微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)講課

微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)講課第一頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日微生物的類群原生生物：原核生物:真菌:病毒:如酵母菌、霉菌單細(xì)胞的動(dòng)植物如草履蟲、單細(xì)胞藻類等微生物包含了除植物界和動(dòng)物界以外的所有生物無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞細(xì)菌、藍(lán)藻原核細(xì)胞微生物是一切肉眼看不見(jiàn)或看不清楚的微小生物的總稱。第二頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日SARS冠狀病毒、禽流感病毒病毒第三頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)菌的外形與大小細(xì)菌

A.球菌B.桿菌C.弧菌常見(jiàn)的細(xì)菌三種典型形態(tài)ABC第四頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)菌的結(jié)構(gòu)第五頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日放線菌第六頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日真菌第七頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日酵母菌酵母菌和霉菌青霉第八頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日課題1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)1.提供營(yíng)養(yǎng)和條件2.防止污染第九頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日一.培養(yǎng)基：微生物生存的環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)1.基本成分：概念：人們配制出供微生物生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。碳源、氮源、水、無(wú)機(jī)鹽⑴碳源無(wú)機(jī)碳源：有機(jī)碳源：CO2、CO32-、HCO3-牛肉膏、蛋白胨等自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物⑵氮源無(wú)機(jī)氮源：有機(jī)氮源：NH4＋、NO3-牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等注：含CHON的有機(jī)物是異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源第十頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日2.特殊營(yíng)養(yǎng)：維生素、氨基酸等（生長(zhǎng)因子）（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）3.pH、氧氣的需求：第十一頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日4.種類：按物理性質(zhì)分：液體培養(yǎng)基：固體培養(yǎng)基：半固體培養(yǎng)基：應(yīng)用微生物分離、鑒定、計(jì)數(shù)等按照培養(yǎng)基用途分選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基按照培養(yǎng)基的成分來(lái)分合成培養(yǎng)基、天然培養(yǎng)基主要用于工業(yè)生產(chǎn)觀察生物的運(yùn)動(dòng)和菌種保藏等微生物的分離微生物的鑒定第十二頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基第十三頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方H2O定容至1000mlNacl5g蛋白胨10g牛肉膏5g瓊脂20.0g分析營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成？第十四頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日二、無(wú)菌技術(shù)1.無(wú)菌技術(shù)

（1）對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的空間、操作者的衣著和手，進(jìn)行清潔和消毒。（2）將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進(jìn)行滅菌。（3）為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行。（4）實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。無(wú)菌技術(shù)，主要包括以下幾個(gè)方面：關(guān)鍵是防止雜菌污染第十五頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日第十六頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日消毒：指使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分的微生物（不包括芽孢和孢子）。2、消毒與滅菌

滅菌：使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子，而達(dá)到完全無(wú)菌的過(guò)程。提示：無(wú)菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。討論2：無(wú)菌技術(shù)除了用來(lái)防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來(lái)微生物污染外，還有什么目的？第十七頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日芽孢

有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形成一個(gè)橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對(duì)干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。例如，有的細(xì)菌的芽孢，煮沸3小時(shí)以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風(fēng)飄散。當(dāng)環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的時(shí)候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個(gè)細(xì)菌。

細(xì)菌、原生動(dòng)物、真菌和植物等產(chǎn)生的一種有繁殖或休眠作用的生殖細(xì)胞。能直接發(fā)育成新個(gè)體。孢子第十八頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日消毒的方法：1、煮沸消毒法：100℃煮沸5～6min2、巴氏消毒法：70～75℃下煮30min或80℃下煮15min

如牛奶3、用體積分?jǐn)?shù)為50%～70%酒精溶液等進(jìn)行皮膚消毒4、氯氣消毒水源5、紫外線消毒3.常用的消毒與滅菌的方法：是指用紫外線（能量）照射殺滅微生物的方法，紫外線不僅能使核酸、蛋白質(zhì)變性，而且能使空氣中氧氣產(chǎn)生微量臭氧，從而達(dá)到共同殺菌作用。第十九頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日1、灼燒滅菌2、干熱滅菌：160℃

