第六章真菌的檢驗

第六章食品中真菌及其檢驗

霉菌與酵母計數(shù)常見產(chǎn)毒霉菌的鑒定霉菌的生物學(xué)特征霉菌是絲狀真菌的俗稱，意即“發(fā)霉的真菌”，它們往往能形成分枝繁茂的菌絲體，很多物品上長出一些肉眼可見的絨毛狀、絮狀或蛛網(wǎng)狀的菌落，那就是霉菌。

霉菌有著極強的繁殖能力，而且繁殖方式也是多種多樣的。雖然霉菌菌絲體上任一片段在適宜條件下都能發(fā)展成新個體，但在自然界中，霉菌主要依靠產(chǎn)生形形色色的無性或有性孢子進(jìn)行繁殖。圖片霉菌的菌落由于霉菌的菌絲較粗而長，因而霉菌的菌落較大，有的霉菌的菌絲蔓延，沒有局限性，其菌落可擴展到整個培養(yǎng)皿，有的種則有一定的局限性，直徑1~2厘米或更小。菌落質(zhì)地一般比放線菌疏松，外觀干燥，不透明，呈現(xiàn)或緊或松的蛛網(wǎng)狀、絨毛狀或棉絮狀；菌落與培養(yǎng)基的連接緊密，不易挑??；菌落正反面的顏色和邊緣與中心的顏色常不一致。Photoofmouldconoly真菌與食品腐敗由于它們生長緩慢和競爭能力不強，故常常在不適于細(xì)菌生長的食品中出現(xiàn)，這些食品是pH低、濕度低、含鹽和含糖高的食品、低溫貯藏的食品，含有抗菌素的食品等

。

由于霉菌和酵母能抵抗熱、冷凍，以及抗菌素和輻照等貯藏及保藏技術(shù)，它們能轉(zhuǎn)換某些不利于細(xì)菌的物質(zhì)，而促進(jìn)致病細(xì)菌的生長。有些霉菌能夠合成有毒代謝產(chǎn)物－霉菌毒素。霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。酵母的生物學(xué)特征酵母菌是單細(xì)胞真核微生物。酵母菌細(xì)胞的形態(tài)通常有球形、卵圓形、臘腸形、橢圓形、檸檬形或藕節(jié)形等。酵母菌無鞭毛，不能游動。

大多數(shù)酵母菌的菌落特征與細(xì)菌相似，但比細(xì)菌菌落大而厚，菌落表面光滑、濕潤、粘稠，容易挑起，菌落質(zhì)地均勻，正反面和邊緣、中央部位的顏色都很均一，菌落多為乳白色，少數(shù)為紅色，個別為黑色。

霉菌和酵母可以作為評價食品衛(wèi)生質(zhì)量的指示菌，并以霉菌和酵母計數(shù)來制定食品被污染的程度。霉菌和酵母計數(shù)

