微生物學(xué)常用技術(shù)

微生物學(xué)常用技術(shù)第一頁，共七十五頁，2022年，8月28日第2講微生物實驗技術(shù)（1）第二頁，共七十五頁，2022年，8月28日內(nèi)容提要微生物實驗最基本的原理與微生物培養(yǎng)的主要工作(ThefiveI’s)發(fā)酵工程菌種保藏顯微術(shù)第三頁，共七十五頁，2022年，8月28日？講在課前……作為一名學(xué)生，是否應(yīng)該接受老師的權(quán)威表述？你的回答是什么？

Yes?這當(dāng)然是正確的，因為每一位教師在教學(xué)中所說的每一件事都是經(jīng)過考證、研究證明是新的，合理的。這個課堂的學(xué)習(xí)，最終應(yīng)該讓大家學(xué)習(xí)到這個學(xué)科研究的知識框架，了解當(dāng)代微生物學(xué)知識的一個全景……第四頁，共七十五頁，2022年，8月28日了解如何進(jìn)行微生物的操作很重要？但是，這種依據(jù)是否過于簡單？你的這個“是”，是否還應(yīng)該加上一些附加條件？比如對這些知識的得來有個基本的認(rèn)識？在一個依賴于高度發(fā)達(dá)的技術(shù)的社會，作為一個普通的人要以批判的眼光去看待科學(xué)研究的結(jié)果，正確判定哪些應(yīng)該是大家公認(rèn)的，而哪些可能是冒險。哲學(xué)的說法即：要有證偽的態(tài)度與能力—真理只能被證偽而不能被證實。必須具備相應(yīng)的知識，并能對新出現(xiàn)的知識有正確的評判。第五頁，共七十五頁，2022年，8月28日卡爾·波普爾—著作《猜想與反駁》——提出科學(xué)和非科學(xué)劃分的證偽原則。證偽主義使人們相信所有的科學(xué)都只是一種猜測和假說，它們不會被最終證實，但卻會被隨時證偽。最好的假說是終極真理的代名詞，和科學(xué)精神相悖?！既徽胬恚航?jīng)驗科學(xué)應(yīng)該服從一種證偽主義。應(yīng)采用試錯法。這是指人們應(yīng)該大膽地提出假說和猜測，然后去尋找和這一假說不符合的事例。根據(jù)事例對假說進(jìn)行修正，不斷重復(fù)這一過程，乃至將最初的假說全盤否定。試錯法對理論的修改和完善是沒有止境的，試錯法的結(jié)果只能是一個較好的假說，但不是最好的假說。第六頁，共七十五頁，2022年，8月28日卡爾·波普爾—著作《猜想與反駁》——證偽主義至少存在兩個優(yōu)點。第一，科學(xué)理論的表達(dá)一般為全稱判斷，而經(jīng)驗的對象是個別的。所以，經(jīng)驗如果用來證實理論，那么它將是無法窮盡一般的理論的。比如，再多的白羊也不能證明所有的羊都是白的，而只要一只黑羊就能證明所有的羊都是白的這個理論是錯誤的。所以，經(jīng)驗的真正意義在于可以證偽科學(xué)理論。第二，證偽主義可以避免對錯誤理論的辯護(hù)和教條。如果堅持實證主義，那么一旦出現(xiàn)與理論相悖的經(jīng)驗，人們便會做出特殊的設(shè)定或限制以使得理論能滿足經(jīng)驗。但實際上這樣的設(shè)定往往是極不科學(xué)的。第七頁，共七十五頁，2022年，8月28日了解如何進(jìn)行微生物的操作很重要？科學(xué)的精神—正是“通識”課程的本意：科學(xué)總是尋求發(fā)現(xiàn)和了解客觀世界的新現(xiàn)象，研究和掌握新規(guī)律，總是在不懈地追求真理?？茖W(xué)是認(rèn)真的、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嵤虑笫碌?，同時科學(xué)又是創(chuàng)造的，科學(xué)的最基本態(tài)度之一就是疑問，科學(xué)的最基本精神之一就是批判（-第一推動叢書，總序）。而如何才能做到這些呢？這就必須對學(xué)科的本源，實驗原理和操作手段有所了解。第八頁，共七十五頁，2022年，8月28日實驗由實驗操作學(xué)習(xí)開始，會使學(xué)習(xí)更有興趣，得到的知識更能記住。微生物學(xué)由此研究對象的獨特性，其研究手段極具特色，并已經(jīng)在生物科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用第九頁，共七十五頁，2022年，8月28日ThefiveI’s微生物實驗最基本的原理PureCulture——微生物研究的基礎(chǔ)第十頁，共七十五頁，2022年，8月28日微生物學(xué)

