液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的原理與應(yīng)用-(2)教學(xué)提綱

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的原理與應(yīng)用-(2)解題為何要聯(lián)用？

以LC-MS為例：LC的色譜分離＋MS的質(zhì)譜分

離（m/z分離）兩個(gè)維度依次分離，是乘法，非加法！結(jié)合了LC和MS二者的優(yōu)點(diǎn)辨證地看待“聯(lián)用”儀器的小型化、微型化，如waters公司的Qda檢測(cè)器；ICP-MS。Waters公司的液質(zhì)聯(lián)用儀QqQQTOFSciex公司的質(zhì)譜儀QTRAPQTOFQqQOrbitrapThermoFisher公司的液質(zhì)聯(lián)用儀Agilent公司的質(zhì)譜聯(lián)用儀ICP-QqQ質(zhì)譜儀GC-QqQ質(zhì)譜儀用途和優(yōu)點(diǎn)以LC-QqQ-MS定性、定量最常用的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MultipleReactionMonitoring，MRM）模式為例靈敏度高

準(zhǔn)確地說(shuō)——信噪比高LC：μg/mL（ppm）LC-MS：ng/mL（ppb）、pg/mL（ppt）特異性好

干擾小，定性準(zhǔn)確

降低了對(duì)樣品前處理的要求

是公認(rèn)的確證分析技術(shù)！低分辨率質(zhì)譜儀用途和優(yōu)點(diǎn)以QTOF和Q-Orbitrap為代表：質(zhì)量準(zhǔn)確度高（m/z精確到小數(shù)點(diǎn)后3-5位）定性篩查的利器：半未知、全未知化合物如：北京CDC高分辨率質(zhì)譜儀從歷史談起離子源和質(zhì)量分析器有多種不同的類型以兩大主線介紹質(zhì)譜儀的發(fā)展史進(jìn)樣系統(tǒng)離子源（使分析物電離）離子光學(xué)系統(tǒng)質(zhì)量分析器（實(shí)現(xiàn)m/z分離，質(zhì)譜儀通常據(jù)其命名）檢測(cè)器真空系統(tǒng)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)質(zhì)譜發(fā)展史上的兩位先驅(qū)1897年，J.J.Thomson（湯姆孫，1856～1940）質(zhì)譜儀的雛形1919年，F(xiàn).W.Aston（阿斯頓，1877～1945）首次制成具有較高聚焦性能的質(zhì)譜儀，用其成功發(fā)現(xiàn)了多種同位素，獲1922年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)質(zhì)量分析器發(fā)展史1917年，Dempster

發(fā)明扇形磁場(chǎng)質(zhì)譜儀（扇形磁場(chǎng)分析器）1934年，Mattauch和Herzog1953年，Johnson和Nier

分別設(shè)計(jì)出了兩種雙聚焦質(zhì)譜儀（扇形磁場(chǎng)分析器＋

扇形電場(chǎng)分析器）1946年，Stephens

發(fā)明飛行時(shí)間（Time-of-Flight，TOF）質(zhì)譜儀1949年，Hipple

發(fā)明離子回旋共振（IonCyclotronResonance，ICR）

質(zhì)譜儀，是首個(gè)超高分辨率質(zhì)譜儀質(zhì)量分析器發(fā)展史1953年，W.Paul（保羅，1913～1993）提出四極質(zhì)量分析器（QuadrupoleMassAnalyzer，QMA）和四極離子阱（QuadrupoleIonTrap，QIT）的理論，隨后出現(xiàn)了四極質(zhì)譜儀和QIT質(zhì)譜儀H.G.Dehmelt（德梅爾特，1922～）對(duì)ICR質(zhì)譜儀的發(fā)展作出突出貢獻(xiàn)與

Paul共享了1989年諾貝爾物理獎(jiǎng)的一半質(zhì)量分析器發(fā)展史1977年和1984年兩種重要的串聯(lián)質(zhì)譜儀——三重四極（TripleQuadrupole，QqQ）質(zhì)譜儀和QTOF質(zhì)譜儀誕生1995年和1998年，Bier等和Hager

