實(shí)驗(yàn)一-核酸的提取學(xué)習(xí)資料

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(shíyàn)

Experimentsofmolecularbiology授課(shòukè)教師：田生禮實(shí)驗(yàn)一核酸(hésuān)的提取第一頁(yè)，共28頁(yè)。實(shí)驗(yàn)一核酸(hésuān)的提取

（質(zhì)粒DNA的提取和純化）【目的要求】1．學(xué)習(xí)載體的基本結(jié)構(gòu)2．了解堿裂解法質(zhì)粒提取過(guò)程中各步驟的設(shè)計(jì)(shèjì)思想；3．掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的原理方法和各項(xiàng)基本技術(shù)；第二頁(yè)，共28頁(yè)?！緦?shí)驗(yàn)(shíyàn)原理】堿裂解法提取質(zhì)粒是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA和線性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來(lái)分離質(zhì)粒DNA。在pH值介于12.0-12.5這個(gè)狹窄的范圍內(nèi)，線性的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性，盡管在這樣的條件下，共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵會(huì)被斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此相互盤繞，仍會(huì)緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH4.8乙酸鉀高鹽緩沖液恢復(fù)pH至中性時(shí)，共價(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條互補(bǔ)鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，而線性的染色體DNA的兩條互補(bǔ)鏈彼此已完全(wánquán)分開，復(fù)性就不會(huì)那么迅速而準(zhǔn)確，它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去。第三頁(yè)，共28頁(yè)?！緦?shí)驗(yàn)材料和用品】恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、臺(tái)式離心機(jī)、高壓滅菌鍋、Enpendorf管、含有目的基因(jīyīn)pADH的PMD-20T質(zhì)粒的大腸桿菌、堿裂解溶液，酚、氯仿、乙醇、TE緩沖液、胰RNA酶。注：pADH為多頭絨泡菌乙醇脫氫酶第四頁(yè)，共28頁(yè)?！緦?shí)驗(yàn)步驟】1、取1.5ml培養(yǎng)液倒入1.5mleppendorf管中,4℃下12000g離心30秒。

2、棄上清,將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘,使液體流盡。

3、菌體沉淀重懸浮于100μl溶液Ⅰ中(需劇烈振蕩),室溫下放置5-10分鐘。

4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl,蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數(shù)次,以混勻內(nèi)容物(千萬(wàn)不要振蕩),冰浴5分鐘。

5、加入150μl預(yù)冷的溶液Ⅲ,蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩10秒,使沉淀混勻,冰浴中5-10分鐘,4℃下12000g離心5-10分鐘。

6、上清液移入干凈eppendorf管中,加入等體積的酚/氯仿(1:1),振蕩混勻,4℃下12000g離心5分鐘。

7、將水相移入干凈eppendorf管中,加入2倍體積的無(wú)水乙醇,振蕩混勻后置于-20℃冰箱中20分鐘，然后4℃下12000g離心10分鐘。

8、棄上清,將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有(suǒyǒu)液體流出,加入1ml70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g離心5-10分鐘。