最基本的理念與最基礎(chǔ)的工作最基本理念（純培養(yǎng)，無菌操作，群體研究）最基礎(chǔ)的工作_培養(yǎng)基與分離純化第十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日根本原理-生命由“種子產(chǎn)生”在19世紀(jì)后葉，巴斯德的一個著名實驗之后，一個基本的觀念即被人們廣泛接受：即生命物質(zhì)不能由非生命物質(zhì)產(chǎn)生。(實驗是什么？)在一個巧妙設(shè)計的容器中裝入滅過菌的肉湯，并能接觸空氣和保溫，而又不使生活在空氣中的微生物進(jìn)入。--------20世紀(jì)60年代，在倫敦皇家研究所還能見到19世紀(jì)后期保存的那些約翰·丁德爾配制的陳年肉湯。第十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日微生物學(xué)研究面臨的幾個問題微生物群體是形形色色的”大雜燴“Mosthabitats(suchasthesoilandthehumanmouth)harbormicrobesincomplexassociations.研究通常只能在實驗室“人工”環(huán)境開展Second,tomaintainandkeeptrackofsuchsmallresearchsubjects,microbiologistsusuallyhavetogrowthemunderartificialconditions.“感雜”必需防止Athirddifficultinworkingwithmicrobesisthattheyareinvisibleandwidelydistributed,andundesirableonescanbeintroducedintoanexperimentandcausemisleadingresults.第十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日微生物學(xué)實驗最基本的理念（1）滅過菌的物質(zhì)在適當(dāng)條件下將保持無菌狀態(tài)，除非有人去感染它!這就是微生物學(xué)最基本的原理。（2）當(dāng)我們制備出滅菌的肉湯，用單一的品種去感染，可以保持微生物的“純一”-微生物培養(yǎng)物。第十四頁，共七十五頁，2022年，8月28日微生物學(xué)實驗室最基本的理念……微生物學(xué)研究的基礎(chǔ)是必須首先想法培育出不被從另處而來的微生物污染(感染)的純一的種系。微生物學(xué)研究技術(shù)在整體上與生物學(xué)其它領(lǐng)域的技術(shù)有明顯的區(qū)別。你可以抓住一條狗、一株植物，用各種方式，想各種辦法去觀察它們，但你目前不能對某個單個的微生物進(jìn)行這些工作!（3）群體研究微生物學(xué)家們的研究策略，同化學(xué)家們一樣(化學(xué)家們總是從對成千上萬個分子而非單一分子研究中得到信息)，研究對象通常是群體。第十五頁，共七十五頁，2022年，8月28日可見，微生物實驗室最基本的要求是必須做好微生物的控制。讓我們認(rèn)識其中幾個基本的概念：

