畢赤酵母實(shí)驗(yàn)操作手冊(cè)

畢赤酵母試驗(yàn)操作手冊(cè)(總20頁(yè))-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-CompanyOne1-CAL-本頁(yè)僅作為文檔封面，使用請(qǐng)直接刪除10畢赤酵母表達(dá)試驗(yàn)手冊(cè)構(gòu)造，在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)往往不能進(jìn)展正確的折疊，是以包含體狀態(tài)存的蛋白，就需要進(jìn)展變性溶解及復(fù)性等操作，這一過(guò)程比較繁瑣，同時(shí)增加了成本。力量，其產(chǎn)物往住形成沒(méi)有活性的包涵體，需要經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性等處理，才能應(yīng)性、復(fù)性等等間題［1］。機(jī)制和對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的加工修飾力量，人們對(duì)釀酒酵母分子遺傳學(xué)方面的生疏最早，釀酒酵母也最先作為外源基因表達(dá)的酵母宿主．1981培育基中維特，質(zhì)粒變得不穩(wěn)定，拷貝數(shù)下降，而大多數(shù)外源基因同時(shí)，試驗(yàn)室用培育基簡(jiǎn)單為抑制釀酒酵母的局限，人們進(jìn)展了以甲基養(yǎng)分型酵母〔methylotrophicyeast〕為代表的其次代酵母表達(dá)系統(tǒng)［2］。甲基養(yǎng)分型酵母包括：Pichia、CandidaPichia.pastoris〔畢赤巴斯〕為宿主的外源基因表達(dá)系統(tǒng)近年來(lái)進(jìn)展最為快速，應(yīng)用也最為廣泛，已利在于該系統(tǒng)除了具有一般酵母所具有的特點(diǎn)外，還有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)［1、2、3］；之一。表達(dá)質(zhì)粒能在基因組的特定位點(diǎn)以單拷貝或多拷貝的形式穩(wěn)定整合。〔即同源重組〕⑶菌株易于進(jìn)展高密度發(fā)酵，外源蛋白表達(dá)量高。解，而且削減對(duì)細(xì)胞的毒害作用。Pichia.pastoris基因表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)過(guò)近十年進(jìn)展，已根本成為較完善的外產(chǎn)物有效分泌并適當(dāng)糖基化，培育便利經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)。利用強(qiáng)效可調(diào)控啟動(dòng)子TNF、EGF、破傷風(fēng)毒素C為突出特征的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，而且格外適宜子擴(kuò)大為工業(yè)規(guī)模［4］。目前美國(guó)FDA已能評(píng)價(jià)來(lái)自該系統(tǒng)的基因工程產(chǎn)品，最近來(lái)自該系統(tǒng)的Cephelon制劑已FDAPichia.pastoris更為廣泛的基因工程產(chǎn)品［2、3］。近年來(lái)，Invitrogon公司開(kāi)發(fā)了畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的系列產(chǎn)品，短短幾達(dá)系統(tǒng)。KM71HIS4。其AOX1Mut＋，即甲醇利用正常型；KM71Muts，即甲醇利用緩慢型，兩種菌株都適用于一般的酵母轉(zhuǎn)化方法。內(nèi)無(wú)自然質(zhì)粒，所以表達(dá)載體需與宿主染色體發(fā)生同源重組，將外源基因表達(dá)框架整合于染色體中以實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)［5］．包括啟動(dòng)子、外源基因克隆位點(diǎn)、終止序列、篩選標(biāo)記等。表達(dá)載體都是先在大腸桿菌復(fù)制擴(kuò)增，然后被導(dǎo)入宿主酵母細(xì)胞。為使產(chǎn)物分泌胞外，表達(dá)載體還需帶有信號(hào)肽序列。N對(duì)外源蛋白自身的信號(hào)序列識(shí)別力量差，pPICZαAα-交配因子〔α-factor〕，能很好的到達(dá)以上的要求。并且Zeocin記基因，給我們篩選轉(zhuǎn)化子的工作帶來(lái)很大的便利［1、2］。