專題一基因工程基本操作程序

基因工程的基本操作程序

基因工程的基本操作步驟1.目的基因的獲取2.表達(dá)載體的構(gòu)建3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的的檢測與鑒定第一步:目的基因的獲取

常用的方法

1從基因文庫中獲取目的基因2已知序列:利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因

3基因較小已知序列:通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接人工合成目的基因未知序列的建立基因組文庫從中獲得目的基因已知mRNA序列用反轉(zhuǎn)錄法建立cDNA文庫獲得目的基因理論支持:DNA復(fù)制原理基因組含此種生物的一整套遺傳信息如:cDNA文庫基因組文庫cDNA文庫（一）基因文庫的構(gòu)建（1）基因組文庫的構(gòu)建提取某生物全部DNA用適當(dāng)限制酶切割許多DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌群該生物基因組文庫（2）cDNA文庫的構(gòu)建——mRNA反轉(zhuǎn)錄形成與載體連接導(dǎo)入受體菌群mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶雜交雙鏈核酸酶H單鏈DNADNA聚合酶雙鏈DNA(cDNA)該生物cDNA文庫知識點(diǎn)一：1.原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動子終止子啟動子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉(zhuǎn)錄終止。RNA聚合酶:能夠識別啟動子上的結(jié)合位點(diǎn)并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì).(以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落)①不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)。：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能編碼蛋白質(zhì)編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)②有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列，在該序列中，最重要的是位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子終止子編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子外顯子能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游內(nèi)含子：外顯子：知識點(diǎn)一：2.真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區(qū)上游的RNA

聚合酶結(jié)合位點(diǎn)等。比較基因組文庫和cDNA文庫見教材第10頁表格

野生稻是水稻的原始祖先，被專家稱為“植物中的大熊貓”，蘊(yùn)藏著十分豐富的優(yōu)良基因。世界上目前共有20種野生稻種，其中中國有3種，即藥用野生稻、普通野生稻和疣粒野生稻。中國野生稻在云南分布最廣，生態(tài)類型多。

調(diào)查顯示作為我國野生稻資源最豐富的廣東和海南，普通野生稻的１１８２個分布點(diǎn)已消失了８０％。云南省農(nóng)科院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所目前為該省分布的3種野生稻建立了基因文庫IMN變性復(fù)性延伸(二)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因(二)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因①概念：PCR全稱為_______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)③條件：_______________________、_______________、___________(做啟動子)、___________.②原理:__________④方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）⑤結(jié)果：

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA復(fù)制已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對引物DNA聚合酶指數(shù)2n使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴(kuò)增利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因⑥過程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________B、復(fù)性（55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈（三）通過DNA合成儀用化學(xué)方法人工合成DNA合成儀蛋白質(zhì)的氨基酸順序mRAN核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因推測推測合成

當(dāng)基因比較小、蛋白質(zhì)的氨基酸序列可以測得或核苷酸序列已知時，可采用此種方法。DNA合成儀1.下表關(guān)于基因工程中有關(guān)基因操作的名詞及對應(yīng)的內(nèi)容，正確的組合是 2、下列屬于獲取目的基因的方法的是()①利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成②從基因組文庫中提?、蹚氖荏w細(xì)胞中提?、芾肞CR技術(shù)⑤利用DNA轉(zhuǎn)錄 ⑥人工合成A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥質(zhì)粒目的基因限制酶DNA連接酶重組DNA1.用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出____________。2.用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。——

核心3.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個重組

DNA分子（重組質(zhì)粒：實(shí)際上是不同來源的基因重組的過程）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建

科學(xué)家在培育抗蟲棉時，經(jīng)過了許多復(fù)雜的過程和不懈的努力，才獲得成功。起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲基因在棉花體內(nèi)沒有表達(dá)。然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入啟動子(抗蟲基因首端)，導(dǎo)入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力?？茖W(xué)家又在有啟動子、抗蟲基因的質(zhì)粒中插入終止子(抗蟲基因末端)，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長的植株，有了抗蟲能力。資料:作為基因表達(dá)載體只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎?

