌培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度培養(yǎng)時間

（℃）（小時)

金黃色葡萄球菌營養(yǎng)肉湯30-3518-24

銅綠假單胞菌

枯草芽孢桿菌生孢梭菌硫乙醇酸鹽流體

白色念珠球菌改良馬丁培養(yǎng)基23-2824-48

黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面5-7天

③培養(yǎng)基接種試驗(yàn)菌培養(yǎng)基每管裝量接種管數(shù)接種量培養(yǎng)時間(ml)(支)（ml）（天）金黃色葡萄球菌硫乙醇酸鹽12213銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌生孢梭菌白色念珠球菌改良馬丁培養(yǎng)基9215黑曲霉其中硫乙醇酸鹽及改良馬丁培養(yǎng)基均有1支不接種作為空白接種量1ml含菌＜100cfu

7、稀釋液、沖洗液

0.1%蛋白胨水溶液

PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液

如需要可加入表面活性劑或中和劑應(yīng)經(jīng)方法驗(yàn)證證明其有效性，并對細(xì)菌存活無影響。修改原因：增加檢出率，使受損的微生物復(fù)蘇

8、方法驗(yàn)證試驗(yàn)

在建立供試品的無菌檢查方法時，需對供試品的抑細(xì)菌和抑真菌特性及無菌檢查方法的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證

供試品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變時，檢查方法應(yīng)重新驗(yàn)證，并對每一株試驗(yàn)菌逐一進(jìn)行驗(yàn)證。（1）菌種及菌液制備同培養(yǎng)基靈敏度試驗(yàn)方法（2）方法驗(yàn)證方法培養(yǎng)基接種菌加菌量接種管數(shù)培養(yǎng)天數(shù)（cfu）（支）（天）直接接種法硫乙醇酸鹽金黃色葡萄球菌＜10023-5銅綠假單胞菌2生孢梭菌2枯草芽孢桿菌2改良馬丁白色念珠菌＜10023-5黑曲霉23-5薄膜過濾法同直接接種法

接種2管中其中1管接規(guī)定量的供試品，另1管作為對照

⑵直接接種法

取規(guī)定量培養(yǎng)基分別接入小于100cfu的試驗(yàn)菌（6種菌）各2管，其中1管接入規(guī)定量供試品，另1管作為對照。培養(yǎng)3～5天。

（3）

結(jié)果判斷與對照管比較如含供試品各管中的試驗(yàn)菌均生長良好，則供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無抑菌作用。按此法進(jìn)行供試品的無菌檢查。

如含供試品的任一容器中微生物生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下有抑菌作用。應(yīng)采取措施，消除供試品的抑菌作用。并再重新進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)

四、供試品的無菌檢查法

無菌檢查方法包括直接接種法和薄膜過濾法。如供試品允許應(yīng)優(yōu)先采用薄膜過濾法.

3.檢驗(yàn)數(shù)量指一次檢驗(yàn)所用供試品最小包裝容器的數(shù)量除另有規(guī)定外參照表1、2、3采用薄膜過濾法應(yīng)增加1/2的最小檢驗(yàn)數(shù)量作為陽性對照；采用直接接種法應(yīng)增加供試品1支（瓶）作為陽性對照。4.檢驗(yàn)量指一次試驗(yàn)所用供試品總量（g/ml）除另有規(guī)定外參照表2、3。若每支（瓶）供試品裝量按規(guī)定足夠接種兩份培養(yǎng)基，則應(yīng)分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基。采用薄膜過濾法時，檢驗(yàn)量不應(yīng)少于直接接種法的總量，只要供試品的特性允許，應(yīng)將所有容器內(nèi)的全部內(nèi)容物過濾.

5.薄膜過濾法過濾器應(yīng)優(yōu)先選擇封閉式薄膜過濾也可使用一般薄膜過濾器。選擇濾膜材質(zhì)時應(yīng)考慮供試品及其溶劑的特性，水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥。⑵可溶水的固體制劑供試品取規(guī)定量，按標(biāo)簽說明復(fù)溶，根據(jù)其溶解性按水溶液或非水溶性制劑項(xiàng)下方法操作。⑶裝有藥物的注射器供試品按水溶性制劑或非水溶性供試品項(xiàng)下方法操作，針頭直接接種。

（4）β-內(nèi)酰胺類抗生素供試品取規(guī)定量，按水溶性制劑或無菌粉針劑及無菌粉末原料的供試品處理法處理，薄膜過濾，用沖洗液沖洗數(shù)次。最后一次用適量的β-內(nèi)酰胺酶沖洗液清除殘留在濾筒、濾膜上的抗生素后接種培養(yǎng)基；或?qū)V膜直接接入含適量β-內(nèi)酰胺酶的培養(yǎng)基。