，它的主要特點(diǎn)簡(jiǎn)介如下：AOX1〔alcoholoxidase，醇氧化酶〕；⑵具有ZeocinZeocin都有外源基因的整合，大大簡(jiǎn)化了重組轉(zhuǎn)化酵母的篩選過(guò)程［5］。在操作過(guò)程中，ZeocinpPICZAmp，經(jīng)濟(jì)而又簡(jiǎn)便；。A0X13’端終止序列；⑷分泌效率強(qiáng)的信號(hào)肽α-factor.Invitrogen公司開(kāi)發(fā)的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的系列產(chǎn)品作為目前被應(yīng)用為醇氧化酶可調(diào)控的強(qiáng)啟動(dòng)子，能高密度發(fā)酵，重組蛋白表達(dá)量高。外源基因整合在酵母基因組上，可以穩(wěn)定存在。同泌到細(xì)胞外，不但提高表達(dá)蛋白的活性，而且，有利于產(chǎn)物的純化。一．畢赤酵母表達(dá)常用溶液及緩沖液的配制各種母液的配制13.4%酵母根底氮源培育基〕4℃保存。34g母根底氮源培育基〔無(wú)硫酸銨〕+100g1000ml500*B〔0.02%生物素Biotin〕4℃保存保存期為120mg100ml組氨酸〕4℃1400mgL-組氨酸溶100ml，〔50℃以促進(jìn)溶解〕，過(guò)濾除菌。葡萄糖〕1200g1000ml15min10*M〔5%Methanol甲醇〕25ml95ml甘油〕1100ml900ml后，高壓滅菌或過(guò)濾除菌。AminoAcid，各種氨基酸〕4℃1500mgL-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-賴(lài)氨酸、L-L-異亮氨酸溶于100mlphosphatebuffer，pH6.0〕，1mol/LK2HPO4132ml1mol/LKH2PO4868mlpH6.0，pH，則使pH。常用溶液及緩沖夜堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA所用溶液：溶液Ⅰ：50mmol/Lglucose，100mmol/LEDTA，25mmol/LTris－HCI(pH8.0)溶液Ⅱ：0.2mol／LNaOH，1％SDS〔臨用時(shí)配制〕Aceticacid，ddH2O100ml。4℃保存。10%〔Glycerol〕：100ml900ml1Rnase-H2O：1ulRnase1ml滅菌ddH2O。4℃保存。TE10mmol/Tris-CI〔pH8．0〕，lmmol/LEDTA〔pH8.0〕STE0.1mol/L,10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)SCE1mol/LSorbitol(山梨醇),10mmol/L10mmol/LEDTA1Mpotassiumphosphatebuffer〔pH6.0〕：132ml1MK2HPO4868ml1MKH2PO450XTAEpH8.0〔1L〕：242gTris57.1mlAceticAcid37.2gEDTA二．畢赤酵母表達(dá)的培育基配制［5］LB〔Luria－Bertani〕培育基：Tryptonl％YeastExtract0.5％NaCll％PH7.02％瓊脂粉。121℃20min?？捎谑覝乇４?。用于培育TOP10F’Zeocin25ug/ml。LLB〔LowSaltLB〕培育基：Tryptonl％YeastExtract0.5％NaCl0.5％PH7.02％瓊脂粉。121℃高壓滅菌20min?？捎谑覝乇４鏀?shù)月。用于培育Zeocin25ug/ml4℃條件下保1～2YPD〔YEPD〕YeastExtractPeptoneDextroseMedium，〔YeastExtractPeptoneDextroseMedium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培育基〕Trypton2%dextrose(glucose)2%+agar2%+Zeocin100μg/mlYPD4℃Zeocin/mlYPDZ4℃1～2YPDSZeocin〔YeastExtractPeptoneDextroseMedium〕：yeastextract1%peptone2%dextrose(glucose)2%sorbitol1M+agar2%+Zeocin100μg/mlYPDS+Zeocin4℃條件下，1～22.5MGYMinimalGlycerolMedium〔最小甘油培育基〕生物素〕800ml100ml10*YNB2ml500*B100ml10*GY，4℃22.6MGYHMinimalGlycerolMedium+Histidine〔最小甘油培育基+0.004%組氨酸〕10ml100*H4℃2月。?RDRegenerationDextroseMedium〔葡萄糖再生培育基〕葡萄糖；1.34%YNB；4*10-5%生物素；0.005%氨基酸〕1.