9、吸除上清液,將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡,真空干燥10分鐘或室溫干燥。

10、將沉淀溶于20μlTE緩沖液(pH8.0，含20μg/mlRNaseA)中，37℃金屬浴一個(gè)小時(shí)，然后儲(chǔ)于-20℃冰箱中。第五頁(yè)，共28頁(yè)。質(zhì)粒電泳圖第六頁(yè)，共28頁(yè)。核酸的分離(fēnlí)與純化不論是基因工程還是蛋白質(zhì)工程，核酸分子是這些技術(shù)應(yīng)用所涉及的主要對(duì)象，所以核酸的分離(fēnlí)與提取是生化與分子生物學(xué)研究中非常重要的基本技術(shù)。核酸樣品的質(zhì)量將直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。第七頁(yè)，共28頁(yè)。核酸的種類(zhǒnglèi)：真核生物的染色體DNA為雙鏈線性分子；真核細(xì)胞器DNA為雙鏈環(huán)狀分子；原核生物的基因組DNA、質(zhì)粒DNA為雙鏈環(huán)狀分子；RNA分子在大多數(shù)生物體內(nèi)均是單鏈線性分子；不同類型的RNA分子可具有不同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，如真核mRNA分子多數(shù)在3’端帶有ploy(A)結(jié)構(gòu);tRNA的三葉草結(jié)構(gòu)。病毒的DNA、RNA，其存在形式多種多樣，有雙鏈環(huán)狀、單鏈環(huán)狀、雙鏈線狀和單鏈線狀等。第八頁(yè)，共28頁(yè)。一、核酸分離(fēnlí)提取的原則分離純化(chúnhuà)核酸總的原則①應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；②排除其它分子的污染，保證較高純度。第九頁(yè)，共28頁(yè)。3.為了保征分離核酸的完整性和純度，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，應(yīng)注意以下事宜：①盡量簡(jiǎn)化操作步驟，縮短提取過(guò)程，以減少各種有害因素對(duì)核酸的破壞(pòhuài)；②減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解，為避免過(guò)酸、過(guò)堿對(duì)核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞(pòhuài)，操作多在pH4-10條件下進(jìn)行；第十頁(yè)，共28頁(yè)。③減少物理因素對(duì)核酸的破壞，物理破壞因素主要是機(jī)械剪切力，其次是高溫。④防止核酸的生物降解，細(xì)胞(xìbāo)內(nèi)或外界的各種核酸酶（DNA酶、RNA酶）酶解核酸鏈中的磷酸二酯鍵，直接破壞核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)。第十一頁(yè)，共28頁(yè)。其中(qízhōng)DNA酶，需要金屬二價(jià)離子Mg2+，Ca2+的激活，使用金屬二價(jià)離子螯合劑乙二胺四乙酸(EDTA)、檸檬酸鹽，基本上可以抑制DNA酶的活性。而RNA酶，不但分布廣泛、極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸、耐堿，不易失活，所以生物降解是RNA提取過(guò)程中的主要危害因素。第十二頁(yè)，共28頁(yè)。提取高質(zhì)量基因組DNA的主要用途：PCR擴(kuò)增的模板(múbǎn)用于構(gòu)建基因組文庫(kù)用于Southernblot雜交分析二、真核細(xì)胞染色體DNA的制備(zhìbèi)第十三頁(yè)，共28頁(yè)。1.真核細(xì)胞的破碎（1）物理方式:超聲波法、勻漿(yúnjiānɡ)法、液氮破碎法、Al2O3粉研磨法等。這些物理操作均可導(dǎo)致DNA鏈的斷裂。（2）為了獲得大分子量的DNA，一般采用蛋白酶K和去污劑溫和處理法。真核細(xì)胞染色體DNA的制備(zhìbèi)過(guò)程第十四頁(yè)，共28頁(yè)。2.去除蛋白質(zhì)常用酚、氯仿抽提。反復(fù)的抽提操作對(duì)DNA鏈的機(jī)械剪切機(jī)會(huì)較多，所以有人使用高濃度甲酰胺解聚核蛋白聯(lián)合透析的方法，可以獲得200kb以上的DNA片段，適用于粘粒(cosmid)構(gòu)建基因組文庫(kù)。根據(jù)(gēnjù)不同的實(shí)驗(yàn)要求，可選擇不同的實(shí)驗(yàn)方法制備真核細(xì)胞染色體DNA。