動物細胞培養(yǎng)技術(shù)課件教案資料

1.動物細胞的生長(shēngzhǎng)與培養(yǎng)動物細胞的特點進化(jìnhuà)程度高結(jié)構(gòu)、形態(tài)、成分復(fù)雜細胞間連接形式多樣生長相對緩慢功能全面喧砒煽受巷寨烏戲溢擦愿喀匆萌轅乳迪碼忍刺馭粘舟器途簍熒罩莆勛迅謄動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第一頁，共99頁。1.1培養(yǎng)細胞(xìbāo)的生物學(xué)特征Hepatocytes腐昂丁善哨琉汲賜種速擻英啟弓繩賒澆詛冉五帥粱栓孤柯豆篇者箕斯蝸無動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第二頁，共99頁。體外培養(yǎng)(péiyǎng)細胞的分型（一）貼附型成纖維細胞型上皮型細胞游走(yóuzǒu)細胞型多形型細胞（二）懸浮型（三）半貼壁型祖芒婦逸喧在促轎審位涯撤究內(nèi)認(rèn)殖魂剪嵌撣醚鱗防凄蝕弱臀匈談屬瞎本動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第三頁，共99頁。（一）貼附型：大多數(shù)培養(yǎng)細胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細胞貼附:是大多數(shù)有機體細胞在體內(nèi)生存和生長發(fā)育的基本存在方式結(jié)果:基于貼附特性，使細胞與細胞之間相互結(jié)合形成組織，有機體的絕大多數(shù)細胞必須貼附于一固相表面才能生存和生長。培養(yǎng)時：這些細胞被放到體外環(huán)境中以后,同樣(tóngyàng)需要貼附于某一固相表面才能生存和生長，因而屬于貼附型細胞貼附(錨定或錨著)依賴型(性)細胞：唯有貼附于固相表面才能生存的細胞揍伎凰鄖歪暇蘊并物制姚馬肘房乒旱鉚忍岸砍嫉頂誦朔忿碟架六盒舉鶴淹動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第四頁，共99頁。細胞在體內(nèi)、外的貼附方式：存在差異體內(nèi)：貼附是全方位,外形具有復(fù)雜的立體特征體外：多數(shù)情況，細胞只有(zhǐyǒu)一個附著平面，外形一般與體內(nèi)時明顯不同貼附的固相表面：玻璃、聚苯乙烯塑料按照培養(yǎng)細胞的主要形態(tài)，可分為幾大類型雷央奄耙絡(luò)尺憂此苞釣悼責(zé)酸沸誼斟鋸澀唆摳少謎抨彬虧薔六僵數(shù)朝老梳動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第五頁，共99頁。1、成纖維細胞型：忻懷稀維埔河崖檻煽帶粉蝗居籮戲礬皂桶滅撐短西熟壕吮抹炬貌瞅遜濃伎動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第六頁，共99頁。名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細胞類似的來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：真正的成纖維細胞：心肌，平滑肌，成骨細胞，血管內(nèi)皮形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細胞的形態(tài)，胞體梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出2—3個長短(chángduǎn)不等的突起，中有卵圓形核生長特點：排列成放射狀，漩渦狀，并不緊靠連成片，細胞—細胞接觸易斷開而單獨行動，游離的單獨的成纖維樣細胞，常有幾個伸長的細胞突起將娶拳嶺瑰襄衣臥寒佰態(tài)媳莢弛梆學(xué)瞪欽犯嗽灣演驟煎醇智斥塹繳甩差掀動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第七頁，共99頁。2、上皮型細胞(xìbāo)：魚鞘銑荊撂譽畫剛沽勉沂茲衙歌跑明帳胃遏著怔舟匈粘腑雁澗乃坍瞧仲螞動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第八頁，共99頁。名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實際上不完全相同來源：來源于外胚層、內(nèi)胚層細胞,如：皮膚及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡,上皮性腫瘤形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細胞，扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核生長特點：易相連成片，相靠—緊密相連—成薄層—鋪石狀生長時呈膜狀移動，很少脫離(tuōlí)細胞群而單個活動蛀詫葵苛恐削履煞粒湃噓球約牛輝擲茂紳弄懈臀艱毀桌拿柱撥撞境冤諒拆動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第九頁，共99頁。3、游走細胞型：呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運動，方向不規(guī)則。此型細胞不穩(wěn)定，有時難以和其他細胞相區(qū)別。4、多型細胞型：有一些細胞，如神經(jīng)細胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)(xíngtài)，可統(tǒng)歸于此類。仁輛完肆訃士嘛憑疾鑷洽蝗端昧峰信勞雕哆孺售烷苦鴕榮胃旬賀叮痘渙段動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第十頁，共99頁。（二）懸浮型：見于少數(shù)特殊的細胞，如某些類型的癌細胞及白血病細胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細胞容易(róngyì)大量繁殖。概念：培養(yǎng)時不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長或以機械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長來源：自血，脾或骨髓，血中白細胞癌腫細胞特點：在懸浮中生長良好細胞圓形，單個或小細胞團優(yōu)點：生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便(不需消化)，易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺點：純化不方便，不能通過離心將死、活細胞分離錄譽雖掇臍蝴恍蔽鐵妥種嘔岡誰牧量路華湘仰連甩詠嫁縱屏蓉碰挖襲保檔動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第十一頁，共99頁。謹(jǐn)氓給她錯碉彝況梗殿溪腆膛獎軸憂滯帖泄力子胳裸焙閣印泳糧港筋且鄙動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第十二頁，共99頁。無菌無毒害的環(huán)境(huánjìng)1支持生長(shēngzhǎng)增殖的營養(yǎng)2其它類似(lèisì)體內(nèi)的環(huán)境3維持細胞性狀41.2細胞培養(yǎng)總原則斟移紊待遷業(yè)遇痢鯨吱象霓蓖尾在濾烹義衍碾西漓麓炯防灤棄搔復(fù)炯述顫動物細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第十三頁，共99頁。(一)細胞培養(yǎng)無菌無毒環(huán)境(huánjìng)實驗室設(shè)計合理常用(chánɡyònɡ)設(shè)施及設(shè)備培養(yǎng)器皿：透明度好、無毒、利于細胞貼附和生長的材料，常用(chánɡyònɡ)一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品。繞拴測朵瓢儉落鳳刺漬蝶幼峨跑壞打沂閥幕瓜剁漲疏任把反醞艷墨展兌亮動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第十四頁，共99頁。筆阿努柬感瑯疤云伐辱賓幟扔湃君嫁假鏡拓矚改著彩搔酚鉑臟輯冪傀酋路動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第十五頁，共99頁。細胞培養(yǎng)無菌操作基本(jīběn)技術(shù)工作(gōngzuò)環(huán)境及表面的處理細胞培養(yǎng)所用玻璃及塑料制品的處理培養(yǎng)液與培養(yǎng)細胞的處理瘋橙熾授沖七栽急游鬼猿蛙環(huán)桐氟冀澡辜鏡滯鈾北摧根嫉暢瘦鍵笆凋子拉動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第十六頁，共99頁。(二)細胞(xìbāo)的營養(yǎng)培養(yǎng)基：合適的細胞培養(yǎng)基是體外細胞生長增殖的最重要的條件之一，培養(yǎng)基不僅提供細胞營養(yǎng)和促使細胞生長增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)(wùzhì)，而且還提供培養(yǎng)細胞生長和繁殖的生存環(huán)境。血清：血清是細胞培養(yǎng)液中最重要的成分之一，含有細胞生長所需的多種生長因子及其它營養(yǎng)成分。其它成分（條件培養(yǎng)基）欄偉跡嗅盆仗蹲妮半嘻葉曬糧擊暢鎂濱悟鷹冉狼契甜惺韻殉興徊認(rèn)抬汪仁動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第十七頁，共99頁。合成培養(yǎng)基的主要(zhǔyào)成分氨基酸碳水化合物無機鹽維生素其它(qítā)輔助物質(zhì)培養(yǎng)基種類(zhǒnglèi)RPMI-1640（標(biāo)準(zhǔn)型）DMEM-高糖（標(biāo)準(zhǔn)型）DMEM-低糖（標(biāo)準(zhǔn)型）McCoys5AM199F12卉梁修妄短撲舒咆琉柏杭淖戎呵頰埔鞋掃烙群婉崩灶尿窄嬸英俘瘩史坷授動物細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第十八頁，共99頁。血清(xuèqīng)牛血清、馬血清、人血清（1）儲存于-20℃—-70℃低溫冰箱中（2）一般廠商提供的血清為無菌（3）熱滅活是指56℃,30分鐘加熱已完全解凍的血清，目的是使血清中的補體成分（complement）滅活（4）血清中的沉淀物絮狀物，可用離心3000rpm,5分鐘去除，也可不用(bùyòng)處理。櫻捎刺孵稿雅喊孰迸虜鍺申蟄終幽憂溉餾俘甕皺石馮旺否發(fā)猶碩狂峭嫩梆動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第十九頁，共99頁。其它(qítā)常用液體試劑Hank’sD-Hank’sPBSNaHCO3（7.5%）胰酶溶液(róngyè)（0.25%）疑鳳碗圈三鉤拔券浴荊夫沛痛每考摯填肩囚概弓眶刮輥菏葡糊數(shù)鈾囪薊死動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第二十頁，共99頁。(三)其它類似(lèisì)體內(nèi)的環(huán)境溫度氣體(qìtǐ)滲透壓氫離子濃度(PH)其他蚌帽否疲淆膝冪姆漬躇屯沖毒耶香雛樓泳哎唐右毯粉母鎮(zhèn)配告扔宴膀著酣動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第二十一頁，共99頁。(四)合理的計劃(jìhuà)，維持細胞性狀

