培養(yǎng)基滅菌空氣滅菌

第一節(jié)培養(yǎng)基滅菌滅菌的概念滅菌的方法濕熱滅菌的原理分批滅菌設(shè)計(jì)連續(xù)滅菌設(shè)計(jì)微生物的熱死動(dòng)力學(xué)第一頁，共七十一頁。滅菌的概念消毒（disinfection）與滅菌（sterilization）的區(qū)別？殺滅所有微生物殺滅病源微生物第二頁，共七十一頁。滅菌的概念消毒是指用物理或化學(xué)方法殺死物料、容器、器具內(nèi)外的病原微生物。一般只能殺死營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞而不能殺死細(xì)菌芽孢。例如，巴氏消毒法，是將物料加熱至60℃維持30min，以殺死不耐高溫的微生物營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞。滅菌是用物理或化學(xué)方法殺死或除去環(huán)境中所有微生物，包括營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌芽孢和孢子。消毒不一定能達(dá)到滅菌要求，而滅菌則可達(dá)到消毒的目的。第三頁，共七十一頁。高溫瞬間巴氏消毒法的操作流程圖法國(guó)微生物學(xué)家、化學(xué)家、近代微生物學(xué)的奠基人。第四頁，共七十一頁。滅菌的概念防腐就是利用某種理化因素完全抑制霉腐微生物的生長(zhǎng)繁殖，從而達(dá)到防止食品等發(fā)生霉腐的措施。（1）低溫（4）高滲（2）缺氧（5）高酸度（3）干燥（6）防腐劑防腐（antisepsis）第五頁，共七十一頁。滅菌的方法化學(xué)藥物滅菌射線滅菌空氣的過濾除菌加熱滅菌第六頁，共七十一頁?；瘜W(xué)滅菌法甲醛、乙醇或新潔爾滅、高錳酸鉀等適用范圍：環(huán)境、皮膚及器械的表面消毒第七頁，共七十一頁。射線滅菌電磁波、紫外線或放射性物質(zhì)適用范圍：無菌室、接種箱微波輻射滅菌紫外線波長(zhǎng)200-300nm的紫外線具有殺菌作用。作用于DNA，使一條DNA鏈上相鄰的兩個(gè)胸腺嘧啶共價(jià)結(jié)合形成二聚體，導(dǎo)致細(xì)菌變異和死亡。電離輻射高速電子、X射線、γ射線微波波長(zhǎng)1mm~1m第八頁，共七十一頁。過濾除菌法利用過濾方法阻留微生物適用范圍：制備無菌空氣第九頁，共七十一頁。固定濾膜裝置第十頁，共七十一頁。加熱滅菌法濕熱滅菌法(高壓蒸汽)

