資源植物玉葉金花果實(shí)多糖的提取工藝研究

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材料和方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)材料玉葉金花果實(shí)采自黃山市屯溪區(qū)黃山學(xué)院南校區(qū)，由黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院張慧沖副教授鑒定。

1.1.2試劑及儀器設(shè)備95%乙醇、無水乙醇、無水乙醚、三氯甲烷、正丁醇、葡萄糖、濃硫酸、蒽酮、氫氧化鈉、鹽酸等，均為國產(chǎn)分析純。

HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠），TDL-5臺(tái)式低速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申勝生物技術(shù)有限公司），SHZ-IIID循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠），BCD-171D容聲電冰箱（廣東科龍電器股份有限公司），YP3001N電子天平（上海細(xì)致科學(xué)儀器有限公司），PL203電子細(xì)致天平（梅特勒-托利儀器上海有限公司），DGX-9073B-2電熱鼓風(fēng)枯燥箱（上海福瑪測驗(yàn)設(shè)備有限公司），UV754紫外可見分光光度計(jì)（上海細(xì)致科學(xué)儀器有限公司）。

1.2方法

1.2.1玉葉金花果實(shí)中粗多糖的提取玉葉金花干果實(shí)磨粉，過0.04mm篩備用。切實(shí)稱取10.0g玉葉金花干果實(shí)粉末，用蒸餾水浸提后用2層紗布過濾，離心取上清液，重復(fù)浸提2次，合并濾液；減壓濃縮至20mL，然后參與確定量的95%乙醇舉行醇析沉淀，4℃靜置24h，4000r·min-1離心10min收集沉淀；用20mL無水乙醇洗沉淀，靜置30min后，離心棄上清液，重復(fù)洗2次，4000r·min-1離心10min收集沉淀，烘干稱質(zhì)量，即為粗多糖的含量[8-11]。

1.2.2玉葉金花果實(shí)中粗多糖的精制取醇析后得到的多糖沉淀物脫脂：用無水乙醇洗沉淀2次，再用無水乙醚洗3次。取20mL蒸餾水溶解脫脂后的粗多糖，參與20mLSevage試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1），振蕩15min，3000r·min-1離心10min，吸取上清液重復(fù)屢屢去游離蛋白，至分開液面交界處無白色混合物，加95%乙醇醇析上清液，4℃靜置24h，4000r·min-1離心10min收集沉淀，50℃烘干至恒質(zhì)量后，稱量精多糖含量[8-11]。

1.2.3蒽酮-硫酸比色法測定玉葉金花果實(shí)中精多糖含量（1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。切實(shí)稱取枯燥恒質(zhì)量的無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品100.00mg，參與蒸餾水將其溶解，定容在100mL的容量瓶中，配成1.00mg·mL-1的葡糖糖對照品溶液；分別切實(shí)移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，

3.0，3.5mL，用蒸餾水定容至25mL，搖勻得系列0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12，0.14mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液[12]。

（2）蒽酮試劑的配制。切實(shí)稱取蒽酮0.100g至小燒杯中，緩慢參與50mL濃硫酸，邊加邊攪拌至黃色通明液體，用棕色試劑瓶裝好，置冰箱內(nèi)避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用[13]。

（3）玉葉金花果實(shí)中精多糖溶液的配制。切實(shí)稱取50℃烘干至恒質(zhì)量的玉葉金花果實(shí)中精多糖提取物100.00mg，用蒸餾水溶解定容在100mL容量瓶中，切實(shí)移取2.5mL至25mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度線，用配制好的精多糖溶液測定其吸光度值，再計(jì)算出玉葉金花果實(shí)中精多糖的含量。

（4）玉葉金花果實(shí)中精多糖含量的測定。切實(shí)移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和玉葉金花果實(shí)中精多糖溶液各1mL至具塞試管中，另切實(shí)移取1mL蒸餾水作為空白對照，沿各試管壁緩慢參與5mL預(yù)冷的蒽酮試劑，蓋緊塞子，振蕩搖勻，沸水浴中加熱10min，取出，冷水流中冷卻20min，620nm下測定吸光度值（A）[14]。以吸光度（A）對葡萄糖濃度（C）舉行線性回歸，得回歸方程Y=6.1357X-0.0307及R2值（R2=0.9982）（圖1）。