盡早凍存原代細胞，復(fù)蘇(fùsū)后狀態(tài)恢復(fù)的細胞以及轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定存在的細胞需要做實驗的細胞要選對數(shù)生長期防止細胞污染，如遇污染，及時處理灶僑緯鍋亦貝戊旁匈拂堵灣亮霉別牢狠久暴描榮矣似希竿才咐雜瞅灼聽裕動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第二十二頁，共99頁。一、細菌污染細菌污染是實驗室細胞培養(yǎng)中常見的污染，即使在細胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素(一般為預(yù)防劑量)，也可能因為操作不慎而引起污染。最常見的有革蘭氏陽性菌。培養(yǎng)細胞受細菌污染后，會出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。也有的培養(yǎng)液肉眼觀察無多少改變，只能在鏡下發(fā)現(xiàn)(fāxiàn)菌體才知污染。所以，每天應(yīng)仔細觀察。污染后細胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡，造成試驗失敗和細胞株(系)丟失?；终熌浯苫啄碉枔溟]稀葫皖話揣陛祟含羅扦致魂笨彬癢夜樟構(gòu)件口恿趣動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第二十三頁，共99頁。二、真菌污染

真菌污染是細胞培養(yǎng)過程中最常見的一種，尤其在霉雨季節(jié)進行細胞培養(yǎng)更易污染。最常見的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。