Sterile(滅菌),relatestothecompletelyabsenceofviablemicrobe;Aseptic(防腐),relatestopreventionofinfection;Pureculture(純培養(yǎng))referstogrowthofasinglespeciesofmicrobes.微生物學(xué)實驗室最基本的理念第十六頁，共七十五頁，2022年，8月28日工作的基礎(chǔ)：無菌技術(shù)無菌技術(shù):容易想到,要取得純培養(yǎng)的成功，必須做到培養(yǎng)基的組成必須適合微生物的需要，而且培養(yǎng)基、玻璃器皿、器械也一定要是無菌的。此外，在操作中要把被來自空氣里微生物污染的可能性減少到最小(感雜）。微生物學(xué)上把這種技術(shù)叫做無菌技術(shù)。無菌操作技術(shù)已經(jīng)成為高端生物技術(shù)的基本要求（生物發(fā)酵，組織培養(yǎng)，胚胎克隆，干細(xì)胞研究……）。第十七頁，共七十五頁，2022年，8月28日微生物實驗室風(fēng)淋室第十八頁，共七十五頁，2022年，8月28日微生物學(xué)最基礎(chǔ)的工作——CULTURE（1）培養(yǎng)基：微生物學(xué)上的培養(yǎng)基，即微生物可以在其內(nèi)部或是表面生長的一種“湯”或是膠凍。其中含有微生物生長所需要的少量鐵、鎂、磷、鈉、鉀、鈣等元素、銨鹽的氮源及某種碳化合物。試想：如果你有這樣一杯“肉湯”，用1克土去感染這種溶液，會有什么結(jié)果？第十九頁，共七十五頁，2022年，8月28日一杯肉湯的故事我們相信，在自然的任何一口水池、一片沼澤……類似的故事，正在不斷重復(fù)。我們是一群土壤細(xì)菌，小桿狀身姿最大方！好氧菌首先生長，氧化糖類而迅速耗盡氧氣厭氧菌如梭菌等生長于深層，產(chǎn)生惡心臭味。并有二氧化碳釋放（厭氧呼吸）接下來是硝酸鹽呼吸！硫酸鹽呼吸如果有甲烷球菌，則它們是笑到最后者（碳酸鹽呼吸）早就告訴過你們，圓才是永恒的！地球不都是圓的嗎？第二十頁，共七十五頁，2022年，8月28日純培養(yǎng)pureculture，axenicculture純培養(yǎng)：單一種類存在的狀態(tài)下所進(jìn)行的生物培養(yǎng)。所有微生物、植物和動物都可以進(jìn)行這種培養(yǎng)，高等植物或動物的無菌培養(yǎng)（無菌飼養(yǎng)）也可說是一種純培養(yǎng)。純培養(yǎng)最重要的是在于微生物的生理研究，方法是依靠滅菌和分離，是由巴斯德（L．Pasteur）和柯赫（R．Koch）建立起來的。在自然界中，有的培養(yǎng)條件很困難，特別是具有密切共生關(guān)系的生物及進(jìn)行寄生性營養(yǎng)的生物；也有一些在理論上不可能進(jìn)行純粹培養(yǎng)的生物。第二十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日純培養(yǎng)pureculture，axenicculture微生物學(xué)純培養(yǎng)(pureculture)——微生物學(xué)中把從一個細(xì)胞或一群相同的細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)繁殖而得到的后代,稱純培養(yǎng).克隆與菌落純：如果在一個菌落中所有細(xì)胞均來自于一個親代細(xì)胞，那么這個菌落稱為純培養(yǎng)（Pureculture，克?。Ｔ谶M(jìn)行菌種鑒定時，所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物。而一般通過簡單劃線而得的僅稱菌落純。得到純培養(yǎng)的過程稱為分離純化。第二十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日微生物學(xué)實驗最基礎(chǔ)的工作

平板和單菌落分離技術(shù)微生物中最常的是一種帶蓋的平皿，稱為培養(yǎng)皿。平板：皿中裝入以瓊脂為凝固劑的液態(tài)培養(yǎng)基，冷卻后凝固形成一個平面，用于微生物的分離和培養(yǎng)稱為平板。菌落：各個彼此分開微生物個體在固體平面上，每個分開的微生物個體在膠凍狀的固體培養(yǎng)基中生長時，將繁殖出同類微生物的肉眼可見群落，稱為菌落。第二十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日培養(yǎng)基的種類與分類第二十四頁，共七十五頁，2022年，8月28日TypesOfMedia