利用飽和蒸汽滅菌，條件：121℃，30min

適用范圍：生產(chǎn)設(shè)備及培養(yǎng)基滅菌干熱滅菌法常用烘箱，滅菌條件：160℃下保溫1h

適用范圍：金屬或玻璃器皿火焰滅菌法火焰適用范圍：接種針、玻璃棒、三角瓶口

第十一頁，共七十一頁。濕熱滅菌

濕熱滅菌原理：蒸汽具有很強(qiáng)的穿透能力，在冷凝時(shí)會(huì)放出大量的冷凝熱，很容易使蛋白質(zhì)凝固而殺死各種微生物。

滅菌條件：121℃，30min滅菌不利方面：同時(shí)會(huì)破壞培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分，甚至產(chǎn)生不利于菌體生長(zhǎng)的物質(zhì)。第十二頁，共七十一頁。關(guān)于滅菌和消毒的不正確的理解是（）A．滅菌是指殺滅環(huán)境中的一切微生物的細(xì)胞、芽孢和孢子B．消毒和滅菌實(shí)質(zhì)上是相同的C．接種環(huán)用灼燒法滅菌D．常用滅菌的方法有加熱法、過濾法、紫外線法、化學(xué)藥品法第十三頁，共七十一頁。谷氨酸棒狀桿菌的培養(yǎng)液常采用的滅菌方法是（）A．高壓蒸汽滅菌B．高溫滅菌C．加入抗生素滅菌D．酒精滅菌第十四頁，共七十一頁。分批滅菌（間歇滅菌）將配制好的培養(yǎng)基同時(shí)放在發(fā)酵罐或其他裝置中，通入蒸汽將培養(yǎng)基和所用設(shè)備一起進(jìn)行加熱滅菌的過程，也稱實(shí)罐滅菌。過程包括：升溫、保溫和冷卻三階段。各階段對(duì)滅菌的貢獻(xiàn)：20%、75%、5%。第十五頁，共七十一頁。連續(xù)滅菌將培養(yǎng)基在發(fā)酵罐外通過連續(xù)滅菌裝置進(jìn)行加熱、保溫和冷卻而進(jìn)行滅菌。問題連續(xù)滅菌的基本設(shè)備有哪些？發(fā)酵罐蒸汽蒸汽冷卻水無菌培養(yǎng)基配料罐泵連消塔維持罐冷卻管第十六頁，共七十一頁。連續(xù)滅菌（1）配料預(yù)熱罐，將配制好的料液預(yù)熱到6070℃，以免連續(xù)滅菌時(shí)由于料液與蒸汽溫度相差過大而產(chǎn)生水汽撞擊聲；（2）連消塔，用高溫蒸汽使料液溫度很快升高到滅菌溫度（126132℃）；發(fā)酵罐蒸汽蒸汽冷卻水無菌培養(yǎng)基配料罐泵連消塔維持罐冷卻管第十七頁，共七十一頁。連續(xù)滅菌（3）維持罐，使料液在滅菌溫度下保持57min。因?yàn)椋哼B消塔加熱的時(shí)間很短，光靠這段時(shí)間的滅菌是不夠的；（4）冷卻管，使料液冷卻到4050℃后（冷水噴淋），輸送到預(yù)先滅菌過的罐內(nèi)。

發(fā)酵罐蒸汽蒸汽冷卻水無菌培養(yǎng)基配料罐泵連消塔維持罐冷卻管第十八頁，共七十一頁。連續(xù)滅菌第十九頁，共七十一頁。連續(xù)滅菌第二十頁，共七十一頁。連續(xù)滅菌連續(xù)滅菌過程中溫度的變化(虛線)第二十一頁，共七十一頁。間歇滅菌與連續(xù)滅菌的比較第二十二頁，共七十一頁。微生物的熱死動(dòng)力學(xué)微生物受熱死亡的主要原因是高熱能使蛋白質(zhì)變性，這種反應(yīng)可認(rèn)為是單分子反應(yīng)，死亡速率可視為一級(jí)反應(yīng)，即與殘存的微生物數(shù)量成正比。第二十三頁，共七十一頁。微生物的熱死動(dòng)力學(xué)式中N－經(jīng)時(shí)間t后殘存的活菌濃度（個(gè)/L)，N0—開始滅菌時(shí)原有活菌濃度（個(gè)/L)；t－滅菌時(shí)間（s,min）K－比熱死速率常數(shù)、滅菌速率常數(shù)或比死亡速率常數(shù)（s-1,min-1）它的大小與微生物的種類和加熱溫度有關(guān)。在同等溫度下，其值小，微生物的耐熱性強(qiáng)。從上式得出：t與N之間的關(guān)系為對(duì)數(shù)式中N/N0,菌體存活率，而N0/N，為滅菌度。第二十四頁，共七十一頁。微生物的熱死動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，細(xì)菌孢子的熱死滅動(dòng)力學(xué)與營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞顯著不同。對(duì)于耐熱性的微生物芽孢，存在“菌體循序死亡模型”假說，認(rèn)為：芽孢的死亡是漸進(jìn)的。有耐熱的芽孢（R型）轉(zhuǎn)變?yōu)樗劳龅难挎撸―型），需經(jīng)過敏感的中間過程（S型）。當(dāng)溫度超過120℃時(shí)，熱阻極強(qiáng)的芽孢與營(yíng)養(yǎng)體的熱死滅動(dòng)力學(xué)基本符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)規(guī)律。第二十五頁，共七十一頁。微生物的熱死動(dòng)力學(xué)