（5）非水溶性的供試品取規(guī)定量，直接進(jìn)行過濾或溶于含適量聚山梨酯80或其它適宜乳化劑的稀釋液中，充分混合，立即過濾，用0.1%～1%聚山梨酯80蛋白胨溶液沖洗濾膜至少3次，于含或不含聚山梨酯80培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

（6）可溶于十四烷酸異丙酯的膏劑和黏性油劑供試品檢查方法

取規(guī)定量供試品加入適量不超過44℃無菌十四烷酸異丙酯內(nèi)，劇烈振搖，使供試品充分溶解，趁熱過濾（脂膜），或加入100ml稀釋液中，充分振搖萃取，靜置，取下層水相作為供試液過濾。過濾后用適量的沖洗液沖濾膜數(shù)次（水膜）。十四烷酸異丙酯的配制

:

采用薄膜過濾法除菌，選用孔徑為0.22um的脂溶性濾膜，濾膜在140℃干熱滅菌2小時。

（7）無菌氣（噴）霧劑供試品取規(guī)定量，將樣品容器置冰室冷凍約1小時。速以無菌手續(xù)在容器上端鉆一小孔，釋放拋射劑后再無菌開啟容器，按水溶性制劑或非水溶性制劑項(xiàng)下方法檢驗(yàn)。（8）具有導(dǎo)管的醫(yī)療器具（輸血、輸液袋等）取規(guī)定量，每個最小包裝用50ml～100ml沖洗液分別沖洗內(nèi)壁，集中沖洗液于適宜的無菌容器中，薄膜過濾。同時應(yīng)做包裝中所配帶的針頭的無菌檢查（直接接種法）。

6.直接接種法

供試品按規(guī)定量分別接入含培養(yǎng)細(xì)菌和真菌培養(yǎng)基的容器中，除另有規(guī)定外，每個容器中的培養(yǎng)基量應(yīng)符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%。同時硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基每管裝量不得少于15ml、改良馬丁培養(yǎng)基每管裝量不得少于10ml，培養(yǎng)基用量和高度應(yīng)經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證。①一般水溶性供試品②混懸液等非澄清水溶液供試品取規(guī)定量接種至培養(yǎng)基中。③固體制劑供試品取規(guī)定量直接接種，或加入適宜的溶劑溶解，或按標(biāo)簽說明復(fù)溶后，取規(guī)定量接種至培養(yǎng)基中。④?-內(nèi)酰胺類或磺胺類供試品取規(guī)定量，混合，加入適量的無菌?-內(nèi)酰胺酶溶液或?qū)Π被郊姿崛芤菏怪泻?，接種至培養(yǎng)基中?；蚪尤牒?-內(nèi)酰胺酶或?qū)Π被郊姿岬呐囵B(yǎng)基中。⑤非水溶性供試品取規(guī)定量，混合，加入適量的聚山梨酯80或其它適宜的乳化劑及稀釋劑使其乳化，接種至培養(yǎng)基中?；蛑苯咏臃N至含聚山梨酯80或其它適宜乳化劑的培養(yǎng)基中。⑥敷料供試品取規(guī)定數(shù)量，以無菌操作拆開包裝，于不同部位分別剪取約100mg或1cm×3cm的供試品，接種于足以浸沒供試品的適量培養(yǎng)基中。⑦腸線、縫合線等供試品腸線、縫合線及其它一次性使用的醫(yī)用材料按規(guī)定量取最小包裝，無菌拆開包裝，接種于足以浸沒供試品的適量培養(yǎng)基中。⑧滅菌醫(yī)用器具供試品取規(guī)定量，必要時應(yīng)將其拆散或切成小碎段，接種于足以浸沒供試品的適量培養(yǎng)基中。⑨放射性藥品取供試品1瓶(支)，接種于裝量為7.5ml的培養(yǎng)基中。每管接種量為0.2ml。

7.培養(yǎng)及觀察

培養(yǎng)14天，如果培養(yǎng)基渾濁或培養(yǎng)14天后從外觀不能判斷是否長菌，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種培養(yǎng)基或斜面上，培養(yǎng)細(xì)菌2天、真菌3天，觀察有無菌生長或鏡檢進(jìn)行判斷。陰性對照不得有菌生長。

8.結(jié)果判斷若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長，判供試品符合規(guī)定。若供試品中任何1管顯混濁并確證有菌生長，判供試品不符合規(guī)定。