第十五頁(yè)，共28頁(yè)。3.DNA沉淀：一般(yībān)采用2倍體積乙醇沉淀或用異丙醇（0.6）4.DNA溶解：一般(yībān)采用TE第十六頁(yè)，共28頁(yè)。從細(xì)胞中分離RNA的純度與完整性對(duì)于許多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要。如Northernblot及cDNA合成及體外翻譯等實(shí)驗(yàn)的成敗，在很大程度上決定(juédìng)于RNA的質(zhì)量。三、RNA的分離(fēnlí)與純化-真核細(xì)胞RNA的制備第十七頁(yè)，共28頁(yè)。RNA主要由以下幾類分子組成：rRNA(占RNA總量的80％—85％)、tRNA和核內(nèi)小分子RNA(占10％-15％)、mRNA(占1％～5％)。rRNA在總RNA分子中含量最豐富，由28S、18S、5S及4S幾類組成，它們之間同源性大，分子量變化不大，所以可根據(jù)它們的密度(mìdù)和分子大小，通過(guò)密度(mìdù)梯度離心，凝膠電泳或離子交換層析進(jìn)行分離。第十八頁(yè)，共28頁(yè)。mRNA分子種類繁多，分子量大小不均一，在細(xì)胞中含量少，絕大多數(shù)mRNA分子(除血紅蛋白及有些組蛋白mRNA以外)，均在3’端存在20-250個(gè)多聚腺核苷酸poly(A)。利用(lìyòng)此特征，可很方便地從總RNA中，用寡聚(dT)親和層析柱分離mRNA。mRNA分子群體編碼細(xì)胞內(nèi)所有的多肽和蛋白質(zhì)，而mRNA是分子生物學(xué)的主要研究對(duì)象之一。第十九頁(yè)，共28頁(yè)。鑒定所提取總RNA分子(fēnzǐ)的質(zhì)量，可以通過(guò)瓊脂糖電泳后觀察是否有明顯得28S、18S條帶來(lái)判斷。第二十頁(yè)，共28頁(yè)。Fig.1TotalRNAisolatedfromTrichodermareeseiinducedbydifferentinducers圖1.木霉總RNA的分離1.微晶(wēijīnɡ)纖維素2.天然稻草粉第二十一頁(yè)，共28頁(yè)。如何創(chuàng)造一個(gè)(yīɡè)無(wú)RNase的環(huán)境？RNA分離的關(guān)鍵因素是：盡量減少RNA酶的污染！極力避免外源RNase的污染：主要來(lái)源于操作者的手、實(shí)驗(yàn)的器皿和試劑盡力抑制內(nèi)源性RNase的活力：主要來(lái)源于樣品中的組織細(xì)胞。第二十二頁(yè)，共28頁(yè)。怎樣去除外源性RNase的污染？(1)操作者的手直接觸摸之處，毫無(wú)疑問(wèn)會(huì)留下RNase，說(shuō)話帶出的唾液也富含RNase。故整個(gè)操作過(guò)程中，應(yīng)戴口罩和手套。(2)空氣中飛塵(fēichén)攜帶的細(xì)菌、霉菌等微生物，也是污染外源RNase的一條途徑，所以操作過(guò)程應(yīng)在比較潔凈的環(huán)境中進(jìn)行。第二十三頁(yè)，共28頁(yè)。(3)玻璃器經(jīng)過(guò)常規(guī)洗凈后，應(yīng)用0.1％焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)浸泡處理(37℃，2小時(shí))，再用雙蒸滅菌水漂洗幾次。高壓消毒去除DEPC，然后200℃烘烤4小時(shí)以上或180℃烘烤過(guò)夜。(4)塑料器材最好(zuìhǎo)使用滅菌的一次性塑料用品，Eppendorf管、微量加樣吸頭最好(zuìhǎo)是新的，使用前進(jìn)行高壓蒸汽消毒。第二十四頁(yè)，共28頁(yè)。如何抑制內(nèi)源性RNase的活性？要盡可能早地去除細(xì)胞內(nèi)蛋白，加入RNase抑制劑，力爭(zhēng)(lìzhēng)在提取的起始階段對(duì)RNase活力進(jìn)行有效地抑制。

第二十五頁(yè)，共28頁(yè)。RNase抑制物：（1）低特異性RNase抑制物：不同類型的低特異性RNase抑制物均可不同程度地抑制Raise的活性，其中包括(bāokuò)DEPC皂土(bentonite):Al2O3·4SiO2·H2O復(fù)合硅酸鹽(Macaloid)肝素氧釩基—核苷復(fù)合物多胺第二十六頁(yè)，共28頁(yè)。（2）去除蛋白質(zhì)的物質(zhì)：蛋白質(zhì)變性劑：酚、氯仿；尿素蛋白酶K去污劑：SDS、十二烷酰肌氨酸鈉(sarkosyl)、脫氧膽酸鈉(DOC)是陰離子去污劑解偶劑(胍類)：鹽酸胍、異硫氰酸胍是一類強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)，并使蛋白質(zhì)二級(jí)