按1.2.1方法提取玉葉金花果實(shí)中精多糖，配制玉葉金花果實(shí)中精多糖溶液。按標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法測定玉葉金花果實(shí)中精多糖的含量，并根據(jù)以下公式計(jì)算玉葉金花果實(shí)中精多糖的含量[15]。玉葉金花果實(shí)中精多糖含量W=C1/C0×100%。

玉葉金花果實(shí)中精多糖吸光度A=0.144，將其代入回歸方程Y=6.1357X-0.0307，得玉葉金花果實(shí)中精多糖濃度C1；配制的玉葉金花果實(shí)中精多糖濃度C0=0.1mg·mL-1，代入公式計(jì)算，得玉葉金花果實(shí)中精多糖含量W=28.5%。

玉葉金花精多糖提取率=X×V/M×100%。式中，X為樣液的濃度（g·mL-1），V為樣液的體積（mL），M為玉葉金花質(zhì)量（g）。

1.2.4玉葉金花多糖提取工藝的優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)。取玉葉金花粉末10.00g，按1.2.1的方法，研究料液比、浸提時(shí)間、乙醇醇析的體積、pH值4個(gè)因素對玉葉金花果實(shí)中精多糖提取率的影響。

（2）正交試驗(yàn)。以單因素試驗(yàn)為根基，選擇料液比、浸提時(shí)間、乙醇醇析的體積、pH值4個(gè)因素，以多糖提取率為指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)舉行設(shè)計(jì)，其因素與水平如表1所示。

2結(jié)果與分析

2.1玉葉金花果實(shí)中精多糖提取率的單因素試驗(yàn)

2.1.1料液比對玉葉金花果實(shí)中精多糖提取率的影響取玉葉金花果實(shí)粉末10.00g，分別按1∶5，

1∶10，1∶15，1∶20，1∶25（g·mL-1）的料液比溶于水，90℃恒溫水浴2h，抽濾，濾液在1.2.1，1.2.2，

1.2.3條件下純化，并測定玉葉金花果實(shí)中精多糖提取率（圖2）。

由圖2可知，在確定范圍內(nèi)，隨著浸提液體積的增加，玉葉金花果實(shí)精多糖提取率逐步增加；當(dāng)料液比為1∶15（g·mL-1）時(shí)，玉葉金花果實(shí)精多糖提取率最高，再進(jìn)一步增大浸提液體積至1∶25（g·mL-1），玉葉金花果實(shí)精多糖提取率根本維持恒定。

2.1.2pH值對玉葉金花果實(shí)中精多糖提取率的影響取玉葉金花果實(shí)粉末10.00g，按1∶15（g·mL-1）的料液比溶于蒸餾水，調(diào)理pH值分別為3，4，5，6，7，90℃恒溫水浴2h，抽濾。濾液在1.2.1，1.2.2，1.2.3條件下純化，并測定玉葉金花果實(shí)中精多糖提取率（圖3）。

由圖3可知，在確定范圍內(nèi)，隨著pH值增加，玉葉金花果實(shí)中精多糖提取率也增加；當(dāng)pH值為5時(shí)，提取率最高；之后再增加pH值，提取率反而下降。

2.1.3乙醇醇析的體積對玉葉金花果實(shí)中精多糖提取率的影響取玉葉金花果實(shí)粉末10.00g，按1∶15（g·mL-1）的料液比溶于蒸餾水，90℃恒溫水浴2h，抽濾，將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后的濃縮液，分別按1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5（濃縮液∶乙醇體積）比例醇析，4℃醇析24h，在1.2.1，1.2.2，1.2.3條件下純化，并測定玉葉金花果實(shí)中精多糖提取率（圖4）。