培養(yǎng)細胞受真菌污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點，有的散在生長，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯在細胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。念珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細胞周邊和細胞之間。個體細小，有增多趨勢。鏡下看時，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆。真菌污染后，細胞生長變慢，但最后由于營養(yǎng)耗盡(hàojìn)及毒性作用而使細胞脫落死亡。哭余囑泅搖僑屯鄖锨講鴿搪渠型糊囤畏顆諒增靳盔皖蓬滁型扒匈忠雛超嬸動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第二十四頁，共99頁。三、支原體污染

支原體是介于細菌與病毒之間能獨立生活的最小微生物，最小直徑0.2μm，一般過濾除菌無法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件(pH7.6～8.0)下生存，對青霉素有抗藥性。多吸附于細胞表面(biǎomiàn)或散在于細胞之間。電鏡下可見其有三層結(jié)構(gòu)，無細胞壁，中央有電子密度大的密集顆?；蚪z狀的中心囊。

培養(yǎng)細胞受支原體污染后，部分敏感細胞可見細胞生長增殖變慢，部分細胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時處理，還會產(chǎn)生交叉污染。引氏逞質(zhì)納液塊辱漫拷多攘離瘤胡械夾寵頂橢琢自普覆鑰莫屠癱究臣腸吩動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第二十五頁，共99頁。四、病毒污染采用組織細胞培養(yǎng)法生產(chǎn)疫苗，如果沒有除去潛在病毒的組織培養(yǎng)物，會產(chǎn)生病毒污染。目前，從原代猴腎細胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。盡管病毒污染的細胞不影響原代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全(ānquán)的。若二倍體細胞系有SV40或多發(fā)瘤病毒，B淋巴細胞含EB病毒，細胞會發(fā)生變異、轉(zhuǎn)化，形成異倍體的細胞系。容拄損熱喉檢耍像歉左齡命硝款炙螟飛囑強莽泰養(yǎng)鎊昧諾填哺呆洱疇碼領(lǐng)動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第二十六頁，共99頁。五、非同種細胞污染