T對(duì)K的影響式中：A——頻率因子，7.94×1038，min-1ΔE——活化能，J/molR——通用氣體常數(shù)，8.28J/（mol·K）在相同條件下，ΔE越高，K值越低，熱死速率越慢。不同菌的孢子的熱死滅反應(yīng)ΔE各不相同，且K值取決于ΔE和T。對(duì)上式取對(duì)數(shù)，得第二十六頁，共七十一頁。微生物的熱死動(dòng)力學(xué)K是ΔE和T的函數(shù)反應(yīng)的ΔE越高，lnK對(duì)T的變化率越高，即T的變化對(duì)K的影響越大。迅速提高滅菌溫度，可加快細(xì)菌孢子的死滅速度，縮短在高溫下的滅菌時(shí)間，而滅菌對(duì)于培養(yǎng)基中有效成分的破壞大為減少。高溫短時(shí)間滅菌——滅菌動(dòng)力學(xué)得出的最重要結(jié)論第二十七頁，共七十一頁。例1：當(dāng)殺菌溫度從120℃升至150℃，試計(jì)算維生素B1的分解速率常數(shù)KB和嗜熱脂肪芽孢桿菌的死亡速率常數(shù)KS。已知⊿ES=283460J/mol,As=1.06×1036(min-1)；⊿EB=92114J/mol,AB=1.06×1010(min-1)

解：由（1）式，即㏑K=㏑A－(⊿E/RT)得

lnKs=lnAs－⊿ES/(RT)

∴Ks在120℃時(shí)為0.0156(min-1)

150℃時(shí)為7.54(min-1)滅菌速率常數(shù)提高482倍。

同樣地：KB在120℃時(shí)為0.00535(min-1)，150℃時(shí)為0.040(min-1)，同樣的溫度變化僅提高6.5倍。

第二十八頁，共七十一頁。例2：將10000千克的培養(yǎng)基在發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行分批滅菌，滅菌溫度為120℃，滅菌后要求每1000批中只有一個(gè)雜菌，培養(yǎng)基原始污染度為105個(gè)/g，試計(jì)算總殺菌效率V總。解：N=10-3

即，V總=34.5第二十九頁，共七十一頁。例3：發(fā)酵培養(yǎng)基60m3，雜菌活孢子濃度105/mL，要求滅菌后殘存孢子數(shù)N為10-3個(gè)。設(shè)計(jì)的T-t過程如下，是否達(dá)到滅菌要求？（A=7.94×1038min-1，△E=287441J/mol，R=8.28J/(mol·K)）解：由可得各個(gè)K值根據(jù)題意，滅菌要求即為，第三十頁，共七十一頁。從得出的K值可以看出，在100℃以下滅菌，對(duì)細(xì)菌孢子的殺滅幾乎是無效的，因?yàn)閺臏缇_始的前36min和63min以后，K值幾乎可以忽略不計(jì)。在整個(gè)滅菌過程只有30min是有效的。第三十一頁，共七十一頁。---K-t圖，---T-t圖第三十二頁，共七十一頁。將有效滅菌時(shí)間，即34min至64min的圖解積分值為33.8---K-t圖，---T-t圖由圖可得，T-t的關(guān)系為，T=-2.5357t2因此，T-t的趨勢(shì)線故，設(shè)計(jì)的T-t過程不能達(dá)到滅菌要求。第三十三頁，共七十一頁。1.殺滅芽胞最常用和最有效的方法是：____________。