由圖4可知，在確定范圍內(nèi)，隨著乙醇醇析的體積成倍增加，玉葉金花多糖的提取率增加，在1∶3的體積比時(shí)提取率達(dá)最大，之后乙醇醇析體積再增加對精多糖提取率根本沒有大的影響。

2.1.4浸提時(shí)間對玉葉金花果實(shí)中精多糖提取率的影響取玉葉金花果實(shí)粉末10.00g，按1∶15（g·mL-1）的料液比溶于蒸餾水，90℃恒溫水浴分別1，2，3，4，5h，抽濾，濾液在1.2.1，1.2.2，1.2.3條件下純化，并測定玉葉金花果實(shí)中精多糖提取率，其結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，浸提時(shí)間在1～3h，玉葉金花果實(shí)中精多糖提取率隨著浸提時(shí)間的延長而增加，在3h時(shí)提取率達(dá)成最大；之后浸提時(shí)間再增加，提取率根本維持恒定。為了裁減能耗，浸提時(shí)間操縱在3h。

2.2玉葉金花果實(shí)中精多糖提取的正交試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

F檢驗(yàn)結(jié)果說明，pH值對試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響；而其他各因素對綜合評(píng)價(jià)值的影響不顯著，故不必再舉行各因素水平間的多重對比。此時(shí)，可直觀地從表2中選擇提取率最大的組合A3B3C2D3為最優(yōu)組合，即pH值6、浸提時(shí)間3h，料液比1∶15（g·mL-1），乙醇醇析體積倍數(shù)1∶4。

2.3驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果

由正交試驗(yàn)優(yōu)選得最優(yōu)提取工藝為：料液比1∶15、浸提時(shí)間3h，pH值6、乙醇醇析體積倍數(shù)1∶4。由此舉行3個(gè)平行驗(yàn)證試驗(yàn)，其他步驟同1.2.1，結(jié)果如表4所示，在料液比1∶15、浸提時(shí)間3h、pH值6、乙醇醇析體積倍數(shù)為1∶4的條件下，玉葉金花果實(shí)的精多糖平均提取率為2.71%。

3結(jié)論與議論

本試驗(yàn)采取醇沉水提法提取玉葉金花果實(shí)中精多糖的研究工藝，利用了多糖是強(qiáng)極性分子、具有溶于水而不溶于有機(jī)溶劑的特點(diǎn)，同時(shí)探討了pH值、浸提時(shí)間、料液比、乙醇醇析體積倍數(shù)4個(gè)因素對玉葉金花果實(shí)精多糖提取率的影響。單因素試驗(yàn)中pH值對玉葉金花果實(shí)精多糖提取率的影響是最大的，其次是浸提時(shí)間和料液比，乙醇醇析體積倍數(shù)是影響最小的因素。正交試驗(yàn)結(jié)果也從理論上支持了上述論斷。最終優(yōu)化后的最正確提取工藝參數(shù)為料液比1∶15（g·mL-1），浸提時(shí)間3h，pH值6，乙醇醇析體積倍數(shù)1∶4，在此條件下，玉葉金花果實(shí)中精多糖的提取率為2.71%，多糖含量為28.50%。

新采摘的玉葉金花果實(shí)，凝膠黏性大，會(huì)導(dǎo)致研磨破碎不完全，使多糖提取率降低，本試驗(yàn)將玉葉金花果實(shí)烘干再復(fù)水提取那么解決了這個(gè)問題。除蛋白步驟，本試驗(yàn)采用搖床搖動(dòng)，使Sevage試劑與多糖提取液充分接觸，除蛋白效果更好。在調(diào)理pH值時(shí)應(yīng)留神確定要邊攪拌邊緩慢調(diào)理，制止展現(xiàn)浸提液酸堿不平勻，防止突然過酸或過堿對試驗(yàn)結(jié)果造成影響。浸提時(shí)間確定要精確操縱，以免展現(xiàn)浸提時(shí)間過長或過短對試驗(yàn)結(jié)果造成影響。在舉行料液比設(shè)置時(shí)，應(yīng)先將所需蒸餾水切實(shí)量取好再舉行浸提，不能直接參與蒸餾水制止水量