分別設(shè)計(jì)出了兩種線性離子阱（LinearIonTrap，LIT）1999年，A.Makarov（1966～）全新概念的分析器——軌道阱（Orbitrap）離子源發(fā)展史氣體放電電離、火花電離、輝光放電電離、熱電離最出現(xiàn)的電離技術(shù)，屬于無(wú)機(jī)電離技術(shù)1918年，A.J.Dempster

發(fā)明電子電離（ElectronIonization，EI）

最早的有機(jī)電離技術(shù)，至今仍廣泛使用1954年，Inghram和Gomer

場(chǎng)電離，最早的“軟”電離技術(shù)1966年，Munson和Field

發(fā)明化學(xué)電離（ChemicalIonization，CI）離子源發(fā)展史1969年，Beckey場(chǎng)解吸，打開了MS用于生物大分子分析的大門1980s，F(xiàn)enn（芬恩，1917～2010）

使電噴霧電離（ElectrosprayIonization，ESI）取得重

大突破1973年，Horning大氣壓化學(xué)電離（AtmosphericPressureChemicalIonization，APCI）1980年，Houk以電感耦合等離子體（InductivelyCoupledPlasma，ICP）為離子源，發(fā)明了ICP-MS，是元素分析的利器離子源發(fā)展史1987年，Tanaka（田中耕一，1959～）將基質(zhì)輔助激光解吸電離（Matrix-AssistedLaserDesorption/Ionization，MALDI）用于蛋白質(zhì)分析；因?qū)SI和MALDI引入生物大分子領(lǐng)域的卓越貢獻(xiàn)，Tanaka與ESI的發(fā)明者Fenn分享了2002年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的一半MS基本原理MS是與光譜法、核磁共振波譜法并稱的三大物質(zhì)定性手段之一MS是通過(guò)形成氣相離子來(lái)研究物質(zhì)的一種方法，根據(jù)質(zhì)量、電荷、結(jié)構(gòu)和（或）理化性質(zhì)的差異，運(yùn)用質(zhì)譜儀對(duì)離子進(jìn)行表征提前是化合物能形成離子m/z分離通過(guò)質(zhì)量分析器實(shí)現(xiàn)（電場(chǎng)；磁場(chǎng)；電場(chǎng)＋磁場(chǎng)）關(guān)于m/z的理解什么是“質(zhì)”？什么是“荷”？用于描述微觀離子質(zhì)量的單位千克（Kg，SI單位，但單位太大）道爾頓（Dalton，Da）

JohnDalton（1766～1844）統(tǒng)一原子質(zhì)量單位（UnifiedAtomicMassUnit，u）1u＝1Da＝1.660538921（73）×10－27kg

注：原子質(zhì)量單位（AtomicMassUnit，amu，已廢棄）關(guān)于m/z的理解相對(duì)質(zhì)量VS絕對(duì)質(zhì)量初中化學(xué)的重要概念“相對(duì)原子質(zhì)量（原子量）”相對(duì)質(zhì)量單位為“1”，絕對(duì)質(zhì)量單位為u、Da等相對(duì)質(zhì)量與以u(píng)為單位的絕對(duì)質(zhì)量在數(shù)值上相等實(shí)際質(zhì)量VS平均質(zhì)量要區(qū)分“元素”和“原子”的質(zhì)量。例如，原子質(zhì)量是實(shí)際質(zhì)量，元素質(zhì)量是平均質(zhì)量（考慮了同位素豐度）。原子量（是元素的質(zhì)量）≠原子質(zhì)量分子量（是元素質(zhì)量的加和，MS中不能直接運(yùn)用）同位素分布Sn的同位素分布同位素分布瘦肉精（C12H18Cl2N2O）的同位素分布同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)：選擇占比較少的同位素組成形式質(zhì)譜圖質(zhì)譜圖（MassSpectrum）以離子的m/z為橫坐標(biāo)，質(zhì)量峰的強(qiáng)度為縱坐標(biāo)注意：質(zhì)譜圖并非指MS所得圖譜的總稱橫坐標(biāo)既非保留時(shí)間，也非離子質(zhì)量a、輪廓圖b、棒圖提取離子色譜圖質(zhì)譜儀直接采集得到的是質(zhì)譜圖，經(jīng)計(jì)算機(jī)加工得到色譜圖質(zhì)譜圖是色譜圖的基本組成單元分辨率分辨率（Resolution，R）反映的是相鄰質(zhì)譜峰的分離程度目前最常用的定義是“半峰