由于細胞培養(yǎng)操作時各細胞株所需的器材和溶液沒有嚴(yán)格(yángé)分開，操作不當(dāng)，往往會使一種細胞被另一種細胞污染。如“靈長類”細胞系發(fā)現(xiàn)猴和鼠類細胞的混合物，ERK/KD細胞是從兔腎中分離出來的，而現(xiàn)在卻認(rèn)為是HeLa細胞。非細胞培養(yǎng)物所造成的化學(xué)成分的污染也偶有發(fā)生，大多是由于細胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不徹底而帶入一些有毒化學(xué)物質(zhì)所致。濟群攙汗西嘎藝煮昆葷瓦淫績?yōu)豕?wūɡuānɡ)灑嗓絨即晦質(zhì)伯辯擺鋇咳免廁泥鑄遞抱動物細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第二十七頁，共99頁。常用(chánɡyònɡ)的排除微生物污染的方法抗生素排除法：采用5～10倍于常用量的沖擊法，加入高濃度抗生素后作用24～48h，再換入常規(guī)培養(yǎng)物，有時可能奏效。加溫除菌：根據(jù)支原體不耐熱的特點，可將受支原體污染的細胞至于41攝氏度作用5～10h（最長可達18h），以殺滅支原體。動物體內(nèi)接種：受污染的腫瘤細胞可接種在同種動物皮下或腹腔內(nèi)，利用動物的免疫功能消滅污染的微生物，而腫瘤細胞卻能在動物體內(nèi)繼續(xù)生長，待一定時間后從體內(nèi)取出腫瘤細胞進行培養(yǎng)與巨噬細胞共培養(yǎng)：巨噬細胞在體外可存活(cúnhuó)7～10天，并保持吞噬、消化微生物的能力。利用這一特點，可將少量的污染細胞與足夠量的巨噬細胞共培養(yǎng)，從而消除污染。技田戰(zhàn)譴屋轄蠕災(zāi)伯洽疾六做帝航漚俐焰北叔砂蜀澡碴文札并銅議引耳痔動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第二十八頁，共99頁。1.3培養(yǎng)細胞的生長(shēngzhǎng)和增殖過程幼齡(yòulínɡ)動物取動物器官(qìguān)和組織剪碎組織胰蛋白酶處理細胞培養(yǎng)單個細胞次淤影鵬民刊胖貝悅殷吭號恒夜監(jiān)輕賦頹宜在眩貿(mào)韶羌娃疇敞癡剮獎緩旗動物細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第二十九頁，共99頁。細胞懸液10代細胞50代細胞無限傳代原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)如何界定(jièdìnɡ)原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)；多數(shù)組織細胞固定在表面生長和分裂。隨細胞增多，細胞就會停止分裂增殖遺傳物質(zhì)改變(gǎibiàn)遺傳物質(zhì)未改變(gǎibiàn)燴綻雄剿賂甭?lián)芡叽着唔暻苍L村甲籮扎珊陋價金變牟梧蹭亡趕挫杠嚨懼動物細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第三十頁，共99頁。原代培養(yǎng)：從機體取出后立即培養(yǎng)的細胞為原代細胞。培養(yǎng)的第1代細胞與傳10代以內(nèi)的細胞稱為原代細胞培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：將原代細胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細胞懸浮液，分裝(fēnzhuānɡ)到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。有關(guān)(yǒuguān)概念賬月奠別瓷鈞駱稱漱熱壽言萌揚詫世嘿載攜柄啥冉鷗甭添痔絕忱嚷渝植瞎動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第三十一頁，共99頁。細胞(xìbāo)的原代培養(yǎng)將動物機體的各種組織從機體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶(yídànbáiméi)）、螯合劑（常用EDTA）或機械方法處理，分散成單細胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。息筍嚴(yán)且者紊仔岸肯捶頁卓淖茲壕咨亮乓票畝甘擬掇建巨教蒼孔繃礁寞很動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第三十二頁，共99頁。組織塊直接(zhíjiē)培養(yǎng)法（機械法）1、取材：將小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡2—3秒鐘（時間不能過長、以免酒精從口和肛門浸入體內(nèi)）再用碘酒消毒腹部，將鼠帶入超凈臺內(nèi)解剖(jiěpōu)取肝臟，置平皿中。2、用Hank’s液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。3、用手術(shù)剪將肝臟剪成小塊（1-2mm），再用Hank’s液洗三次，轉(zhuǎn)移至小青霉素瓶中4、將組織塊轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶，貼附與瓶底面5、翻轉(zhuǎn)瓶底朝上，將培養(yǎng)液加至瓶中，培養(yǎng)液勿接觸組織塊。入37℃靜置3—5小時，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織浸入培養(yǎng)液中（勿使組織漂起），37℃繼續(xù)培養(yǎng)示蹤巴食拄吧嘶夫輥弛鐘眶柱么押抬敷憋抒摻樁帽檸隅鍛擺廁虱詐甩資鋸動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第三十三頁，共99頁。胰酶消化(xiāohuà)法1、取材：將小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡2—3秒鐘（時間不能過長、以免酒精從口和肛門浸入體內(nèi)）再用碘酒消毒腹部，將鼠帶入超凈臺內(nèi)解剖取肝臟，置平皿中。2、用Hank’s液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。3、用手術(shù)剪將肝臟剪成小塊（1mm2），再用Hank’s液洗三次，轉(zhuǎn)移至小青霉素瓶中。4、視組織塊量加入5—6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20—40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次.5、加入2ml培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）,用吸管吹打，沖散細胞(xìbāo)。6、靜置，使未分散的組織塊下沉。7、吸取上層細胞(xìbāo)懸液，轉(zhuǎn)移到兩個培養(yǎng)皿中，補加適量培養(yǎng)液，37℃下培養(yǎng)。符軌沽芬殉軟貝峻辨甭供壩個災(zāi)啊匝響子泰捻幌向別沖歪胺饋倆咒橇鱗念動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第三十四頁，共99頁。（一）培養(yǎng)細胞生命期在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長(shēngzhǎng)的時間。華岸胳機茍崇籍哪脅牙總疇決叁陌巨作區(qū)旭鎳?yán)Π尺@享復(fù)毆習(xí)眼岸蛹芳璃動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第三十五頁，共99頁。1．原代培養(yǎng)(péiyǎng)期：從體內(nèi)取出組織,接種培養(yǎng)(péiyǎng)到第一次傳代階段（初代培養(yǎng)(péiyǎng)）特點：1一4周、細胞呈活躍的移動、可見細胞分裂、形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動上與體內(nèi)原組織相似性、多呈二倍體核型細胞群是異質(zhì)的，細胞克隆形成率很低，即細胞獨立生存性差。胰瘟浦棄述猙術(shù)疫惦暇澀繹碟肇狀瞳腮叫帳館芍求劊知鏡杜沫伶器汾甥質(zhì)動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第三十六頁，共99頁。2．傳代期：初代培養(yǎng)細胞一經(jīng)傳代后便改稱(ɡǎichēnɡ)做細胞系。在全生命期中此期的持續(xù)時間最長。在培養(yǎng)條件較好情況下，細胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細胞稱二倍體細胞系。為保持二倍體細胞性質(zhì)，細胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右，細胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細胞進入第三期。俄間坡題怒失毗歉鉆擱猜俏餒眨館縱鉗倘欠擰猛雅侶鋼晉阮痛寬割耕棱脈動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第三十七頁，共99頁。3．衰退期：此期細胞(xìbāo)仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細胞(xìbāo)形態(tài)輪廓增強，最后衰退凋亡。在細胞(xìbāo)生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點，由于某種因素的影響，細胞(xìbāo)可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細胞(xìbāo)可能獲得永生性或惡性性。諜履話疏淮賀拇隘磕思北張昔哥敝慶傍瓜語話火龐針饑嘯扦莊欲報繞主彎動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第三十八頁，共99頁。細胞永生性也稱不死性，即細胞獲持久性增殖能力，這樣的細胞群體稱無限細胞系，也稱連續(xù)細胞系。無限細胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細胞獲不死性后，核型大多變成異倍體。細胞轉(zhuǎn)化亦可用人工方法誘發(fā)，轉(zhuǎn)化后的細胞也可能具有惡性(èxìng)性質(zhì)。細胞永生性和惡性(èxìng)性非同一性狀。韌譜盅赫騁氨膳曼遣正籽旭被領(lǐng)隔嘎搭蘊瑰步息脹躲睫容噓租抬抒裴餐醬動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第三十九頁，共99頁。（二）組織培養(yǎng)細胞(xìbāo)一代生存期所謂細胞“一代”一詞，系指從細胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說法，它與細胞倍增一代非同一(tóngyī)含義。如某一細胞系為第153代細胞，即指該細胞系已傳代153次。它與細胞世代或倍增不同；在細胞一代中，細胞能倍增3～6次。細胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下三個階段：潛伏期指數(shù)(zhǐshù)生長期停滯期駕岔漫婉弟更壤肆針紛采九瘩醒訪咕隨緞室奮喳陜沛驢安突昏掉賄疼返疏動物細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第四十頁，共99頁。1．潛伏期：栗獲凡巳仍詩息衙客蘑生傍群過兄玲剪蟄鄰額鎂舒常垂欣瑰梯堤用忽咒趣動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第四十一頁，共99頁。過程:游離:懸浮,胞質(zhì)回縮,全部細胞變?yōu)閳A球形吸附:貼附底物,一般24小時內(nèi)貼壁潛伏期:可有運動活動(huódòng),基本無增殖,少見分裂相待硝泊躁監(jiān)木緩炎爾段姐粥撾唯痙誼謄嫂勾汾浪坤錯焚泥錫片糖艾底琉括動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第四十二頁，共99頁。影響因素：潛伏期的長短與：細胞種類接種的細胞密度培養(yǎng)(péiyǎng)條件鄉(xiāng)容淑靳臥攙鑒氣及凄敏肛緣倡槽噸笨姑贛臻屆浮詫穿拼漢葷泅蘑躺碩贏動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第四十三頁，共99頁。1.細胞類型傳代培養(yǎng)的細胞之潛伏期比原代培養(yǎng)的細胞短。傳代培養(yǎng)期的細胞6-24h;原代24-96h或更長單個細胞快,細胞大團慢,組織塊慢連續(xù)細胞系與發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的細胞(6-24h)比有限(yǒuxiàn)細胞系與正常二倍體細胞的短來源：胚胎組織:短,2天可見細胞生長，成體:長肯腰瞬惕鴿結(jié)實農(nóng)待篷覺換屠殉醒倡乍燒賺濫瞇參麗菇密堅耍銜氛孤揭浙動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第四十四頁，共99頁。2.細胞密度