GB4789.15-2010本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中霉菌和酵母（mouldsandyeasts）計數(shù)的檢驗方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于各類食品中霉菌和酵母菌的計數(shù)。霉菌和酵母的計數(shù)定義：霉菌和酵母菌數(shù)的測定是指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后，所得1克（毫升）檢樣中所含的霉菌和酵母菌落總數(shù)。（糧食樣品是指1克糧食表面的霉菌總數(shù)。）檢測方法：平板傾注混合法。真菌檢測與細(xì)菌檢測培養(yǎng)基：細(xì)菌是計數(shù)平板；真菌是PDA（加抗菌素）、孟加拉紅培養(yǎng)基。溫度：細(xì)菌37℃，真菌25～28℃培養(yǎng)時間：細(xì)菌—2天，霉菌—3-5天計算方法：細(xì)菌—30～300個/皿；霉菌—10～150個/皿稀釋度的選擇與報告方式：一個稀釋度使用兩個平板，取兩個平板菌落數(shù)的平均值，乘以稀釋倍數(shù)報告之。菌落蔓延，報告為多不可計（細(xì)菌總數(shù)，則直接報告菌落蔓延）。霉菌直接鏡檢計數(shù)法本方法適用于各種加工的水果和蔬菜制品，如番茄醬、果醬和果汁等。霉菌可以作為一種指示菌，表明加工制品的原料有霉菌所致的腐爛存在。此法系在一個標(biāo)準(zhǔn)計數(shù)玻片上計數(shù)含有霉菌菌絲的顯微鏡視野。玻片郝氏計測玻片或稱霍華德（Howard）霉菌計數(shù)器。是一特制的、具有標(biāo)準(zhǔn)計測室的玻片。系特制的玻璃載片，帶有一個20mm×15mm的長方形平面，即計測室，其周圍有溝，兩側(cè)各有一條高出長方形平面0.1mm的肩堤，蓋片放在肩堤上面，蓋片和長方形平面之間相距0.1mm。中央長方形平面，肩堤和蓋片共同形成一個光學(xué)工作面。為了便于校正顯微鏡，計測玻片上刻有兩條相距1.382mm的平行線，作為校正顯微鏡視野的標(biāo)準(zhǔn)線。顯微鏡霉菌直接計數(shù)用的雙筒顯微鏡一定要有標(biāo)準(zhǔn)化視野，在90~125倍時視野直徑為1.382mm。同時在一個目鏡中裝配有一個特制的測微玻璃圓盤，其上刻有每邊長度相當(dāng)于視野直徑1/6的36個小方格。霉菌直接鏡檢計數(shù)法檢樣的制備：取定量檢樣，加蒸餾水稀釋至折光指數(shù)為1.3447～1.3460(即濃度為7.9%～8.8%)，備用。顯微鏡標(biāo)準(zhǔn)視野的校正：將顯微鏡按放大率90～125倍調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)視野，使其直徑為1.382mm。涂片：洗凈郝氏計測玻片，將制好的標(biāo)準(zhǔn)液，用玻璃棒均勻的攤布于計測室，以備觀察。觀測：將制好之載玻片放于顯微鏡標(biāo)準(zhǔn)視野下進(jìn)行霉菌觀測，一般每一檢樣應(yīng)觀察50個視野，最好同一檢樣兩人進(jìn)行觀察。霉菌菌絲的特征（1）平行壁：霉菌菌絲呈管狀，多數(shù)情況下，整個菌絲體的直徑是一致的。因此在顯微鏡下菌絲壁看起來像兩條平行的線。這是區(qū)別霉菌菌絲和其他纖維時最有用的特征之一。（2）橫隔：許多霉菌的菌絲具有橫隔，毛霉、根霉等少數(shù)霉菌的菌絲沒有橫隔。（3）菌絲內(nèi)呈粒狀：薄壁、呈管狀的菌絲含有原生質(zhì)，在高倍顯微鏡下透過細(xì)胞壁可見其呈粒狀或點狀。（4）分枝：如菌絲不太短，則多數(shù)呈分枝狀，分枝與主干的直徑幾乎相同，有分枝是鑒定霉菌最可靠的特征之一。（5）菌絲的頂端：常呈鈍圓形。（6）無折射現(xiàn)象。凡有以上特征之一的絲狀體均可判定為霉菌菌絲。霉菌直接鏡檢計數(shù)法之計算觀察視野中有無菌絲，凡符合下列情況之一者為陽性視野：（1）一根菌絲長度超過視野直徑1/6；

（2）一根菌絲長度加上分枝的長度超過視野直徑1/6；

（3）兩根菌絲總長度超過視野直徑1/6；

（4）三根菌絲總長度超過視野直徑1/6；

（5）一叢菌絲可視為一個菌絲，所有菌絲（包括分枝）總長度超過視野直徑1/6；

根據(jù)對所有視野的觀察結(jié)果，計算陽性視野所占比例，并以陽性視野百分?jǐn)?shù)（%）報告結(jié)果。檢查視野數(shù)的確定對一般樣品，每個涂片均檢查50個視野（每一個樣品至少應(yīng)測25個視野，才能代表樣品的各個部分。如果檢查結(jié)果陽性視野低于30％，則檢查25個視野即可；如果在30～40％之間，須檢查50個視野；如果在40～50％之間，須檢查100個視野；如果在50％以上或超過更多，則要繼續(xù)檢查，直至檢查25個視野的結(jié)果與一系列計算結(jié)果無差異為止）。所檢查的50個視野要均勻地分布在計測室上，可用顯微鏡載物臺上帶有標(biāo)尺的推進(jìn)器來控制，從上到下，或從左到右一行行有規(guī)律地進(jìn)行觀察。無法判斷視野中絲狀物是否菌絲，可以放大觀察倍數(shù)。各國番茄醬罐頭霉菌直接鏡檢計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)