培養(yǎng)基按物理性狀分類Physicalform按化學(xué)性狀分類Chemicalcomposition按功能進(jìn)行分類Functionaltype第二十五頁，共七十五頁，2022年，8月28日按物理性狀分類液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基活體培養(yǎng)基第二十六頁，共七十五頁，2022年，8月28日液體培養(yǎng)基Liquidmedia（液體培養(yǎng)基）tendtoflowfreelywhenthecontaineristilted一種用于鑒別的液體培養(yǎng)基……Aselectivemediumforidentifyingthisspecies(腸道菌鑒別).ontheleft(o)isaclear,uninoculatedbroth,thebrothinthecenterisgrowingwithoutacolorchange(-),andontherightisabrothwithgrownandcolorchange(+)注釋與說明：液體培養(yǎng)基是生物發(fā)酵的基本方式。圖b為三種液體培養(yǎng)基，其左為未接種，中右為注意接種后的不同表現(xiàn)。第二十七頁，共七十五頁，2022年，8月28日第二十八頁，共七十五頁，2022年，8月28日(2)半固體培養(yǎng)基

SemisolidMediaContainasmallamount(0.3%~0.5%)ofAgar.半固體培養(yǎng)基是瓊脂含量低(0.3%~0.5%)的一種培養(yǎng)基，其物理性狀為柔軟的漿糊狀。可用于細(xì)菌的運動性及生理特性研究（如細(xì)菌的微好氧特性研究）。第二十九頁，共七十五頁，2022年，8月28日SIM培養(yǎng)基(sulfurindolemotilitymedium，硫醚吲哚機(jī)動培養(yǎng)基):Possibleresultsstartingfromthefarleftare:nogrowth,nomotility;motility;motilityandproduceofhydrogensulfidegas(硫化氫氣體)第三十頁，共七十五頁，2022年，8月28日(3)SolidMedia

固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基分可反復(fù)液化及不同液體兩種類型（Liquefiableandnonliquefiable:Liquefiablesolidmedia,sometimescalledreversiblesolidmedia,containasolidifyingagentthatchangesitsphysicalpropertiesinresponsetotemperature.—）注釋與說明：凡呈固體形態(tài)的培養(yǎng)基皆可稱固體培養(yǎng)基，有直接用天然固體物質(zhì)的，也有加各種凝固劑（如瓊脂）。同時也分可液化及不可液化兩類

。第三十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日第三十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日偉大的發(fā)現(xiàn)——瓊脂,acomplexpolysaccharide(多聚糖)isolatedfromtheredalgagelidium.第三十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日偉大的發(fā)現(xiàn)——瓊脂,acomplexpolysaccharide(多聚糖)isolatedfromtheredalgagelidium.瓊脂做固化劑的優(yōu)點:(1)適當(dāng)?shù)哪厅c及溶點——solidatroomtemperature,anditmelts(liquefies)attheboilingtemperatureofwater(100℃).Onceliquefied,agardoesnotresolidfyuntilitcoolsto42℃,soitcanbeinoculatedandpouredinliquidformattemperature(45-50℃)thatwillnotharmthemicrobesorthehandler.(注意:混菌法最佳溫度是45±1℃）第三十四頁，共七十五頁，2022年，8月28日(2)很好的可塑造性——Agarisflexibleandmoldable,anditprovidedabasicframeworktoholdmoistureandnutrients,(3)非易降解物——itisnotadigestiblenutrientformostmicroorganisms.一般用量：Anymediumcontaining1%to5%agarusuallyhasthewordagarinitsname——某某瓊脂…….第三十五頁，共七十五頁，2022年，8月28日Animalinoculation:“l(fā)ivingmedia”第三十六頁，共七十五頁，2022年，8月28日按培養(yǎng)基化學(xué)成份

（ChemicalContentofMedia

）Twotypes:合成培養(yǎng)基Synthetic(chemicallydefined)復(fù)雜培養(yǎng)基Complexornonsynthetic第三十七頁，共七十五頁，2022年，8月28日給我一個有效的培養(yǎng)基，讓我完成工作（按功能劃分培養(yǎng)基）為了獲得單一類型的微生物的培養(yǎng)物，微生物學(xué)中最常用的技術(shù)有兩種它們是富集與分離（