a.紫外線照射b.煮沸5minc.巴氏消毒法

d.高壓蒸氣滅菌法

2.下述不可能殺滅細(xì)菌芽胞的方法是：____________。

a.煮沸法b.巴氏消毒法c.間歇滅菌法d.干熱滅菌法

e.高壓蒸氣滅菌法

3.常用于空氣或物體表面的消毒____________。

a.高壓蒸氣滅菌法b.紫外線照射法

c.濾過除菌法d.巴氏消毒法

4.常用于基礎(chǔ)培養(yǎng)基滅菌____________。

a.高壓蒸氣滅菌法b.紫外線照射法c.濾過除菌法

d.巴氏消毒法

第三十四頁，共七十一頁。第二節(jié)空氣除菌空氣除菌的引入空氣中的微生物空氣除菌方法空氣過濾設(shè)計(jì)膜過濾器空氣除菌典型流程第三十五頁，共七十一頁?？諝獬囊胛⑸锇l(fā)酵分好氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵兩類。無菌空氣是好氧微生物的氧源?？諝膺^濾失敗占發(fā)酵染菌各種因素的20%左右。空氣過濾器的作用是防止空氣把雜菌帶入發(fā)酵過程，保證發(fā)酵從接種到放罐的整個(gè)過程為純種培養(yǎng)，不受外源微生物的污染。第三十六頁，共七十一頁。空氣除菌的引入在普通城市郊區(qū)，在干燥、晴朗的天氣條件下，空氣中微生物數(shù)目為102~104個(gè)/m3；好氧發(fā)酵的平均通氣量為0.8vvm（每分鐘每體積發(fā)酵液需要空氣體積）；次級(jí)代謝產(chǎn)品的發(fā)酵需要200h；一個(gè)100m3的發(fā)酵罐；在整個(gè)發(fā)酵過程中所需通入空氣中的微生物的量為1億~100億個(gè)。第三十七頁，共七十一頁?？諝庵械奈⑸锟諝庵袘腋≈罅康奈⑸铮鼈兏街诳諝庵械幕覊m及顆?；蛩樯稀＿@些微生物包括霉菌、細(xì)菌、放線菌、酵母及噬菌體等。城市空氣中微生物的密度較高，農(nóng)村和山區(qū)較低，夏季比冬季多，氣候溫和潮濕的地區(qū)，空氣中微生物比較多，工廠附近以主風(fēng)向上游密度較低。高度每升高2.5m，空氣中的塵埃粒子含量下降一個(gè)數(shù)量級(jí)，因此高空取氣很重要。第三十八頁，共七十一頁。空氣除菌方法無菌空氣是指自然界的空氣通過除菌處理使其含量降低到一個(gè)極限百分?jǐn)?shù)的凈化空氣。獲取方法利用加熱、化學(xué)藥劑或射線：蛋白質(zhì)變性利用過濾介質(zhì)及靜電除塵捕集空氣中的灰塵及顆粒第三十九頁，共七十一頁?？諝獬椒訜釡缇恚何⑸镌诟邷叵氯菀妆粴⑺溃焕每諝獗粔嚎s時(shí)產(chǎn)生的熱來滅菌。特點(diǎn)：空氣傳熱效率低，溫度分布不均勻，滅菌時(shí)間長(zhǎng)；不適合大量制造無菌空氣。第四十頁，共七十一頁?？諝獬椒ㄝ椛錅缇恚翰ㄩL(zhǎng)在226.5~328.7nm的紫外線對(duì)空氣中微生物的殺菌效力最強(qiáng)。聲波、高能陰極射線及γ射線都可用于空氣滅菌。特點(diǎn)：滅菌時(shí)間長(zhǎng)；大規(guī)模應(yīng)用不經(jīng)濟(jì)；該法用于無菌室、接種間。第四十一頁，共七十一頁?？諝獬椒ɑ瘜W(xué)滅菌常用的空氣滅菌用化學(xué)藥劑有苯酚、環(huán)氧乙烷、過氧化氫、重金屬鹽、新潔爾滅、甲醛溶液和硫磺等。原理：將殺菌劑溶于水配成合適的濃度，使空氣在殺菌劑溶劑中通過或噴灑于空氣中以殺死空氣中的微生物。特點(diǎn)：除菌結(jié)束后必須除去夾帶殺菌劑的水汽和霧。應(yīng)用于無菌室、接種間和培養(yǎng)間的滅菌。第四十二頁，共七十一頁?？諝獬椒o電除塵原理：使空氣中的灰塵成為載電體，然后將其捕集在電極上。熱點(diǎn)：能量消耗少設(shè)備龐大空氣最好為無油，濕度低第四十三頁，共七十一頁?？諝獬椒ń橘|(zhì)過濾發(fā)酵工業(yè)用于發(fā)酵罐制備無菌空氣的方法是介質(zhì)過濾。使用的過濾介質(zhì)有棉花、玻璃纖維、不銹鋼纖維、聚丙烯纖維。目前在發(fā)酵工業(yè)上普遍采用的是膜過濾器。第四十四頁，共七十一頁?？諝膺^濾設(shè)計(jì)采用概率論進(jìn)行分析空氣過濾，基本假設(shè)有三點(diǎn)：纖維填充的空氣過濾器由多層介質(zhì)組成；微生物經(jīng)過每一層玻璃纖維時(shí)，與玻璃纖維碰撞存在一定概率；當(dāng)微生物與纖維碰撞次數(shù)小于一定值時(shí)，仍能通過過濾器中流出而返回空氣中。濾層厚度越大，空氣通過過濾介質(zhì)的時(shí)間越長(zhǎng)，捕集效率也就越大；纖維直徑越小，捕集效率也越大。捕集效率第四十五頁，共七十一頁?？諝膺^濾設(shè)計(jì)空氣過濾器除菌機(jī)制直接截留慣性沖擊布朗運(yùn)動(dòng)或擴(kuò)散攔截重力沉降靜電吸引第四十六頁，共七十一頁?？諝膺^濾設(shè)計(jì)空氣過濾器除菌機(jī)制直接截留空氣流線中所夾帶的微粒由于和纖維相接觸而被捕集時(shí)稱為直接截留。過濾介質(zhì)起篩網(wǎng)的作用機(jī)械截留顆粒。直接截留的截留效率完全決定于顆粒直徑。第四十七頁，共七十一頁。空氣過濾設(shè)計(jì)空氣過濾器除菌機(jī)制2.