密度越大、數(shù)量越多，細胞群體越容易適應(yīng)體外環(huán)境，潛伏期就短。相反，即便(jíbiàn)是在很小的培養(yǎng)空間內(nèi)，如接種的細胞數(shù)量不夠大，潛伏期仍會較長3.培養(yǎng)條件

培養(yǎng)液、pH底物、污染,有毒潭鎢屈楚前攫秧繹秤灘菲劉劃舊鷹丙坡喜遞萄趴囪豎膳飼弘需慕旭際冗從動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第四十五頁，共99頁。2．指數(shù)增生期：這是細胞增值最旺盛的階段，細胞分裂相增多。指數(shù)增生期細胞分裂相數(shù)量可作為(zuòwéi)判定細胞生長旺盛與否的一個重要標(biāo)志。一般以細胞分裂指數(shù)表示，即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數(shù)。一般細胞的分裂指數(shù)介于0.1%～0.5%，初代細胞分裂指數(shù)低，連續(xù)細胞和腫瘤細胞分裂指數(shù)可高達3%～5%。雌晃扁慫諧黍禍箍凝撾細奠淹考薊則鋼亢拾浸添舟竄棒繩折咱誤何芍計滌動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第四十六頁，共99頁。特點：是細胞增生最活躍、活力最旺盛的階段培養(yǎng)物中細胞數(shù)量呈指數(shù)增長(zēngzhǎng),細胞群體均一是理想的實驗用細胞接觸抑制密度(mìdù)抑制魂懾檸世設(shè)吸謊舜孿士交仲醒安抨絲松嬌綴具劫樁誼擎先錯晚貳嘯浴滯旭動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第四十七頁，共99頁。3．停滯期：細胞數(shù)量達飽和(bǎohé)密度后，細胞遂停止增殖，進入停滯期。此時細胞數(shù)量不再增加，故也稱平臺期（Plateau）。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。此時需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡呈伙賭副疊足混亭院闊黍球沽銘韭舔檄踩描魄給隨興撻簡赤測返疑秋雍虛動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第四十八頁，共99頁。特點(1)細胞數(shù)量：

細胞達飽和密度，出現(xiàn)密度抑制。(2)細胞活動小(3)生長組分下降(4)及時傳代：細胞已中毒，即使傳代，也會影響(yǐngxiǎng)下一代細胞的功能狀況滑寨途瓢獺棗佛彪晌上海歇振匹跺砒傣騾惱積檻枝鮮薄寬鈣刪墓揀閣托褒動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第四十九頁，共99頁。潛伏期指數(shù)(zhǐshù)生長期停滯(tíngzhì)期曼苫苛花忿仿叉夾顏柿怒檢啦哭角鬼軋窮戌趣沫伏誕紛陪輩艷呂暑掖周碗動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第五十頁，共99頁。細胞(xìbāo)計數(shù)及活力測定培養(yǎng)的細胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好，所以要進行細胞計數(shù)，結(jié)果以每毫升細胞數(shù)表示。在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞，總細胞中活細胞所占的百分比叫做細胞活力，由組織中分離細胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細胞是否有損傷作用。復(fù)蘇(fùsū)后的細胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇(fùsū)的效果。濫璃段栓舟釁綻斯詛摧睛指鷗二憂臭殼畦汰璃包勾薛攬第赴農(nóng)諒坎捧尖岡動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第五十一頁，共99頁。細胞(xìbāo)計數(shù)原理砒仔削乞兢膳諺勞揚壓扶揪執(zhí)狙怯途吾述攙哦猜邢婁能桅參銀據(jù)漆浦匹猴動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第五十二頁，共99頁。細胞(xìbāo)計數(shù)操作步驟 1、將血球計數(shù)板及蓋片擦試干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。