國別陽性視野%美國≤40加拿大≤50澳大利亞≤50法國標(biāo)準(zhǔn)級≤60，特級≤50意大利標(biāo)準(zhǔn)級≤65，特級≤50英國≤50中國≤50常見產(chǎn)毒霉菌的鑒定【GB4789.16—2003】本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中常見的產(chǎn)毒霉菌的鑒定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于曲霉屬、青霉屬、鐮刀菌屬及其他菌屬的產(chǎn)毒菌種的鑒定。鑒定步驟：菌落觀察→斜面觀察→制片→鏡檢→報告

真菌的毒素（霉菌）分類（按作用的組織）：肝毒素、腎毒素、神經(jīng)毒素、心臟毒素、造血器官毒素等。不同的菌有不同的毒素，同一種菌會產(chǎn)不同的毒素。危害急性中毒：一次吃大量毒素引起。發(fā)生于人較少，動物較多。慢性中毒：長期、少量攝入引起，類似維生素缺乏癥，一般療效差。易被污染的食品：巴氏消毒的食品、糧食、調(diào)味品、發(fā)酵食品。

霉菌毒素的作用減少細(xì)胞分裂抑制蛋白質(zhì)合成和DNA復(fù)制抑制DNA和組蛋白形成復(fù)合物影響核酸合成降低免疫應(yīng)答霉菌產(chǎn)毒特點霉菌產(chǎn)毒僅限于少數(shù)的產(chǎn)毒霉菌，而且產(chǎn)毒菌種中也是一部分菌株產(chǎn)毒；產(chǎn)毒菌株的產(chǎn)毒能力表現(xiàn)出可變性和易變性；一種菌株或菌種可以產(chǎn)生幾種不同毒素，多種霉菌可能產(chǎn)生同一毒素；產(chǎn)毒菌株產(chǎn)毒需要一定條件。菌落的觀察為了培養(yǎng)完整的巨大菌落以供觀察記錄，可將純培養(yǎng)物點植于平板上。方法是：將平板倒轉(zhuǎn)，向上接種一點或三點，每菌接種兩個平板，倒置于25～28℃溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)剛長出小菌落時，取出一個平皿，以無菌操作，用小刀將菌落連同培養(yǎng)基切下1cm×2cm的小塊，置菌落一側(cè)，繼續(xù)培養(yǎng)，于5～14d進(jìn)行觀察。此法代替小培養(yǎng)法，可直接觀察子實體著生狀態(tài)。

斜面觀察將霉菌純培養(yǎng)物劃線接種(曲霉、青霉)或點種(鏈刀菌或其他菌)于斜面，培養(yǎng)5～14d；觀察菌落形態(tài)，同時還可以將菌種管置顯微鏡下用低倍鏡直接觀察孢子的形態(tài)和排列。

制片取載玻片加乳酸－苯酚液一滴，用接種針鉤取一小塊霉菌培養(yǎng)物，置乳酸－苯酚液中，用兩支分離針將培養(yǎng)物撕開成小塊，切忌涂抹，以免破壞霉菌結(jié)構(gòu)。然后加蓋玻片，如有氣泡，可在酒精燈上加熱排除。制片時最好是在接種罩內(nèi)操作，以防孢子飛揚。鏡檢與報告觀察霉菌的菌絲和孢子的形態(tài)和特征、大小、顏色、孢子的排列等，并做詳細(xì)記錄。根據(jù)菌落形態(tài)及鏡檢結(jié)果，參照以下各種霉菌的形態(tài)描述及檢索表，確定菌種名稱。

主要污染的食品曲霉屬(Aspergillus)本屬的產(chǎn)毒霉菌主要包括黃曲霉、寄生曲霉、雜色曲霉、構(gòu)巢曲霉和棕曲霉。這些霉菌的代謝產(chǎn)物為黃曲霉毒素、雜色曲霉素和棕曲霉毒素。曲霉屬的顏色多樣，而且比較穩(wěn)定。營養(yǎng)菌絲體由具橫隔的分枝菌絲構(gòu)成，無色或有明亮的顏色。分生孢子梗大都無橫隔，光滑、粗糙或有麻點。菊花狀分生孢子頭。分生孢子頭有各種不同顏色和形狀，如球形、放射形、棍棒形或直柱形等。曲霉屬只少數(shù)種形成有性階段，產(chǎn)生封閉式的閉囊殼。某些種產(chǎn)生菌核或菌核結(jié)構(gòu)。少數(shù)種可產(chǎn)生不同形狀的殼細(xì)胞。曲霉頂囊小梗（單層或雙層）梗基分生孢子足細(xì)胞黃曲霉(A.flavuss)屬于黃曲霉群。在察氏瓊脂培養(yǎng)基上菌落生長較快，10～14d直徑3～4或4～7cm，最初帶黃色，然后變?yōu)辄S綠色，老后顏色變暗，平坦或有放射狀溝紋，反面無色或帶褐色。黃曲霉產(chǎn)生黃曲霉毒素，該毒素能引起動物急性中毒死亡，如長期食用含微量黃曲霉毒素的食物，能引起肝癌。