全寬（FullWidthatHalf

Maximum，F(xiàn)WHM）定義”

分辨率低分辨率：R＜1000中分辨率：R＝1000～10000高分辨率：R＝10000～100000超高分辨率：R＞100000QMA是低分辨率，TOF和Orbitrap是（超）高分辨率通常，QMA的質(zhì)譜峰的半峰寬為0.7

質(zhì)量準(zhǔn)確度準(zhǔn)確質(zhì)量（AccurateMass）：實(shí)測(cè)值精確質(zhì)量（ExactMass）：理論值質(zhì)量準(zhǔn)確度：二者的誤差分辨率會(huì)影響質(zhì)量準(zhǔn)確度QMA的質(zhì)量準(zhǔn)確度一般為0.1u質(zhì)譜儀簡(jiǎn)介SCIEX的QqQ和QTRAPTMThermoFisher的OrbitrapSCIEX、Waters、Bruker的QTOFBruker的FT-ICR價(jià)格GC-MSQ：～80萬(wàn)QqQ：～120萬(wàn)LC-MSQqQ：220～330萬(wàn)QTOF：300～400萬(wàn)Q-Orbitrap：400～600萬(wàn)ICP-MSQ：100～150萬(wàn)QqQ：200～250萬(wàn)質(zhì)譜儀硬件組成進(jìn)樣系統(tǒng)直接進(jìn)樣（如注射泵）、色譜儀等離子源離子光學(xué)系統(tǒng)冷卻、聚焦、準(zhǔn)直等質(zhì)量分析器檢測(cè)器電子倍增器、微通道板等真空系統(tǒng)為何需要保持真空？為何通常需要待機(jī)？需要液氮，是否矛盾？計(jì)算機(jī)系統(tǒng)離子源離子源是使樣品分子、原子或自由基轉(zhuǎn)變?yōu)闅庀嚯x子的器件，是質(zhì)譜儀的“門戶”有機(jī)MS中幾種常見的離子源電子電離（ElectronIonization，EI）源化學(xué)電離（CI）源較“軟”電離；需要試劑氣；適合GC大氣壓電離（AtmosphericPressureIonization，API）源基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）源適合蛋白質(zhì)分析無(wú)機(jī)MS中幾種常見的離子源

感耦等離子體（InductivelyCoupledPlasma，ICP）源EI源曾稱為“電子轟擊（ElectronImpact，EI）”電離源特點(diǎn)“硬”電離分子離子、碎片離子；