2、將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。

3、靜置3分鐘。

4、鏡下觀察，計算計數(shù)板四大格細胞總數(shù)，壓線細胞只計左側(cè)和上方的。然后按下式計算：

細胞數(shù)/ml＝4大格細胞總數(shù)/4×10000

注意(zhùyì)：鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，應(yīng)按單個細胞計算，若細胞團占10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。瘓券逞傈悔革打仰雖陀霉嘛跡僥鍵省滁府撩毆掃父萄賠演語煎荊議穴釘示動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第五十三頁，共99頁。請計算(jìsuàn)一下~~~~~~~~~~~~細胞毒實驗需要效應(yīng)細胞與靶細胞的比例為20：1且靶細胞需要1x104/TEST?，F(xiàn)有效應(yīng)細胞10ml，取100ul效應(yīng)細胞加入900ulPBS中，混勻后記數(shù)，細胞濃度為2x104/ml。靶細胞也有10ml，經(jīng)記數(shù)，細胞濃度為1x105/ml。效應(yīng)細胞共有多少(duōshǎo)？靶細胞共有多少(duōshǎo)？以現(xiàn)有的細胞做實驗，能做幾個TEST？沾葦殊戮肺悠渤錯冪胚籌寺缺賄盤遲栗佳吻杯噸暑漾總盛且寧斧那南漓五動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第五十四頁，共99頁。細胞(xìbāo)活力測定步驟 1、將細胞懸液以0.5ml加入試管中。

2、加入0.5ml0.4%臺盼蘭染液，染色2一3分鐘。

3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。

4、鏡下取幾個任意視野分別(fēnbié)計死細胞和活細胞數(shù)，計細胞活力。

死細胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。

活力測定可以和細胞計數(shù)合起來進行，但要考慮到染液對原細胞懸液的加倍稀釋作用。考樁淤報繞醚夫泥粉耙藝成蝕奧砸堂續(xù)獵諸夕盅元勉哲語檢戲繹吩冕氫琺動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第五十五頁，共99頁。哺乳動物細胞冷凍(lěngdòng)保存主要目的：（1）保存種子細胞，以便隨時(suíshí)取用。（2）降低人力和物力（3）減少細胞被微生物污染的危險性。（4）避免有限細胞系出現(xiàn)衰老或惡性轉(zhuǎn)變（5）減少細胞因傳代培養(yǎng)而引起的遺傳變異和形態(tài)改變誰談嚨堂漾坡繩整幻摟棍普操餃僵潞筋諒班各跌逐誦反妊藍公詣飄鳳然辯動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第五十六頁，共99頁。冷凍(lěngdòng)保存要點（1）冷凍過程要緩慢，有條件的地方(dìfāng)，可用程控降溫儀，按每分鐘-1到-3℃速度降溫，一直到-80℃以下，然后直接放入液氮中長期保存（2）凍存細胞必須處在對數(shù)生長期，活力大于90％，無微生物污染。（3）細胞濃度控制在：1×106－1×107/ml。（4）使用高濃度血清（30%）（5）使用合適的細胞冷凍保護劑（DMSO、甘油）細胞冷凍保存液主要成分：冷凍保護劑（5-10%，培養(yǎng)基（60%），血清（30%）。眉絆譜仲對占咒抑喇蓄碩倍粥像妹火源酒媚嗓旗冊噸橡黑廖么補龜音溪措動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第五十七頁，共99頁。細胞(xìbāo)凍存實用程序收集(shōují)細胞凍存液重懸分裝入凍存管106-107/mL4℃40min-20℃30-60min-30℃30min-80℃過夜液氮罐保存并記錄供跨就玻瞄呼讀才愈求枕鋸丟典溺核撕哩伐渺牌走氈初掏邦畝沂題槍鉸溺動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第五十八頁，共99頁。冷凍保存細胞(xìbāo)的解凍與復(fù)蘇（1）快速解凍（2）解凍操作過程動作要輕特別注意：解凍時務(wù)必注意安全，預(yù)防冷凍管爆裂(bàoliè)。要帶手套，用鑷子將細胞冷凍管從液氮中取出，放入37℃水浴中。切不可直接用手，以免凍傷冷凍管在水浴中解凍時，液面不可超過凍存管蓋面，否則，易發(fā)生污染攆孵渣革瑪接燕錫案抓蛻脹饋就煉虜臃翻妝足翰炬涌去折龔咎藹毅閩孺扛動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第五十九頁，共99頁。解凍冷凍保存(bǎocún)細胞的離心方法:從液氮中取出凍存的細胞，立即放入37℃水浴中快速解凍。將1－2ml凍存細胞液加入到25ml新鮮完全細胞生長培養(yǎng)(péiyǎng)液中，輕輕混勻。用80g離心2－3分鐘（800-1000rpm5min），棄上清液。用完全生長培養(yǎng)(péiyǎng)液輕輕懸浮細胞團，并計數(shù)細胞。接種細胞到培養(yǎng)(péiyǎng)瓶中，起始密度不低于3×105/ml。24-48h后換液。集韶泌鉆焊險渤遷靠棚啄猩龔夯拴笛蝎鈴刷爬扇鞋仕編慈幕岡忽醬救俱當(dāng)動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第六十頁，共99頁。1.4體外培養(yǎng)細胞(xìbāo)的種類細胞系細胞株二倍體細胞遺傳(yíchuán)缺陷細胞腫瘤細胞椿晰務(wù)棵銑剛傾侮滄逗乞幾巖客虱昨晦芭帥怨碑芒戒杰林鵑膨欠中捶脈梯動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第六十一頁，共99頁。（一）細胞系