黃曲霉毒素產(chǎn)毒條件：溫度范圍12～42℃，最適產(chǎn)毒溫度為33℃，最適Aw為0.93~0.98。毒素種類：B1，B2中毒癥狀：肝毒素，抑制肝臟細(xì)胞中RNA的合成等

1、急性和亞急性中毒：肝細(xì)胞迅速變性、壞死，出血及膽管增生，在幾天或十幾天死亡。

2、慢性中毒：肝功能降低、硬化，在幾周或十幾周死亡。

3、致癌性：小劑量反復(fù)或一次性大劑量攝入，引起肝癌。寄生曲霉(A.parasiticus)屬于黃曲霉群，8～10d菌落2.5～4cm，平坦或帶放射狀溝紋，幼時帶黃色，老后呈暗綠色，反面，奶油色至淡褐色。寄生曲霉的菌株都能產(chǎn)生黃曲霉毒素。

黃曲霉雜色曲霉(A.versicolor)屬于雜色曲霉群。在察氏瓊脂培養(yǎng)基上菌落生長局限，14d直徑2～3cm，絨狀、絮狀或兩者同時存在。顏色變化相當(dāng)廣泛，不同菌系可能局部淡綠、灰綠、淺黃甚至粉紅色；反面近于無色至黃橙色或玫瑰色。有的菌落有無色至紫紅色的液滴。有些菌系產(chǎn)生球形的殼細(xì)胞。雜色曲霉產(chǎn)生雜色曲霉素，該毒素引起肝和腎的損害，并能引起肝癌。

構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)屬于構(gòu)巢曲霉群。菌落生長較快，14d直徑5～6cm，絨狀，綠色，有的菌系由于產(chǎn)生較多的閉囊殼而顯現(xiàn)黃褐色，反面紫紅色。閉囊殼球形，暗紫紅色，直徑135～150μm。子囊孢子雙凸鏡形，紫紅色，約5μm×4μm，有兩個雞冠狀突起。閉囊殼外面包圍著一層殼細(xì)胞，淡黃色，球形，壁厚，直徑約25μm。構(gòu)巢曲霉產(chǎn)生雜色曲霉素。

赭曲霉(A.ochraceus)屬于赭曲霉群。在察氏瓊脂培養(yǎng)基上菌落生長稍局限，10～14d直徑3～4cm，褐色或淺黃色，基質(zhì)中菌絲無色或具有不同程度的黃色或紫色，反面帶黃褐色或綠褐色。有些菌系產(chǎn)生較多的菌核，初期為白色，老后淡紫色，球形、卵形至柱形，直徑達(dá)1mm。赭曲霉產(chǎn)生赭曲霉毒素，該毒素是種強的腎臟毒和肝臟毒

赭曲霉毒素赭曲霉毒素——包括A、B、C等7種結(jié)構(gòu)類似的化合物，其中以赭曲霉毒素A毒性最大。由赭色曲霉屬和幾種青霉屬產(chǎn)生。赭曲霉毒素可損害動物腎臟和肝臟，有致畸和致癌作用。

一般容易感染赭曲霉毒素A的商品包括的大豆、綠豆、綠咖啡豆、啤酒、調(diào)味品、草本植物等。青霉屬(Penicillium)本屬產(chǎn)毒霉菌，主要包括黃綠青霉、桔青霉、圓弧青霉、展開青霉、純綠青霉、紅青霉、產(chǎn)紫青霉、冰島青霉和皺褶青霉等。青霉屬的營養(yǎng)菌絲體呈無色、淡色或鮮明的顏色，具橫隔。氣生菌絲密氈狀、松絮狀或部分結(jié)成菌絲索。分生孢子梗由埋伏型或氣生型菌絲生出，稍垂直于該菌絲，具橫隔，光滑或粗糙。其先端生有掃帚狀的分枝輪，稱為帚狀枝。孢子多數(shù)呈藍(lán)綠色，有時呈無色或呈別種淡色，但決不呈污黑色。少數(shù)種產(chǎn)生閉囊殼，或結(jié)構(gòu)疏松柔軟，較快地形成子囊和子囊孢子，或質(zhì)地堅硬如菌核狀由中央向外緩慢地成熟。還有少數(shù)菌種產(chǎn)生菌核。青霉分生孢子梗副枝?；」７稚咦狱S綠青霉(P.citreoviride)