慣性沖擊顆粒以一定速度向纖維垂直運(yùn)動(dòng)時(shí)，空氣受阻改變流向，繞過纖維前進(jìn)，微粒因慣性作用不能及時(shí)改變方向，便沖向纖維表面并滯留下來。在較低流速范圍內(nèi)，沖擊過濾效率隨氣流速度增加而降低；增至臨界流速時(shí)，效率隨氣流速度增加而提高；當(dāng)氣流速度再上升，效率會(huì)顯著下降。第四十八頁，共七十一頁?？諝膺^濾設(shè)計(jì)空氣過濾器除菌機(jī)制3.

布朗運(yùn)動(dòng)或擴(kuò)散攔截微小的顆粒受空氣分子碰撞發(fā)生布朗運(yùn)動(dòng)。顆粒與介質(zhì)相碰而被捕集成為擴(kuò)散。纖維直徑越小，氣流運(yùn)動(dòng)速度越小，擴(kuò)散捕集效率越高。第四十九頁，共七十一頁?？諝膺^濾設(shè)計(jì)對(duì)數(shù)穿透定律設(shè)N1為過濾前空氣中的總顆粒數(shù)，N2為過濾后空氣中的顆粒數(shù)，則穿透率為：則除菌效率為：對(duì)數(shù)穿透定律假定空氣過濾時(shí)其中的顆粒數(shù)隨通過濾層厚度的增加而均勻遞減。第五十頁，共七十一頁?？諝膺^濾設(shè)計(jì)對(duì)數(shù)穿透定律取濾層厚度中某一微長(zhǎng)度dL，在此長(zhǎng)度中顆粒的減少數(shù)dN可表示為：式中：N——空氣中的顆粒數(shù)，個(gè)L——濾層厚度，cm