多用于一級(jí)MS質(zhì)譜圖重復(fù)性好API源顧名思義，API是在大氣壓而非高（如EI）或低（如CI）真空環(huán)境中實(shí)現(xiàn)的一類電離技術(shù)API源的出現(xiàn)，解決了色譜儀與質(zhì)譜儀接口的難題，極大地推動(dòng)了LC-MS的成熟API源主要包括以下3種類型電噴霧電離（ElectrosprayIonization，ESI）源大氣壓化學(xué)電離（AtmosphericPressureChemicalIonization，APCI）源大氣壓光電離（AtmosphericPressurePhotoionization，APPI）源ESI源SCIEX公司的ESI源ESI源Waters公司的ESI源（Z-Spray）ESI源Agilent公司的ESI源ESI的機(jī)理電離過(guò)程大致可分成三個(gè)階段（以ESI＋為例）：第一階段：使溶液分散成帶電霧滴強(qiáng)電場(chǎng)→液滴形成泰勒錐→瑞利穩(wěn)定極限→錐噴流（Cone-Jet）→約1mm后就迅速膨脹為羽流（Plume），即多個(gè)帶正電荷的直徑為1～2μm的霧滴（高壓靜電＋氣動(dòng)輔助）ESI的機(jī)理錐噴流的照片ESI的機(jī)理第二階段是溶劑蒸發(fā)與霧滴-噴流分裂（Droplet-JetFission）溶劑蒸發(fā)→霧滴縮小→電荷密度增加→當(dāng)達(dá)到瑞利穩(wěn)定極限時(shí)→遂發(fā)生“霧滴-噴流分裂”→循環(huán)往復(fù)→體積越來(lái)越小ESI的機(jī)理第三階段是產(chǎn)生氣相離子，即離子從溶液中轉(zhuǎn)移出來(lái)以氣態(tài)存在離子蒸發(fā)模型（IonEvaporationModel，IEM）當(dāng)霧滴半徑達(dá)nm級(jí)時(shí)，高揮發(fā)性的離子聚集在霧滴表面，在強(qiáng)電場(chǎng)作用下發(fā)生場(chǎng)輔助蒸發(fā)，直接從霧滴中“彈出”，成為氣相離子。帶電殘?jiān)Ｐ停–hargedResidueModel，CRM）該模型認(rèn)為只有霧滴中的溶劑完全蒸發(fā)時(shí)，化合物才能繼承多電荷形成一個(gè)氣相離子。兩種模型均有實(shí)驗(yàn)支持。一般認(rèn)為，小分子化合物可用IEM解釋，大分子化合物則用CRM解釋ESI的特點(diǎn)在大氣壓下進(jìn)行對(duì)比：EI在真空狀態(tài)下進(jìn)行“軟”電離形成離子：加合離子[M＋H]＋、[M＋Na]＋、[M＋NH4]＋、[M＋Cl]－等；去質(zhì)子化分子[M―H]－