下列結(jié)構(gòu)中是基因表達(dá)載體組成必需的是？A、目的基因B、啟動子

C、終止子D、標(biāo)記基因E、抗生素基因F、復(fù)制原點(diǎn)第二步:基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心

復(fù)制原點(diǎn)+目的基因+啟動子+終止子+標(biāo)記基因構(gòu)建目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞常用的受體細(xì)胞：動植物細(xì)胞、大腸桿菌、土壤農(nóng)桿菌、枯草桿菌等。轉(zhuǎn)化——目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

①農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力②原理：Ti質(zhì)粒上的T---DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。

目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞整合到受體細(xì)胞的染色體上目的基因的遺傳特性得以維持穩(wěn)定和表達(dá)3.轉(zhuǎn)化你能分析出農(nóng)桿菌不能將目的基因?qū)氲絾巫尤~植物的原因嗎?若想將一個抗病基因?qū)胄←溨?理論上你認(rèn)為應(yīng)該怎么做?（2）基因槍法(單子葉植物常用的方法)（3）花粉管通道法：（我國科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)，如轉(zhuǎn)基因抗蟲棉）2、將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞①方法：顯微注射法②程序：目的基因表達(dá)載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵新性狀動物2.微生物作受體細(xì)胞原因：3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞3.轉(zhuǎn)化方法：大腸桿菌繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對少

處理細(xì)胞→

細(xì)胞→表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合→_________細(xì)胞吸收DNA分子。Ca2+感受態(tài)感受態(tài)1.常用菌：第三步:將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞生物種類植物動物微生物常用方法受體細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射法Ca2+處理法體細(xì)胞受精卵原核細(xì)胞第四步:目的基因的檢測與鑒定

外源基因受體細(xì)胞染色體mRNA蛋白質(zhì)性狀

檢測：導(dǎo)入？檢測：轉(zhuǎn)錄？檢測：翻譯？鑒定：表現(xiàn)？

DNA分子雜交分子雜交抗原抗體雜交抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等IMN1.檢測1）檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因方法——DNA分子雜交技術(shù)基因探針：放射性同位素等標(biāo)記的DNA分子15N15N14N14N探針轉(zhuǎn)基因生物的DNA變性變性復(fù)性IMN1.檢測2）檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA方法——分子雜交技術(shù)15N15N14N探針轉(zhuǎn)基因生物的mRNA變性2、鑒定（個體生物學(xué)水平）3）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法:抗原--抗體雜交若不能表達(dá)，要對抗蟲基因再進(jìn)行修飾。

例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達(dá)。歸納:基因工程的基本操作程序獲取目的基因從基因文庫利用PCR化學(xué)方法人工合成構(gòu)建基因表達(dá)載體目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法目的基因的檢測與鑒定檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯鑒定：練一練1：由同一種限制性內(nèi)切酶切割成的黏性末端是①TCG②AATTCGAAGCTTAAGCT③CA④AGCTTC⑤AATTGAGTTCCAAGACTA、①②B、①③C、①④D、②③E、①⑤2.細(xì)菌的質(zhì)粒分子帶有一個抗菌素抗性基因，該抗性基因在基因工程中的主要作用是

A．提高受體細(xì)胞在自然環(huán)境中的耐藥性B．有利于對目的基因是否導(dǎo)入進(jìn)行檢測C．增加質(zhì)粒分子的分子量D．便于與外源基因連接3.

有關(guān)基因工程的敘述正確的是A．限制酶只在獲得目的基因時才用B．重組質(zhì)粒的形成是在細(xì)胞內(nèi)完成的C．質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體D．蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料4.哪項(xiàng)不是基因表達(dá)載體的組成部分()A.啟動子B.終止密碼

C.標(biāo)記基因D.目的基因5.下列哪項(xiàng)不是將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法()A．基因槍法B．顯微注射法

C.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法D．花粉管通道法

胰島素是治療糖尿病的特效藥，長期以來只能依靠從豬、牛等動物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰島素，其產(chǎn)量之低和價格之高可想而知。假如讓你用基因工程的方法使大腸桿菌生產(chǎn)出人的胰島素，想一想，如何設(shè)計(jì)？

嘗試設(shè)計(jì)植物基因工程碩果累累動物基因工程前景廣闊基因工程藥物異軍突起基因治療曙光初照基因工程的應(yīng)用1.植物基因工程碩果累累

1）抗蟲轉(zhuǎn)基因植物

2）抗病轉(zhuǎn)基因植物

3）抗逆轉(zhuǎn)基因植物

4）改良植物品質(zhì)2.動物基因工程前景廣闊

1）提高動物生長速度2）改善畜產(chǎn)品質(zhì)量

3）生產(chǎn)藥物:乳腺生物反應(yīng)器

4）用轉(zhuǎn)基因動物作器官移植的供體:導(dǎo)入調(diào)節(jié)因子,抑制抗原決定基因的表達(dá)在傳統(tǒng)的藥品生產(chǎn)中，藥品直接從生物的組織、細(xì)胞或血液中提取傳統(tǒng)生產(chǎn)方法的缺點(diǎn)原料限制價格昂貴利用基因工程方法制造