除非能充分證明，生長的微生物非供試品所含。當(dāng)符合下列至少一個條件時，方可判試驗(yàn)結(jié)果無效：

⑴對無菌檢查試驗(yàn)所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無菌檢查法的要求；⑵回顧無菌試驗(yàn)過程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素；⑶陰性對照管有菌生長。⑷供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后，確證微生物生長是因無菌試驗(yàn)中所使用的物品和（或）無菌操作技術(shù)不當(dāng)引起的。試驗(yàn)若經(jīng)確認(rèn)無效，應(yīng)重試。重試時，重新取同量供試品，依法重試，若無菌生長，判供試品符合規(guī)定，若有菌生長判供試品不符合規(guī)定。

表1

批產(chǎn)品出廠最少檢驗(yàn)數(shù)量供試品批產(chǎn)量N（個）每種培養(yǎng)基最少檢驗(yàn)數(shù)量注射劑

≤10010%或4個（取較多者）

100＜N≤50010個

＞5002%或20個（取較少者）大體積注射劑＞100ml

2%或10個（取較少者）眼用及其他非注射產(chǎn)品

≤2005%或2個（取較多者）

＞20010個桶裝固體原料

≤4每個容器

4＜N≤5020%或4個容器（取較大者）

＞502%或10個容器（取較大者）抗生素固體原料藥（≥5克）

6瓶(支)醫(yī)療器具

≤10010%或4件（取較大者）

100＜N≤50010件

＞5002%或20件（取較少者）

注：若每個容器中的裝量不足接種兩種培養(yǎng)基，那么表中的檢驗(yàn)數(shù)量應(yīng)加倍

表2.上市抽驗(yàn)樣品（液體制劑）的最少檢驗(yàn)量供試品裝量V(ml)每支樣品接入每管培養(yǎng)基的最少量（ml）最少檢驗(yàn)數(shù)量（瓶或支）≤1全量

20①1＜V＜5半量105≤V＜2021020≤V＜5051050≤V＜100101050≤V＜100(靜脈給藥)半量10100≤V≤500半量6V＞50050061.每種培養(yǎng)基各接種10支供試品。

表3上市抽驗(yàn)樣品（固體制劑）的最少檢驗(yàn)量供試品裝量M（/支、瓶或個）每支樣品接入每管培養(yǎng)基的最少量（mg）最少檢驗(yàn)數(shù)量（瓶或支）M<50mg全量

20①50mg≤M<300

mg半量10300

mg≤M<5g150

mg10M≥5g500

mg

10②外科用敷料棉花及紗布取100mg或1cm×3cm10縫合線、一次性醫(yī)用材料整個材料③

20①帶導(dǎo)管的一次性醫(yī)療器具（如輸液袋）

10其它醫(yī)療器具整個器具③（切碎或拆散開）

20①注：①.每種培養(yǎng)基各接種10支供試品。

②.抗生素粉針劑（≥5克）及抗生素原料藥（≥5克）的最少檢驗(yàn)數(shù)量為6瓶（或支），桶裝固體原料的最少檢驗(yàn)數(shù)量為4個包裝。③.如果醫(yī)用器械體積過大，培養(yǎng)基用量可在2000ml以上，將其完全浸沒。五、菌種驗(yàn)證試驗(yàn)所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。應(yīng)采用適宜的保存技術(shù)，防止試驗(yàn)菌株發(fā)生變異。

菌種的保存

對微生物實(shí)驗(yàn)來說菌種是特殊的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)給予相同于化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品的管理（溯源性、質(zhì)量的原始性）外，還有安全性方面的管理。1.

溯源性(菌種的來源)：藥品微生物實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)菌種應(yīng)來自中國藥品生物檢定所醫(yī)學(xué)菌種保藏中心（ChinaMedicalCultureCollection——CMCC）系列?；蛎绹幍涫蛰d的美國菌種保藏中心（AmericanTypeCultureCollection——ATCC）系列等國際法定菌種保藏中心。2.菌種的質(zhì)量控制：對選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)的典型菌落進(jìn)行鑒定。形態(tài)、染色鏡檢、純度、必要時應(yīng)做生化鑒定試驗(yàn)，一旦出現(xiàn)偏差，應(yīng)做進(jìn)一步的調(diào)查，所有被確認(rèn)受到污染或變異的菌種應(yīng)及時銷毀，不得用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)用。

3.菌種管的標(biāo)簽要求—名稱、編號、代數(shù)、有效期、制備日期

菌種記錄：名稱、編號、來源、菌落形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化與血清學(xué)鑒定、傳代數(shù)、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件、保藏方法、貯存條件及保藏庫址。4.菌種保藏方法有多種，但對不同的微生物應(yīng)通過保藏試驗(yàn)來選擇最適宜保藏方法。一般多用瓊脂斜面低溫保藏法、液體石蠟保藏法、干燥沙土保藏方法、冷凍真空保藏法、甘油冷凍管保藏法等。⑴瓊脂斜面低溫保藏方法實(shí)驗(yàn)室多采用此法一般在4℃保存。銅綠假單孢菌在室溫保存。