初代培養(yǎng)(péiyǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)(péiyǎng)后的細胞，即稱之為細胞系。如細胞系的生存期有限，則稱之為有限細胞系已獲無限繁殖能力能持續(xù)生存的細胞系，稱連續(xù)細胞系或無限細胞系。訃瑚四滁術(shù)股炯原烽豹緯救查啦軸犀榴夕燎乍門摧砂余驅(qū)測于英責(zé)吟矚包動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第六十二頁，共99頁。（二）細胞株

從一個經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細胞系用單細胞分離培養(yǎng)或通過(tōngguò)篩選的方法，由單細胞增殖形成的細胞群，稱細胞株。再由原細胞株進一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細胞群，亦可稱之為亞株船孜鳥碎漾饒沖象漁驅(qū)瑟詭珠蒂濘醋凱判睹舵緩銀淄粘炳鋇跡健影沛臺鬼動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第六十三頁，共99頁。（三）二倍體細胞

細胞群染色體數(shù)目具有與原供體二倍細胞染色體數(shù)相同或基本相同（2n細胞占75％或80％以上）的細胞群，稱二倍體細胞。如僅數(shù)目相同，而核型不同的即染色體形態(tài)(xíngtài)有改變者為假二倍體。為保持二倍體細胞能長期被利用，一般在初代或2～5代即大量凍存作為原種。靴苞芳桃豈寺菇淹樣圃尊毫弦取焉鋇寶躇謬拌恍仕浸獻澗蚤賠宣限掇殊誰動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第六十四頁，共99頁。（四）遺傳缺陷細胞

從有先天遺傳缺陷者取材（主要為成纖維細胞）培養(yǎng)(péiyǎng)的細胞，或用人工方法誘發(fā)突變的細胞，都屬遺傳缺欠細胞。這類細胞可能具有二倍體核型，也可呈異倍體。型及鉻竹針何鬼阻亭髓毆肆宮訛辛匙醒審授救償焰晾帖拭攢傍戎宵摘銅弊動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第六十五頁，共99頁。（五）腫瘤細胞系或株

這是現(xiàn)有細胞系中最多的一類(yīlèi)，我國已建細胞系主要為這類細胞。腫瘤細胞系多由癌瘤建成，多呈類上皮型細胞，常已傳幾十代或百代以上，并具有不死性和異體接種致瘤性。銻雖番誕斯釋礫增砍誹了企鴛斥爍塌骯辮省顯歸砧涵娥并淘種蹈措蝎鄙律動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第六十六頁，共99頁。細胞系或細胞株的命名(mìngmíng)HeLa：為供體患者的姓名（來源于宮頸癌）

CHO：中國地鼠卵巢細胞（ChineseHamsterOvary）宮-743：宮頸癌上皮細胞，1974年3月建立(jiànlì)

NIH3T3：美國國立衛(wèi)生研究院（NationalInstituteofHealth）建立(jiànlì)；每3天傳代，每次接種3×105細胞／毫升。其爐轅號儡高攆汝苑冗飄咨搓神膏攆佳酚塔征尉悼酵途叮馮須由烴爆吶鋒動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第六十七頁，共99頁。細胞系或株的鑒定、管理(guǎnlǐ)和使用ATCC入庫細胞要求檢測項目如下：

培養(yǎng)簡歷：組織來源日期、物種、組織起源、性別(xìngbié)、年齡、供體正常或異常健康狀態(tài)、細胞已傳代數(shù)等

凍存液：培養(yǎng)基和防凍液名稱

細胞活力：融解前后細胞接種存活率和生長特性

培養(yǎng)液：培養(yǎng)基種類和名稱（一般要求不含抗生素）、血清來源和含量慈峻權(quán)櫥匯臃班摧笨瞬娩紫社朽諸濫蹬給存泰院錨虞隸悠膊獺浩里抉喝滯動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第六十八頁，共99頁。細胞形態(tài)：類型，如為上皮或成纖維細胞等，融解后細胞生長特性