-170℃下加熱1-2h。3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min。常用的滅菌方法外焰灼燒第二十頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日請(qǐng)你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請(qǐng)選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實(shí)驗(yàn)操作者的雙手思考第二十一頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方H2O定容至1000mlNacl5g蛋白胨10g牛肉膏5g瓊脂20.0g㈠制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基1.計(jì)算：培養(yǎng)基用量依配方計(jì)算各成分的用量2.稱量：3.溶化：牛肉膏黏稠，用稱量紙稱取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加蓋牛肉膏、稱量紙、少量水加熱溶解→取紙→蛋白胨、NaCl→瓊脂→補(bǔ)水定容

4.滅菌：5.倒平板：培養(yǎng)基（調(diào)pH、分裝、封口）、培養(yǎng)皿三.實(shí)驗(yàn)操作---大腸桿菌的純化培養(yǎng)第二十二頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日倒平板技術(shù)12342.右手拿錐形瓶，使瓶口迅速通過(guò)火焰。3.用左手的拇指和食指將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，右手將錐形瓶中的培養(yǎng)基(約10~20mL)倒入培養(yǎng)皿，左手立即蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋。1.將滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手撥出棉塞。4.等待平板冷卻凝固，大約需5~10min。然后，將平板倒過(guò)來(lái)放置，使皿蓋在下，皿底在上。第二十三頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日討論1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時(shí)，才能用來(lái)倒平板。你用什么辦法來(lái)估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過(guò)火焰？提示：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺(jué)錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可以進(jìn)行倒平板了。通過(guò)灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基第二十四頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.在倒平板的過(guò)程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來(lái)培養(yǎng)微生物嗎？為什么？

平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。

不要空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生第二十五頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日（二）純化大腸桿菌平板劃線法稀釋涂布平板法1、常用的微生物接種方法：第二十六頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日平板劃線法：是通過(guò)接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐漸分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可得到由一個(gè)微生物細(xì)胞繁殖而來(lái)的子細(xì)胞群，即菌落。第二十七頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日第二十八頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日

一旦劃破，會(huì)造成劃線不均勻，難以達(dá)到分離單菌落的目的；二是存留在劃破處的單個(gè)細(xì)胞無(wú)法形成規(guī)則的菌落，菌落會(huì)沿著劃破處生長(zhǎng)，會(huì)形成一個(gè)條狀的菌落。第二十九頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日第三十頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日問(wèn)題討論為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物殺死上次殘留的菌種，保證使下一次劃線時(shí)，菌種直接來(lái)源于上次劃線的末端，從而通過(guò)劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。第三十一頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日稀釋涂布平板法

是將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋，然后不同梯度的菌液分別涂布在瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)。第三十二頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日

1.將分別盛有9mL水的6支試管滅菌，并按101~106的順序編號(hào)。第三十三頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日2.用移液管吸取1mL培養(yǎng)的菌液，注入第二支試管中。用手指輕壓移液管上的橡皮頭，吹吸三次，使菌液與水充分混勻。第三十四頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日3.從101倍稀釋的試管中吸取1mL稀釋液，注入102倍稀釋的試管中，重復(fù)第2步的操作。依次類推，直到完成最后一支試管的稀釋。注意：移液管需要經(jīng)過(guò)滅菌。操作時(shí)，試管口和移液管離火焰1~2cm處.第三十五頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日第三十六頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日第三十七頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日第三十八頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日微生物的恒溫培養(yǎng)第三十九頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日2.培養(yǎng)：將接種后的培養(yǎng)基和一個(gè)未接種的培養(yǎng)基放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h后，觀察并記錄第四十頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日微生物的恒溫培養(yǎng)微生物的恒溫培養(yǎng)第四十一頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日微生物的恒溫培養(yǎng)第四十二頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日四、課題成果評(píng)價(jià)

（一）培養(yǎng)基的制作是否合格如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無(wú)菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。（二）接種操作是否符合無(wú)菌要求如果培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點(diǎn)，則說(shuō)明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說(shuō)明接種過(guò)程中，無(wú)菌操作還未達(dá)到要求，需要分析原因，再次練習(xí)。（三）是否進(jìn)行了及時(shí)細(xì)致的觀察與記錄培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會(huì)有明顯不同第四十三頁(yè)，共四十六頁(yè)，2022年，8月28日單個(gè)或