微生物檢驗第四章細(xì)菌耐藥檢驗

微生物檢驗第四章細(xì)菌耐藥檢驗第一頁，共三十五頁，2022年，8月28日1.葡萄球菌屬的天然耐藥對第一代喹諾酮類天然耐藥。腐生葡萄球菌對磷霉素天然耐藥。耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌對所有β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥。包括青霉素類、頭孢菌素類、含酶抑制劑的復(fù)合制劑、碳青霉烯類、氨曲南、頭霉素類。第二頁，共三十五頁，2022年，8月28日2.腸球菌的天然耐藥對一、二、三、四頭孢菌素、克林霉素、磺胺類、氨基糖苷類（高濃度除外）天然耐藥?？蛇x范圍：青霉素、氨芐西林、萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺、頭孢硫脒等。第三頁，共三十五頁，2022年，8月28日3.鏈球菌天然耐藥肺炎鏈球菌對第一代喹諾酮類藥物耐藥，并對諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星敏感性低。鏈球菌對氨基糖苷類天然耐藥或?qū)λ侥退帯?.李斯特菌天然耐藥對磺胺類、桿菌肽、多粘菌素、頭孢菌素類天然耐藥。第四頁，共三十五頁，2022年，8月28日細(xì)菌的常見耐藥機制細(xì)菌耐藥機制主要有四種：產(chǎn)生一種或多種水解酶、鈍化酶和修飾酶；抗生素作用的靶位改變，包括青霉素結(jié)合蛋白位點、DNA解旋酶、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的改變等；細(xì)菌膜的通透性下降，包括細(xì)菌生物被膜的形成和通道蛋白丟失；細(xì)菌主動外排系統(tǒng)的過度表達(dá)。在上述耐藥機制中，第一、二種耐藥機制具有專一性，第三、四種耐藥機制不具有專一性。第五頁，共三十五頁，2022年，8月28日β-內(nèi)酰胺酶

β內(nèi)酰胺酶是一類水解青霉素、頭孢菌素類抗生素的滅活酶；該酶位于革蘭陽性球菌菌體外，革蘭陰性桿菌間質(zhì)中；檢測方法有微生物培養(yǎng)法、碘－淀粉法、頭孢硝噻吩紙片法。其中頭孢硝噻吩紙片法因為簡單、方便、快速，應(yīng)用于臨床檢測。第六頁，共三十五頁，2022年，8月28日超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）ESBLs是指由質(zhì)粒介導(dǎo)的能水解青霉素類、頭孢菌素類和單環(huán)內(nèi)酰胺類氨曲南的一類酶；ESBLs不能水解頭霉素類和碳青霉烯類藥物，能被克拉維酸、舒巴坦和他唑巴坦等內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制；ESBLs主要見于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌，此外也見于腸桿菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬、沙雷菌屬等其他腸桿菌科細(xì)菌、不動桿菌、銅綠假單胞菌。第七頁，共三十五頁，2022年，8月28日超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）稀釋法，出現(xiàn)以下一種情況即可懷疑該菌株產(chǎn)生ESBL：頭孢他啶或頭孢噻肟或頭孢曲松或氨曲南MIC≥2mg/mL或頭孢泊肟MIC≥8mg/mL第八頁，共三十五頁，2022年，8月28日超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）紙片法，出現(xiàn)以下一種情況即可懷疑該菌株產(chǎn)生ESBL（篩選陽性）：頭孢泊肟≤17mm頭孢他啶≤22mm頭孢噻肟≤27mm頭孢曲松≤25mm氨曲南≤27mm第九頁，共三十五頁，2022年，8月28日超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）紙片法（表型確認(rèn)試驗）頭孢他啶和頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟和頭孢噻肟/克拉維酸。任一復(fù)方制劑的抑菌圈直徑與相應(yīng)單藥抑菌圈直徑相差≥5mm時，即可判斷該菌產(chǎn)ESBL。第十頁，共三十五頁，2022年，8月28日超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）稀釋法（表型確認(rèn)試驗）頭孢他啶和頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟和頭孢噻肟/克拉維酸。任何一組酶抑制劑復(fù)方制劑的MIC值比相應(yīng)單藥的MIC降低3個稀釋度者即可判定該菌為產(chǎn)ESBL菌株。