異名：毒青霉(P.toxicarum)屬單輪青霉組，斜臥青霉系。菌落生長局限，10～12d直徑2～3cm，表面皺褶，有的中央凸起或凹陷，淡黃灰色，僅微具綠色，表面絨狀或稍現(xiàn)絮狀，營養(yǎng)菌絲細(xì)，帶黃色。滲出液很少或沒有，有時呈現(xiàn)檸檬黃色，略帶霉味。反面及培養(yǎng)基呈現(xiàn)亮黃色。分生孢子梗自緊貼于基質(zhì)表面的菌絲生出。帚狀枝大部為單輪，偶爾有作一、二次分枝者。黃綠青霉的代謝產(chǎn)物為黃綠青霉素，該毒素是一種很強的神經(jīng)毒。

桔青霉(P.citrinum)屬于不對稱青霉組，絨狀青霉亞組，桔青霉系。菌落生長局限，10～14d直徑2～2.5cm，有放射狀溝紋，大多數(shù)菌系為絨狀，另一些則呈現(xiàn)絮狀，艾綠色。反面黃色至橙色，培養(yǎng)基顏色相仿或帶粉紅色。滲出液呈淡黃色。低倍顯微鏡下分生孢子鏈為明確的分散柱狀。分生孢子梗大多自基質(zhì)生出，也有自菌落中央氣生菌絲生出者，帚狀枝由3～4個輪生而略散開的梗基構(gòu)成。桔青霉產(chǎn)生桔青霉素，該毒素是一種強的腎臟毒。展開青霉所產(chǎn)展青霉素素是一種神經(jīng)毒，可引起動物中毒死亡，皮下反復(fù)注射，可引起注射部位產(chǎn)生肉瘤。皺褶青霉菌落較小（12~15d,1.0~1.5cm）屬于對稱二輪青霉。所產(chǎn)毒素為肝臟毒。純綠青霉黃變米毒素黃變米：由于被真菌污染而呈黃色，主要霉菌為青霉屬。1、黃綠青霉毒素：大米水分14.6%，溫度12～13℃產(chǎn)生，神經(jīng)毒，不溶于水，270℃可被破壞。米粒有黃色病斑。2、桔青霉毒素：難溶于水，腎毒素；也可由暗藍(lán)青霉、黃綠青霉、展青霉、土曲霉產(chǎn)生。米粒呈黃綠色。3、島青霉毒素：肝臟毒素。米粒呈黃褐色潰瘍性病斑。鐮刀菌屬（Uusarium）本屬的產(chǎn)毒霉菌主要包括禾谷鐮刀菌、串珠鐮刀菌、雪腐鐮刀菌、三線鐮刀菌、梨孢鐮刀菌等。有毒代謝產(chǎn)物：單端孢霉烯族化合物、玉米赤霉烯酮和丁烯酸內(nèi)酯等。伏馬毒素伏馬毒素——包括7種衍生物，由串珠鐮刀菌等產(chǎn)生。伏馬毒素被懷疑可誘發(fā)人類的食道癌、肝癌等疾病。對我國海門地區(qū)進(jìn)行的3年跟蹤研究結(jié)果表明：伏馬毒素還可使人導(dǎo)致肝癌。

伏馬毒素大多存在于玉米及玉米制品中。

玉米赤霉烯酮禾谷鐮刀菌等菌易侵染收割后保存不當(dāng)（如收割后捆成捆，放在潮濕環(huán)境中，或堆成垛子保存）的谷物，如玉米、小麥、大麥、黑麥等。玉米赤霉烯酮——又稱F2毒素，有15種以上衍生物，主要是由禾谷鐮刀菌等菌種產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，是一種雌激素真菌毒素。具有較強的生殖毒性和致畸作用，可引起動物發(fā)生雌激素亢進(jìn)癥，導(dǎo)致動物不孕或流產(chǎn)。

尖孢鐮刀菌寄生于玉米、大麥和小麥等作物的種子，產(chǎn)T－2毒素和玉米赤霉烯酮梨