(1)富集培養(yǎng)；(2)單菌落分離技術(shù)。）這個工作也跟培養(yǎng)基密切相關(guān)。第三十八頁，共七十五頁，2022年，8月28日富集培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)基的配方

戲法人人會變，巧妙各有不同第三十九頁，共七十五頁，2022年，8月28日研究工作的開端：找到它們，并培養(yǎng)出來！富集培養(yǎng)基：Anenrichmediumcontainscomplexorganicsubstancessuchasblood,serum,hemoglobin,orspecialgrowthfactor(specificvitamins,aminoacids.

)thatcertainspeciesmusthaveinordertogrow.注釋與說明（1）growthfactor：生長因子，如特別的維生素、氨基酸。（2

)fastidious指難養(yǎng)菌.（3）hemoglobin（血紅蛋白）（4）pathogens病原體（5）紅色字體分別為鏈球菌、奈氏球菌（致淋?。?）agar瓊脂，bloodagar血瓊脂。第四十頁，共七十五頁，2022年，8月28日研究工作的開端：找到它們，并培養(yǎng)出來！

——富集培養(yǎng)基Bacteriathatrequiregrowthfactorsandcomplexnutrientsaretermedfastidious.Bloodagar,iswidelyusedtogrowfastidiousstreptococci

andotherpathogens.PathogenicNeisseria(onespeciescausesgonorrhea奈氏球菌，致淋病)aregrownonThayer-martinmediumorchocolateagar,whichismadebyheatingbloodagar.注釋與說明（1）growthfactor：生長因子，如特別的維生素、氨基酸。（2

)fastidious指難養(yǎng)菌.（3）hemoglobin（血紅蛋白）（4）pathogens病原體（5）紅色字體分別為鏈球菌、奈氏球菌（致淋?。?）agar瓊脂，bloodagar血瓊脂。第四十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日血瓊脂：Bloodagarplategrowingbacteriafromthehumanthroat.巧克力瓊脂Chocolateagar:commonlyusedtoculturethefastidiousgonococcus(getsitbrowncolorfromtheheatedblood,notfromchocolate.)第四十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日富集培養(yǎng)的基本做法富集培養(yǎng)基本是一種選擇性培養(yǎng)基。這一培養(yǎng)的要點，就是“投其所好”。如：（1）在沒有銨鹽的含糖培養(yǎng)基中可能得到某些固氮菌。（但請注意，隨著固氮菌的生長，其它細(xì)菌也可能隨著生長，從而使細(xì)菌群體變得十分混雜）用沒有糖類但含有硫的培養(yǎng)基我們可能得到硫細(xì)菌，而用硫酸鐵代替糖，則可能得到鐵細(xì)菌。第四十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日富集培養(yǎng)的基本做法（2）弱酸性含糖高的培養(yǎng)基，利于酵母和霉菌的生長。（3）隔絕空氣（如將液體培養(yǎng)基裝滿并塞緊，或者如泡菜壇的做法，但應(yīng)該注意，如果含糖高時，會出現(xiàn)蹦瓶！）（4）加熱處理土壤后，再培養(yǎng)，可能得到產(chǎn)芽孢的細(xì)菌，而將培養(yǎng)物置于高溫下，則可以選擇培養(yǎng)嗜熱菌。第四十四頁，共七十五頁，2022年，8月28日富集培養(yǎng)的可能性是無限的……，實際上，富集培養(yǎng)的可能性幾乎是無限的，如我們完全可以設(shè)計出-利用酒精？橡膠？塑料？或是耐高鹽？當(dāng)然，醫(yī)學(xué)微生物學(xué)家們通常很少做這個工作，因為富集過程已經(jīng)完畢……why?。但是，自然界的一些微生物，許多情況下，對我們的簡單富集技術(shù)無動于衷，這是微生物學(xué)家們最為苦惱的事之一。藐視！第四十五頁，共七十五頁，2022年，8月28日純化一但得到富集的群體，即得到了微生物的培養(yǎng)物，微生物學(xué)的研究就有了基礎(chǔ)。如何使群體純化，則是下一個首要的問題簡單和常用的方法-平皿培養(yǎng)法：把一滴培養(yǎng)物涂布于一個平板上，使各個微生物彼此分開，每個分離的微生物在平板的膠凍表面（或內(nèi)部）生長，將繁殖出“菌落”，而這些彼此相隔離的菌落可能就是一個純化的微生物培養(yǎng)物（菌落純）。第四十六頁，共七十五頁，2022年，8月28日Thesamemixedsamplecontainingfivedifferentspeciesisstreakedontotheplatesofgeneral-purposeednonselectivemediumandselectievmedium.第四十七頁，共七十五頁，2022年，8月28日鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基（differentialmedium）用于鑒別不同類型微生物的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中加入某種特殊的化學(xué)物質(zhì)，某種微生物在培養(yǎng)基中生長后能產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物，而這種代謝產(chǎn)物可以與培養(yǎng)基中的特殊化學(xué)物質(zhì)發(fā)生特定的化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的特征性變化，根據(jù)這種特征性變化，可將該種微生物與其他微生物區(qū)分開來。第四十八頁，共七十五頁，2022年，8月28日Nondifferentialanddifferentialmedium第四十九頁，共七十五頁，2022年，8月28日Contains7.5%sodiumchloride;Adyepinpoint(精確,指明)thosespeciesofStaphylococcous,turnredtoabrightyellow.Whereasmanyotherspeciesareinhibitedbythishighconcentration第五十頁，共七十五頁，2022年，8月28日MacConkeyagardifferentiatesbetweenlactose-fermentingbacteria(pink-red)andlactose-negativebacteria(nodyereaction)第五十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日第五十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日微生物實驗室中5個最基礎(chǔ)的工作接種培養(yǎng)分離觀察、檢查鑒定第五十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日預(yù)備工作——樣品采集