第十一頁，共三十五頁，2022年，8月28日AmpC酶的特征AmpC酶是在革蘭陰性菌中發(fā)現(xiàn)的由染色體或質(zhì)粒介導(dǎo)的水解頭孢菌素的Ⅰ型β內(nèi)酰胺酶，可分為誘導(dǎo)酶和非誘導(dǎo)酶。與ESBLs不同的是，AmpC酶對三代頭孢菌素耐藥但對四代頭孢菌素敏感且不被酶抑制劑克拉維酸所抑制，但其酶活性可被氯唑西林和硼酸抑制。第十二頁，共三十五頁，2022年，8月28日AmpC酶的檢測方法頭孢西丁三維試驗是檢測AmpC酶的經(jīng)典方法；除此之外，還有以硼酸化合物為抑制劑檢測肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌的AmpC酶、AmpCDisk、頭孢西丁瓊脂基礎(chǔ)法等。第十三頁，共三十五頁，2022年，8月28日碳青霉烯酶碳青霉烯酶可以定義為具有水解碳青霉烯類抗生素活性的β-內(nèi)酰胺酶，主要分布于β-內(nèi)酰胺酶A、B、D類中。根據(jù)水解機制中作用位點的不同可以將碳青霉烯酶分為兩大類：一類稱為金屬碳青霉烯酶，這類酶以金屬鋅離子為活性作用位點，可以被EDTA抑制，屬于B類β-內(nèi)酰胺酶；另一類以絲氨酸（Ser）為酶的活性作用位點，可以被酶抑制劑克拉維酸和他唑巴坦所抑制，屬于A、D類β-內(nèi)酰胺酶。第十四頁，共三十五頁，2022年，8月28日

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）攜帶SCCmec基因盒。SCCmec基因盒中的MecA基因編碼修飾的青霉素結(jié)合蛋白PBP2a，這種蛋白對甲氧西林和其他的β-內(nèi)酰胺類抗生素親和力下降，從而導(dǎo)致對這些抗生素的耐藥。

SCCmec主要由mec復(fù)合物和ccr復(fù)合物兩部分組成。根據(jù)不同mec復(fù)合物和ccr復(fù)合物的組合，可以將SCCmec分成不同的型別，目前已發(fā)現(xiàn)8種SCCmec型。耐甲氧西林葡萄球菌第十五頁，共三十五頁，2022年，8月28日耐甲氧西林葡萄球菌的檢測MRSA的檢測方法有頭孢西丁紙片擴散法、苯唑西林瓊脂稀釋法、乳膠凝膠試驗檢測PBP2a、mecA基因測定及MRSA顯色培養(yǎng)基。頭孢西丁紙片法、苯唑西林瓊脂稀釋法是目前檢測耐甲氧西林葡萄球菌最常用篩選方法。對于金黃色葡萄球菌，MRSA的檢測可以使用苯唑西林紙片，但對于凝固酶陰性葡萄球菌則不能使用苯唑西林紙片。

第十六頁，共三十五頁，2022年，8月28日甲氧西林耐藥的葡萄球菌（MRS）MRS檢測藥物紙片法稀釋法金黃色葡萄球菌1mg苯唑西林√√路鄧葡萄球菌1mg苯唑西林×√金黃色葡萄球菌和路鄧葡萄球菌30mg頭孢西丁√√除路鄧以外的凝固酶陰性葡萄球菌1mg苯唑西林×√30mg頭孢西丁√×第十七頁，共三十五頁，2022年，8月28日凝固酶陰性葡萄球菌中苯唑西林MIC結(jié)果的報告策略*苯唑西林MIC(μg/ml)進(jìn)行mecA或PBP2a或頭孢西丁紙片擴散≤0.25≥4.00.5-2.0報告苯唑西林敏感報告苯唑西林耐藥陰性陽性報告苯唑西林敏感報告苯唑西林耐藥*檢測無菌部位感染的非表皮葡萄球菌菌株第十八頁，共三十五頁，2022年，8月28日克林霉素誘導(dǎo)耐藥葡萄球菌紅霉素*耐藥的金葡菌或凝固酶陰性葡萄球菌可對克林霉素結(jié)構(gòu)性或誘導(dǎo)性耐藥或僅對紅霉素耐藥。

*或其他大環(huán)內(nèi)酯類第十九頁，共三十五頁，2022年，8月28日機制耐藥基因紅霉素克林霉素核糖體修飾-藥物不能結(jié)合于靶位ermRS*RR結(jié)構(gòu)性泵-藥物被泵出msrARSerm =erythromycinribosomemethylasemsrA =macrolidestreptograminresistance*需要誘導(dǎo)來顯示耐藥性