高壓滅菌；2.冷卻后于45℃水浴；3.10*YNB；2ml500*B；10ml100*AA88ml45℃24℃保存。2.8RDHRegenerationDextroseMediumHistidine〔0.004%組氨酸〕10ml100*H78mlRD4℃保存。RDRDH700ml60℃水??；2.RD/RDH4，100ml10*D、100ml的10*YNB；2ml〔10ml100*H〕88〔78〕ml45℃1/瓊脂液混勻；3.4℃可保存數(shù)月。2.10RDRDH的TOP瓊脂的制備〔常用于酵母菌的包被〕700ml60℃水?。?，100ml10*D、100ml10*YNB；2ml500*B；10ml100*AA〔10ml100*H〕88〔78〕ml45℃1/瓊脂液混勻；將該TOP瓊脂置于45℃水浴冷卻、保溫，備用。MDMDHMinimalDextroseMedium+〔Histidine〕+〔0.004酸〕〔含有：1.34%YNB；；4*10-5%生物素；2%葡萄糖〕1.100ml10*YNB；2ml500*B100ml10*D800ml1000mlMDH，MD10ml100*H如配制平板，可無(wú)菌水的滅菌前，參加15~20g的瓊脂。4℃可保存數(shù)月。2.12SOC? Tryptonl％YeastExtract0.5％NaCl0.05％Glucose(1mol/L)2%12120min，冷卻后，4℃保存三．主要試驗(yàn)環(huán)節(jié)的操作酵母菌株的分別純化GS1155mlYPD液體培育基，30℃，200rpmYPDHis在補(bǔ)充培育基生上生長(zhǎng)而在根本培育基上不生長(zhǎng)的單菌落劃YPD平板，4℃保存。TOP10F’的活化培育TOP10F’做為菌種保存在－70活化培育。TOP10F’5mlLLB〔25ug/mlZeocin〕中，37℃，200rpm，培育畢赤酵母表達(dá)的試驗(yàn)方法小牛腸堿性磷酸酶〔CIP〕處理酶切后的質(zhì)DNA，具體操作如下：⑴建立反響體系：線性化的質(zhì)粒35ul10xCIPbuffer4ulCIP1ulddH2O5ul——————————————————————————total45ul加石蠟油封閉〕，37℃，15min；50℃，15min；56℃，30min〔滅活〕。56℃proteinseKCIP，參加試劑如下：反響物 10x5％SDS7ul10xEDTA〔pH8.0〕7ulproteinseK5ulddH2O 6ul———————————————————?total70ulkit2.2.3.3，20ulddH2O1％瓊脂糖凝膠電泳，120V，DNA濃度。3.3.2E.coliTOP10F’感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化10ulTOP10F’菌液，接種于200mlLB37℃，rpm，16～18100ul200mlLB37℃，200rpm16～18rpm，20min。得菌體沉淀。棄上清，菌體10％31mlulEP5ul，混勻，不要產(chǎn)生氣泡，在冰上放置5min。⑹將混勻后得200ul2500V，時(shí)間5ms。SOC1.5mlEP37℃，150rpm45～60min。25ug/mlLLB－Zeocin37℃12～163.4畢赤酵母電轉(zhuǎn)化方法1.YPD50ml，30℃、250~300r/min2.500ml2L250~300r/minOD6001.3~1.5；3.5min，500ml懸；按步驟3離心，用250ml的冰預(yù)冷的無(wú)菌水將菌體沉淀重懸；按步驟3離心，用20ml的冰預(yù)冷的1mol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸；1.5ml；〔2內(nèi)〕。8.5~10μlTE80μl60.2cm中；將電轉(zhuǎn)化杯冰浴5min；電壓、電流、電容等參數(shù)，按優(yōu)化的參數(shù)，進(jìn)展電擊；1.5mlEP中；MDRDB200~600μl13.將平板置于30℃培育，直至單個(gè)菌落消滅。1.5kV；25μF；200Ω4～10msec。PichiaPCR模板的處理：平板上的菌落長(zhǎng)到肉眼可見(jiàn)時(shí)〔約12小時(shí)〕；Kit〕；3.