Specimen(待試物，樣品)Collection取樣（Specimencollection）:nearlyanyobjectormaterialcanserveasasourceofmicrobes.Commononesarebodyfluids(體液)andtissues,food,water,orsoil.Specimenareremovedbysomeformofsampling(v.取樣)device.Thismaybeaswab(涂棒),syringe(注射器),orspecialtransportsystemthatholds,maintains,andpreservesthemicrobesinthesample.第五十四頁，共七十五頁，2022年，8月28日接種與培養(yǎng)——

ProducingACultureTocultivate,orculture,microorganisms,oneintroduceatinysample(theinoculums接種物)intoacontainerofnutrientmedium(培養(yǎng)基,pl.media),whichprovidesthemicrobeswiththeappreciatenutrientstosustaingrowth;Somemicrobesmayrequirealiveorganism(animal,egg)astheinoculationmedium.第五十五頁，共七十五頁，2022年，8月28日第五十六頁，共七十五頁，2022年，8月28日2.1.2分離:從群體中分離出單個種類

SeparatedOneSpeciesFromAnotherTheendresultofinoculationandincubationisisolationofthemicrobesinmacroscopicform.Certainisolationtechniquesarebasedontheconceptthatifanindividualcellisseparatedfromothercellsandprovidedadequatespaceonanutrientsurface,itwillgrowintodiscretemoundsofcellscalledacolony（菌落）.第五十七頁，共七十五頁，2022年，8月28日第五十八頁，共七十五頁，2022年，8月28日第五十九頁，共七十五頁，2022年，8月28日第六十頁，共七十五頁，2022年，8月28日第六十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日第六十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日傾倒平板技術(shù)稀釋涂布平板法，可以用于樣品計數(shù)，其稀釋程度以最終每個平板上長出的菌落數(shù)約在30-300間為準(zhǔn)。第六十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日

觀察第六十四頁，共七十五頁，2022年，8月28日ThreetubescontainingpureculturesofE.coli(white),micrococcousluteus(yellow),andSerratiamactescens(red)AmixtureofM.luteusandE.colireadilydiffe