紅霉素/克林霉素耐藥葡萄球菌耐藥機制第二十頁，共三十五頁，2022年，8月28日誘導(dǎo)性克林霉素耐藥（erm介導(dǎo)）葡萄球菌-“D試驗”患者不會對克林霉素有反應(yīng)-報告克林霉素耐藥無克林霉素誘導(dǎo)（msrA介導(dǎo)）真的克林霉素敏感-報告克林霉素敏感“D”陽性陰性15～26mm第二十一頁，共三十五頁，2022年，8月28日葡萄球菌誘導(dǎo)性克林霉素耐藥的MIC檢測方法4.0 μg/ml紅霉素0.5 μg/ml克林霉素Nogrowth=無誘導(dǎo)性克林霉素耐藥生長=誘導(dǎo)性克林霉素耐藥第二十二頁，共三十五頁，2022年，8月28日對于紅霉素耐藥，克林霉素敏感的葡萄球菌，需檢測誘導(dǎo)性克林霉素耐藥注意試驗適用于金葡菌和凝固酶陰性葡萄球菌(苯唑西林敏感和耐藥株)；對于CoNS，該試驗不必常規(guī)開展因為克林霉素很少用于治療凝固酶陰性葡萄球菌；大多數(shù)醫(yī)院相關(guān)MRSA是克林霉素耐藥的；大多數(shù)社區(qū)相關(guān)MRSA是克林霉素敏感的(msrA基因型)；克林霉素可以口服給藥。第二十三頁，共三十五頁，2022年，8月28日萬古霉素中介耐藥的金黃色葡萄球菌（VISA）耐藥是由于：增厚的細(xì)胞壁檢測困難；表型不穩(wěn)定菌落形態(tài)不典型金葡菌萬古霉素敏感萬古霉素中介細(xì)胞壁第二十四頁，共三十五頁，2022年，8月28日當(dāng)有以下一個或多個情況時菌株可疑為VISA-內(nèi)酰胺類藥物的MIC降低達(dá)托霉素MIC升高菌落形態(tài)不典型（一些為微小菌落）肉湯中生長遲緩（如血培養(yǎng)）凝固酶反應(yīng)微弱/延遲經(jīng)過幾次次代培養(yǎng)后：菌落回復(fù)為典型形態(tài)萬古霉素MIC降低并且菌株變?yōu)槿f古霉素敏感第二十五頁，共三十五頁，2022年，8月28日萬古霉素耐藥的金黃色葡萄球菌（VRSA）耐藥是由于從萬古霉素耐藥腸球菌（VRE）中獲得vanA基因美國報道例數(shù)9個患者檢測大多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)方法均可檢測菌落形態(tài)典型金葡菌第二十六頁，共三十五頁，2022年，8月28日紙片擴散法折點

葡萄球菌-萬古霉素CLSI文件Susceptible敏感Intermediate中介Resistant耐藥M100-S18200815--New!新M100-S192009*---CLSIM100-S19.Table2C.對于金黃色葡萄球菌*假如抑菌圈≥7mm，用MIC法檢測萬古霉素（若有需要）萬古霉素紙片擴散法僅在檢測攜帶van-A金葡菌（VRSA）時可信；需確證沒有抑菌圈(≤6mm)

紙片擴散法不能鑒別VSSA和VISA紙片擴散法不能檢測凝固酶陰性葡萄球菌第二十七頁，共三十五頁，2022年，8月28日腸球菌高水平氨基糖苷類耐藥篩查紙片擴散法120μg慶大霉素;300μg鏈霉素

10mm=無高水平氨基糖苷類耐藥MIC篩查慶大霉素:500μg/ml鏈霉素:1000μg/ml(肉湯) 2000μg/ml(瓊脂)第二十八頁，共三十五頁，2022年，8月28日腸球菌氨基糖苷類修飾酶

鏈霉素慶大霉素妥布霉素阿米卡星/丁胺卡那6-AAD +-- -3’APH ---+2”APH/6’AAC - + + +6’AAC* - - + +

*在所有屎腸球菌中均發(fā)現(xiàn)

+=酶可以修飾藥物；藥物無協(xié)同性-=酶不能修飾藥物；藥物有協(xié)同性第二十九頁，共三十五頁，2022年，8月28日萬古霉素耐藥腸球菌（VRE）表型VRE－屎腸球菌中居多vanA

-高水平耐藥(MIC256μg/ml)vanB

-中等水平耐藥(MIC16-256μg/ml)低水平萬古霉素耐藥vanC-(MIC2-16μg/ml)vanC天然存在于鶉雞腸球菌和鉛黃腸球菌菌株不引起院內(nèi)爆發(fā)，vanC基因不易于傳播紙片擴散法實驗可能檢測不出第三十頁，共三十五頁，2022年，8月28日快速MGP實驗，孵育3-5小時；甲基化-a-D-葡糖苷酸化＝黃色陽性陰性鉛黃腸球菌的黃色色素VRE第三十一頁，共三十五頁，2022年，8月28日肺炎鏈球菌新的青霉素折點(μg/ml)敏感中介耐藥青霉素注射(非腦膜炎)≤248青霉素注射(腦膜炎)≤0.06-0.12青霉素(口服青霉素V)≤0.060.12-12CLSIM100-S19.Table2G.第三十二頁，共三十五頁，2022年，8月28日紙片藥物含量抑菌圈(mm)MIC(μg/ml)等效的MICRISRS青霉素1μg苯唑西林--20-≤0.06CLSIM100-S19.Table2G.肺炎鏈球菌

紙片擴散法-使用苯唑西林紙片作為青霉素敏感性的替代紙片第三十三頁，共三十五頁，2022年，8月28日20mm-報告“敏感