用半根滅菌的牙簽〔節(jié)約，而且好用〕挑取菌落PCR4.PCR，1％agarosePCR1.55YPDZ30，8－12〔也就是克隆效率低〕，PCR篩可以使工作量大為降低。PCR50μl?20μl10xReactionBuffer?5.0μl?2.0μl25mmol/LMgCl2?3.0μl?1.2μl2.5mmol/LdNTPs?5.0μl?3.0μlPrimer1〔10μmol/L〕2.5μl?1.0μlPrimer2〔10μmol/L〕2.5μl?1.0μlddH2O?31.5μl?12.6μlTOTAL?50.0μl?20.0μl初始變性?94℃4min50~54℃30s72℃30s完畢延長(zhǎng)?72℃10min?保存?4℃畢赤酵母基因組提取方法YPDZGS115YPD，30℃，16～18⑵室溫下，1500g5-10min100ulTE〔pH7.0〕300ulEDTA〔pH8.0〕，0.07MTris－HCl，ulβ-巰基乙醇，1ulLyticase，37℃30min。10000g5~10min90ulTE200ul飽和酚，200ul30s1/10NaAC，-20℃30min；10000g20min，棄上清；75%乙醇漂洗沉淀一次；15μlTEH2O，-20℃?zhèn)溆?。Mut+表型重組酵母的誘導(dǎo)表達(dá)試驗(yàn)MGY、BMGBMGY250mlrpmOD600=2-6(~16-18h)；MM、BMMBMMYOD600=1.0〔100~200ml〕；28-rpm24h100％0.5～1.0%；1ml，1.5mlEP點(diǎn)一般?。?、6、12、24、36、48、60、72、8496h；樣品用液氮或干冰速凍后，于-80°C；7.SDS-、Western-Blot3.7MutsMGY、BMGBMGY250mlrpmOD600=2-6(~16-18h)；1/51/10MM、BMMBMMY〔10~20ml〕；rpm24h100％0.5～1.0%；1ml，1.5mlEP點(diǎn)一般取：0、24、48、72、96120h；樣品用液氮或干冰速凍后，于-80°C；7.SDS-、Western-Blot信號(hào)肽識(shí)別位點(diǎn)的設(shè)計(jì)以質(zhì)粒pPICZαA為例。在利用PCR反響在外源基因兩端引入酶切位點(diǎn)的試驗(yàn)中。pPICZαAKEX2Lys－Arg，應(yīng)當(dāng)在上Lys、ArgAAA、AGA。KEX2Lys－Arg，通過(guò)對(duì)信號(hào)肽的切割使基因表達(dá)產(chǎn)物釋放至胞外。PCR、P4rhEGFXhoⅠ、5PCR5”端限制酶位點(diǎn)外再加3個(gè)保護(hù)堿基GC［6］，防止引物合成中由于合成效率和純化問(wèn)題而導(dǎo)致的酶切位點(diǎn)的殘缺。NEB(NewEnglandBiolabs)公司在限制酶領(lǐng)域的總體爭(zhēng)論NEBCleavagetotheendofDNAfragments［7］，但是，一些不常用的酶或雖有推舉的保護(hù)堿基序列但酶切效率仍不高的酶還是很難設(shè)計(jì)保護(hù)堿［8］；XbaI、NheISpeI位點(diǎn)5’端保護(hù)堿基須在5個(gè)左右才簡(jiǎn)潔被酶切割，以及一些前人的閱歷總結(jié)，我5’5率。高保真DNA聚合酶的使用VentDNA〔HighFidelity〕耐高溫DNATaqDNATthDNAAmpliTaq，KlenTaq3’5’糾錯(cuò)功能，因此在擴(kuò)增時(shí)消滅堿基錯(cuò)配的機(jī)率為2.1x104PCRDNADNADNA有同樣的“突變”。將會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)峻的后果［9］。Pfu，DeepVent，Pwo，UlTmaPfu10hEGF在PCRhEGFVentDNA擴(kuò)增長(zhǎng)度、保證性、產(chǎn)量和特異性等〕，質(zhì)粒構(gòu)建PCRDNA效率將有質(zhì)的飛躍。密碼子的偏好性的原則碼子使用上的偏愛(ài)性對(duì)從翻譯水平分析外源基因表達(dá)的規(guī)律有重要意義,也為改造外源基因或改造宿主細(xì)胞供給依據(jù)［10、11］。線性化及承受電轉(zhuǎn)化的緣由：SacⅠ進(jìn)展線性化的處理。由于未線性化的環(huán)狀質(zhì)粒之間性化處理。這種處理的目的：主要步驟如下：1〕酶切體系〔80ul〕21/10PH5.2NaAC，混勻℃2013200rpm，20min，離心后棄上清300ul5min，棄上清〕。6)20ulddH2O假設(shè)想提高轉(zhuǎn)化效率，可以略微做一些改進(jìn)：還是用酚抽一下，去除