⑵液體石蠟保藏法本法是用石蠟將培養(yǎng)物與空氣隔絕，以降低菌種的生理、生化水平，延長菌種保藏時間。

方法：液體石蠟121℃高壓滅菌30min或110-170℃烘箱1-2h干燥去掉水分。

取經(jīng)培養(yǎng)的高層半固體菌管加入石蠟，高出培養(yǎng)基面1cm為宜，在4℃保藏。

⑶冷凍真空保藏法保護(hù)劑有多種，多用脫脂牛奶。將牛奶煮沸、靜止、冷卻除去上面一層脂肪，重復(fù)3次用脫脂棉過濾，113℃高壓滅菌30min，接入菌種，培養(yǎng)后低溫、冷凍、真空干燥置-35℃保存。（4）甘油冷凍管保藏法將待保藏菌接種平板或瓊脂斜面，適宜溫度下培養(yǎng)適宜時間后（細(xì)菌24～48小時的培養(yǎng)物，白色念珠菌72小時的培養(yǎng)物。），用無菌接種環(huán)輕輕刮取菌苔，并通過接種環(huán)與試管壁之間的輕輕摩擦使細(xì)菌充分?jǐn)U散到預(yù)先裝于試管中的無菌蒸餾水中，調(diào)整菌液濃度，向已制備好的菌懸液中加入等體積20％的無菌甘油，輕輕振搖小管，使內(nèi)容物充分混和，分裝于無菌小管，制好的甘油冷凍管最好在－30℃貯存。5、微生物廢棄物的滅活

廢棄的菌種、菌液、帶菌培養(yǎng)基以及帶菌器皿須經(jīng)過高壓（121℃）滅菌后方可處理。無菌室管理制度1無菌室的要求1.1無菌室是專門進(jìn)行藥品無菌、微生物限度檢查的試驗(yàn)室，不得進(jìn)行其他試驗(yàn)，無菌檢查用無菌室與微生物限度檢查用無菌室應(yīng)各自獨(dú)立。1.2無菌室由更衣室、緩沖室及操作間組成。1.3無菌室設(shè)連鎖式傳遞窗口，以保證人流物流分開。1.4操作間應(yīng)達(dá)到潔凈度10，000級，內(nèi)設(shè)無菌凈化臺，潔凈度達(dá)到100級。1.5第二更衣室設(shè)有洗手盆。1.6各房間設(shè)有照明燈，紫外燈。電源開關(guān)應(yīng)設(shè)在室外。1.7無菌室應(yīng)有空氣凈化除菌的層流系統(tǒng)，保證試驗(yàn)時空氣正壓。1.8無菌試驗(yàn)時無菌室的溫度應(yīng)控制在18～26℃范圍內(nèi)，相對濕度應(yīng)控制在60%以下。2無菌室的管理2.1無菌室由專人管理2.2無菌室應(yīng)每半年檢測一次室內(nèi)的潔凈度（塵埃粒子計(jì)數(shù)儀）并應(yīng)符合要求，同時做好記錄。每一個月檢測一次室內(nèi)的無菌度（平板計(jì)數(shù)法），應(yīng)符合要求，同時做好記錄。2.3無菌室內(nèi)僅存放最必須的檢驗(yàn)用具，保持固定位置，不隨意移動。3無菌室的使用3.1每次試驗(yàn)前應(yīng)用消毒劑擦拭工作臺面及可能污染的死角，開動空氣凈化系統(tǒng)及紫外燈殺菌20～30分鐘。3.2人員進(jìn)入無菌室須經(jīng)更衣并洗手后方可進(jìn)入無菌室。3.3檢驗(yàn)樣品及培養(yǎng)基等試驗(yàn)物品進(jìn)入試驗(yàn)室必須通過傳遞窗，并在傳遞窗內(nèi)經(jīng)紫外燈照射20～30分鐘。在操作間內(nèi)除去物品的外包裝后進(jìn)行試驗(yàn)。3.4根據(jù)檢測的情況決定是否用丙二醇進(jìn)行空氣消毒，及更換濾器。3.5每次試驗(yàn)后同樣須用消毒劑擦拭工作臺面，及可能污染的死角，打掃干凈臺面、地面后繼續(xù)開動空氣凈化系統(tǒng)以除去室內(nèi)的濕