對(duì)比：EI是“硬”電離單電荷與多電離離子小分子以單電荷離子為主，大分子以多電荷離子為主基質(zhì)效應(yīng)可能存在基質(zhì)增強(qiáng)或抑制如何判斷是否存在？解決辦法？（同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)、基質(zhì)加標(biāo)、改進(jìn)樣品前處理……）質(zhì)量分析器1.四極質(zhì)量分析器（QMA）定性、定量的利器；靈敏、特異，線性范圍寬2.四極離子阱（QIT）捕獲離子；可實(shí)現(xiàn)多級(jí)質(zhì)譜法；定性能力強(qiáng)，定量能力不及QMA3.線性離子阱（LIT）離子容量比QIT大，許多性能優(yōu)于QIT；有2種類型，其中一種為QTRAPTM（Q-LIT）注：以上3種質(zhì)量分析器有共同的理論基礎(chǔ)——Mathieu（馬蒂厄）方程質(zhì)量分析器4.飛行時(shí)間（TOF）質(zhì)量分析器高分辨率（高質(zhì)量準(zhǔn)確度）；（半）未知物篩查5.軌道阱（Orbitrap）超高分辨率（高質(zhì)量準(zhǔn)確度）；（半）未知物篩查6.扇形磁場(chǎng)分析器7.扇形電場(chǎng)分析器不能單獨(dú)組成質(zhì)譜儀；與扇形磁場(chǎng)分析器組成雙聚焦分析器（最早出現(xiàn)的分析器之一，輝煌的時(shí)代已成過(guò)去時(shí)……）8.離子回旋共振離子阱（ICR-IT）超高分辨率（高質(zhì)量準(zhǔn)確度）；價(jià)格十分昂貴四極質(zhì)量分析器U是直流（DC）電壓V是射頻（RF）電壓理論基礎(chǔ)——Mathieu方程由法國(guó)數(shù)學(xué)家é.Mathieu（馬蒂厄，1835～1890）于1868年提出，最初是為了解決橢圓形鼓膜的橫向振動(dòng)一類的問題，后來(lái)發(fā)現(xiàn)可用來(lái)描述離子在四極場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)軌跡及穩(wěn)定運(yùn)動(dòng)的條件運(yùn)動(dòng)方程Orbitrap（軌道阱）TOF串聯(lián)質(zhì)譜儀和多級(jí)質(zhì)譜儀由兩個(gè)及以上的質(zhì)量分析器串聯(lián)組成碰撞池是連接各質(zhì)量分析器的橋梁?jiǎn)我恍蚎qQ、QqQqQ、TOF-TOF雜交型Q-LIT、QTOF、Q-Orbitrap、LIT-Orbitrap、QIT-TOFQqQ和Q-LIT質(zhì)譜儀QqQ（QoQ、QhQ）h表示六極桿（Hexapole）、o表示八極桿（Octopole）碰撞池僅加RF電壓；小寫q以示區(qū)別碰撞氣（以N2居多）QqQ和Q-LIT質(zhì)譜儀QTRAP系列串聯(lián)質(zhì)譜法和多級(jí)質(zhì)譜法串聯(lián)質(zhì)譜法（MS/MS，MS2）和多級(jí)質(zhì)譜法（MSn）先驅(qū)離子（母離子、前體離子）和產(chǎn)物離子（子離子、孫離子、第n代產(chǎn)物離子）是相對(duì)而言的m1＋→m2＋→m3＋→m4＋→m5＋空間MS/MS和MSn在串聯(lián)質(zhì)譜儀和多級(jí)質(zhì)譜儀上實(shí)現(xiàn)時(shí)間MS/MS和MSn通過(guò)不斷增加分析器個(gè)數(shù)來(lái)增加MS的級(jí)數(shù)畢竟是不現(xiàn)實(shí)的不需要串聯(lián)質(zhì)譜儀和多級(jí)質(zhì)譜儀QIT、LIT和ICR等離子阱類質(zhì)譜儀單級(jí)MS掃描模式以四極質(zhì)譜儀為例：Q1全掃描（Q1FullScan）Q1選擇一段m/z范圍的離子通過(guò)，q2、Q3全通過(guò)用于需找未知化合物；目標(biāo)化合物的方法開發(fā)Q3全掃描（Q3FullScan）Q1、q2全通過(guò)，Q3選擇一段m/z范圍的離子通過(guò)單級(jí)MS掃描模式選擇離子監(jiān)測(cè)（SelectedIonMonitoring，SIM）Q1選擇一個(gè)特定m/z的離子通過(guò)，q2、Q3全通過(guò)或者，Q1、q2全通過(guò)，Q3選擇一個(gè)特定m/z的離子通過(guò)目標(biāo)化合物的定性、定量分析信噪比比全掃描更高GC-MS最常用的掃描模式MS/MS掃描模式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MultipleReactionMonitoring，MRM）又稱為“選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SelectedReactionMonitoring，SRM）”“反應(yīng)”指的是碰撞反應(yīng)MRM是QqQ最主要的工作模式，用于定量分析MS/MS掃描模式MRM模式下，每一化合物選擇2組離子對(duì)即可確證CommissionDecisionof12August2002:ImplementingCouncilDirective96/23/ECConcerningthePerformanceofAnalyticalMethodsandtheInterpretationofResults(2002/657/EC).OffJEurCommunities，2002，L221：8.MS/MS掃描模式產(chǎn)物離子掃描（ProductIonScan）與MRM不同的是，Q3是選擇一段m/z范圍的離子通過(guò)進(jìn)一步增加定性的可靠性食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)食源性疾病、食品污染以及食品中有害因素（物理、化學(xué)、生物因素）食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)真菌毒素（DONs和ZON）真菌毒素（DONs和ZON）化合物母離子（m/z）子離子（m/z）所用內(nèi)標(biāo)DON295.1264.9*13C15-DON138.13-ADON337.1307.1*13C15-DON173.115-ADON337.1150.1*13C15-DON219.0ZON317.2175.013C18-ZON273.213C15-DON310.1279.0*—144.913C18-ZON335.3185.2*—290.2*定量離子。真菌毒素（DONs和ZON）硝基呋喃代謝物硝基呋喃代謝物樣品勻漿→加入10mL甲醇-水（1:1）振蕩提取→棄去液體→加10mL0.2mol/L鹽酸→均質(zhì)→加入混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液、鄰硝基苯甲醛溶液→置37℃恒溫箱中過(guò)夜→加1mL0.3mol/L磷酸鉀→氫氧化鈉調(diào)pH7.4