K’——除菌常數(shù)，m-1第五十一頁，共七十一頁?？諝膺^濾設(shè)計(jì)對(duì)數(shù)穿透定律積分：得出對(duì)數(shù)穿透率為：或K值的大小與空氣流速、纖維的填充密度和直徑、空氣中的顆粒大小等因素有關(guān)，可通過計(jì)算求得。第五十二頁，共七十一頁?？諝膺^濾設(shè)計(jì)對(duì)數(shù)穿透定律η為90%時(shí)的過濾厚度作為基準(zhǔn)，即即代入得第五十三頁，共七十一頁?？諝膺^濾設(shè)計(jì)對(duì)數(shù)穿透定律即或常數(shù)K為過濾效率為90%時(shí)得到的L90的數(shù)據(jù)，即第五十四頁，共七十一頁。膜過濾器發(fā)酵工業(yè)初期采用棉花作為介質(zhì)逐漸被玻璃纖維、不銹鋼纖維和聚丙烯纖維代替目前都被膜過濾器取代預(yù)過濾器和可蒸汽滅菌的無菌過濾器第五十五頁，共七十一頁。膜過濾器預(yù)過濾器作用：除去空氣中的顆粒和塵埃以及液珠。分類：除去顆粒的預(yù)過濾器、除去液體霧滴的預(yù)過濾器。安裝位置：在可滅菌過濾器的上游第五十六頁，共七十一頁。膜過濾器可滅菌的無菌膜過濾器膜片由多孔的疏水有機(jī)材料制成，最常用的是聚偏氟乙烯和聚四氟乙烯。無菌膜過濾器主要指膜孔為0.22um以下的膜過濾器。第五十七頁，共七十一頁?？諝獬湫土鞒炭諝饪諌簷C(jī)貯氣罐冷卻除油水加熱空氣預(yù)處理總過濾器分過濾器無菌空氣

空氣過濾第五十八頁，共七十一頁?？諝獬湫土鞒炭諝忸A(yù)處理目的:提高壓縮前空氣的潔凈度（1）提高空氣吸氣口的位置；（2）在空氣入口處設(shè)置粗過濾器——捕集較大的灰塵顆粒，并保護(hù)空壓機(jī)。去除壓縮后空氣中的油和水第五十九頁，共七十一頁?？諝獬湫土鞒炭諝忸A(yù)處理第六十頁，共七十一頁。空氣除菌典型流程空氣壓縮和壓縮空氣的冷卻（1）空氣壓縮：克服輸送過程中過濾介質(zhì)的阻力并維持一定的氣流速度。（2）壓縮后空氣溫度顯著上升，需冷卻。壓縮后的高溫空氣能引起過濾介質(zhì)的炭化或燃燒增大發(fā)酵罐的降溫負(fù)荷增加培養(yǎng)液水分的蒸發(fā)，一般用列管式冷卻器冷卻。第六十一頁，共七十一頁?？諝獬湫土鞒炭諝鈮嚎s和壓縮空氣的冷卻第六十二頁，共七十一頁。空氣除菌典型流程空氣貯罐消除壓縮機(jī)排出空氣量的脈沖，維持穩(wěn)定的空氣壓力。利用重力沉降作用除去部分油霧。緊接空壓機(jī)安裝。有些裝有冷卻管。第六十三頁，共七十一頁。空氣除菌典型流程壓縮空氣的除油除水冷卻降溫后的空氣濕度增大，會(huì)使過濾介質(zhì)受潮失效。兩類設(shè)備旋風(fēng)分離器——利用離心力進(jìn)行沉降，對(duì)于10m以上的微粒分離效率較高。絲網(wǎng)分離器——利用慣性進(jìn)行攔截，分離效率較高，能除去2～5m的細(xì)小顆粒。第六十四頁，共七十一頁。空氣除菌典型流程壓縮空氣的除油除水第六十五頁，共七十一頁?？諝獬湫土鞒虊嚎s空氣的除油除水采用慣性攔截等機(jī)理，有效去除空氣中的水、油霧、塵埃，不銹鋼絲網(wǎng)可清洗，使用壽命長(zhǎng)。第六十六頁，共