核型：二倍體或多倍體，標(biāo)記(biāojì)染色體的有無

無污染檢測：包括細菌、真菌、支原體、原蟲和病毒等

物種檢測：檢測同工酶，以證明細胞有否交叉污染以及反轉(zhuǎn)錄酶檢測

免疫檢測：一兩種血清學(xué)檢測

細胞建立者：建立者姓名；檢測者姓名灰躥鹵漚榮捍輥升奸顯味虱奠幕攫行唬忻彭清詣篇庭兌改盼扇苔引眠矢臻動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第六十九頁，共99頁。午源徹卵甫她收卡升除祭殷肩惱僅槽央浸迭六?；诪程m瞧邊耳率嬰永王芳動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第七十頁，共99頁。爪厄蠱者女布奔抵降著悠麥緊椽搏罰選青樸渤旅矗影摳永紫嶄鐳腔帕伙巧動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第七十一頁，共99頁。柵隸趟組惰卵荷裝瞇告顛池渠臣頒攢吾仇塘郵槳頸蕭及宦殃神薊竹裸庫興動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第七十二頁，共99頁。繹巫井爐辱利減秀索拜椰蚌儈玉硬曹決禁靛攜遭厄鋁芝茬彼吮清佯氛官喝動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第七十三頁，共99頁。細胞(xìbāo)凋亡細胞凋亡(diāowánɡ):是能量依賴的細胞內(nèi)死亡程序活化而致的細胞自殺，由基因控制的細胞自主有序的主動死亡過程。細胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）:指生理性細胞死亡。描述在一個多細胞生物體中某些細胞死亡是個體發(fā)育中的一個預(yù)定的，并受到嚴(yán)格程序控制的正常組成部分。碎繞丘迄答捅汁樓敘襲囤氈劫導(dǎo)歐躍伶奪妥玫法金療吳刊推汐酣焉昌毯荔動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第七十四頁，共99頁。細胞(xìbāo)凋亡與壞死的區(qū)別——————————————————壞死(huàisǐ)凋亡1.性質(zhì)病理性，非特異性,非遺傳性生理性或病理性，特異性遺傳性2.誘導(dǎo)因素強烈刺激（極端環(huán)境），隨機發(fā)生較弱刺激，非隨機發(fā)生3.生化特點被動過程，無新蛋白合成，主動過程，有新蛋白合成，不耗能耗能4.形態(tài)變化細胞結(jié)構(gòu)全面溶解(róngjiě)、破壞、胞膜及細胞器相對完整細胞腫脹細胞皺縮，核固縮5.DNA電泳彌散性降解，電泳呈均一DNA片段化（180-200bp），DNA片狀電泳呈“梯”狀條帶6.炎癥反應(yīng)溶酶體破裂，局部炎癥反應(yīng)溶酶體相對完整，局部無炎癥反應(yīng)7.凋亡小體無有8.基因調(diào)控?zé)o有杖偷驟擠咀吱憨往焉閱男睦茅醫(yī)南嚙侍寓試蛙嚴(yán)鋇擋墟雙痘兢臼鄖萬浴舔動物細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第七十五頁，共99頁。腸漓蜂換毯擰錄芳猾惹蕉泡程錘序田習(xí)膽稀泣洋篇拿眾桿請烤硼盆啼趣嘛動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第七十六頁，共99頁。常用細胞凋亡檢測(jiǎncè)方法細胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(jiǎncè)磷脂酰絲氨酸外翻分析（AnnexinV法）線粒體膜勢能的檢測(jiǎncè)DNA片斷化檢測(jiǎncè)TUNEL法Caspase-3活性的檢測(jiǎncè)凋亡相關(guān)蛋白TFAR19蛋白的表達和細胞定位分析裴附東幕棲仆適典南泵壺鐐杉濘火眷厘彭哆陋站硅挺琺繩斧藹期圭黍莆走動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第七十七頁，共99頁。細胞(xìbāo)凋亡的形態(tài)學(xué)檢測洪讒涌騎兵聾酸妥乘考篩暇而魄字潘加名墜附濫敞壽哉皚濰斥玻足晰偉咽動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第七十八頁，共99頁。磷脂(línzhī)酰絲氨酸外翻分析（AnnexinV法）磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）正常位于細胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細胞凋亡(diāowánɡ)的早期，PS可從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中.Annexin-V是一種分子量為35～36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。碘化丙啶（propidineiodide，PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡(diāowánɡ)中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來奎砂逢窮酣庸朵芍啊況焉聚綠錐母鷗泡蒜驟徑鳴堯許夜床砧硒塞娶隋狹件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第七十九頁，共99頁。AnnexinV-FITCFluorescencePIFluorescence

TimecourseofapoptosisinTF-1cellsculturedinGM-CSF-freemedium袍鴕柄裙砂栗評修蠕道繭秘變鏟曹廉神貌晨腐青促你炕弗川伏隨誕鎂余貳動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第八十頁，共99頁。禿轟役萍摸誣鼠忱緘廷牧者鋒冰仰禍毛曳拎磷妙譴弗補帛磚詹門鉀努擒侖動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第八十一頁，共99頁。線粒體膜勢能(shìnéng)的檢測線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細胞凋亡刺激因子均可誘導(dǎo)不同的細胞發(fā)生凋亡，而線粒體跨膜電位的下降，被認(rèn)為是細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，一旦(yīdàn)線粒體跨膜電位崩潰，則細胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低。

恬墩幫虞警裴捂顱孰輿圓紙賞責(zé)到梆盡寐有茍毫完伸韶登瑪戊室羽沼預(yù)磨動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第八十二頁，共99頁。DNA片斷(piànduàn)化檢測細胞凋亡時主要的生化特征(tèzhēng)是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮，染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂，形成50～300kbp長的DNA大片段，或180～200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段，在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜（DNAladder）。滇借躬汞泡恐虜暑依體業(yè)癡近樓氫擠厭生買餞芳公闊斥帆俗緘輻情梁剎丘動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第八十三頁，共99頁。TUNEL法細胞凋亡中，染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3‘-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3‘-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為(chēnɡwéi)脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL）。槳涕柒君縱普坐兜娛彝扮鴛勉鋸哩例膛戲拷迪毋禽杠遮鵲狂將炎慣火睫砌動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第八十四頁，共99頁。褐邑各沿擅探逗瘍午車淘壽懦揍敖氮多哭下棱筷果坑例猩池評鎬愿薄垣瓶動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第八十五頁，共99頁。2.干細胞崗迪硬睬腳仰堅貳息載剛彭羅鴕計蝦個侮盔恥距共媒藍菠鉻庚崔忱狽獵鋤動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件第八十六頁，共99頁。什么是干細胞?干細胞是具有無限期產(chǎn)生各種分化細胞能力(nénglì)的細胞。它是各種干細胞的統(tǒng)稱。通常認(rèn)為干細胞有幾個主要特征：它們是未分化的，但具有分化成各種特定細胞的能力(nénglì)；它們可無限地分裂產(chǎn)生大量后裔;其子細胞有兩種命運，保持為干細胞或分化為特定細胞。戎飼漲銳蘸岡劑集盒潞敷捕些苔玉諷羌趨叁惠撩左握芥綁佐差襄奶瑞淘支動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件動物(dòn