第八章電泳分離技術(shù)

主要內(nèi)容第一節(jié)概述第二節(jié)聚丙烯酰胺凝膠電泳第三節(jié)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳第四節(jié)等電聚焦電泳第五節(jié)雙向凝膠電泳第六節(jié)毛細(xì)管電泳第一頁(yè)，共七十七頁(yè)。1.1電泳的基本概念電泳：帶電物質(zhì)在電場(chǎng)中向相反電極移動(dòng)的現(xiàn)象。電泳遷移率：在單位電位梯度的作用下，單位時(shí)間內(nèi)質(zhì)點(diǎn)所移動(dòng)的距離。電泳分離技術(shù)：利用帶電物質(zhì)在電場(chǎng)中泳動(dòng)速度的差別而進(jìn)行分離的方法。2第二頁(yè)，共七十七頁(yè)。1.2電泳的理論基礎(chǔ)3第三頁(yè)，共七十七頁(yè)。1.2.1影響電泳速度的因素①電場(chǎng)強(qiáng)度：泳動(dòng)速度與電場(chǎng)強(qiáng)度成正比；②溶液的pH值：pH距待分離物質(zhì)的pI越遠(yuǎn)，泳動(dòng)速度越大；③溶液離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度越小,電動(dòng)勢(shì)越大,泳動(dòng)速度越快；④溶液的黏度：泳動(dòng)速度與溶液的黏度成反比；⑤電滲現(xiàn)象：在電場(chǎng)中，液體對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng)。⑥顆粒的性質(zhì)：一般所帶電荷量越大、直徑越小或其形狀越接近于球形，遷移率就越大。4第四頁(yè)，共七十七頁(yè)。1.2.2兩種離子型物質(zhì)A和B的混合物的分離和5第五頁(yè)，共七十七頁(yè)。1.3電泳技術(shù)分類(lèi)淀粉凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳紙電泳

醋酸纖維薄膜電泳薄層電泳凝膠支持物區(qū)帶電泳非凝膠支持物電泳顯微電泳等電聚焦電泳等速電泳不用支持物電泳用支持物區(qū)帶電泳是否用支持物6第六頁(yè)，共七十七頁(yè)。薄層電泳板電泳柱電泳。根據(jù)支持介質(zhì)形狀不同電泳系統(tǒng)的連續(xù)性連續(xù)電泳不連續(xù)電泳分析電泳制備電泳定量、免疫電泳。用途不同電泳的方向不同水平電泳垂直電泳7第七頁(yè)，共七十七頁(yè)。第二節(jié)聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。聚丙烯酰胺凝膠具有機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，透明，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，對(duì)pH和溫度變化小，沒(méi)有吸附和電滲作用小的特點(diǎn)，是一種很好的電泳支持介質(zhì)。PAGE按凝膠的形狀可分為：圓盤(pán)狀電泳垂直或平板狀電泳

8第八頁(yè)，共七十七頁(yè)。CH2=CHC=ONH2CH2=CH

C=ONHCH2NHC=OCH2=CH丙烯酰胺(Acr)N,N’-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONH2NHCH2NHC=O-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONHNH2聚丙烯酰胺9第九頁(yè)，共七十七頁(yè)。2.1基本原理2.1.1聚丙烯酰胺凝膠的聚合1)化學(xué)聚合

化學(xué)聚合的催化劑通常采用過(guò)硫酸銨，此外還需要加速劑TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺），它能以自由基的形式存在。微量TEMED的加入，可使過(guò)硫酸銨形成自由基：

S2O82-2SO4-

這些自由基的產(chǎn)生可引發(fā)丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的聚合、交聯(lián)反應(yīng)，形成有一定平均孔徑的聚丙烯酰胺。.10第十頁(yè)，共七十七頁(yè)。

2)光聚合

光聚合通常用核黃素為催化劑，核黃素經(jīng)光照形成無(wú)色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引發(fā)聚合反應(yīng)。TEMED的存在，可以加速聚合。上述聚合反應(yīng)受許多因素的影響：（1）大氣氧能淬滅自由基，阻止多聚體鏈長(zhǎng)的增加。在進(jìn)行化學(xué)聚合前，一般用減壓抽氣的辦法除去溶液中溶解的空氣。在膠液表面，往往覆蓋一層水或溶液，隔絕空氣，可加速聚合。（2）低溫、低pH都會(huì)減慢聚合反應(yīng)速度。（3）有些材料如聚丙烯酸甲酯有機(jī)玻璃，一些金屬等可抑制聚合反應(yīng)。11第十一頁(yè)，共七十七頁(yè)。2.1.2凝膠用量計(jì)算聚丙烯酰胺凝膠孔徑的大小取決于凝膠總濃度（T%）和交聯(lián)度（C%）。

T%=

C%=式中a代表單體Arc的重量(g)，b代表交聯(lián)劑Bis的重量(g)，m代表溶液的體積(mL)a+bm×100%aa+b×100%12第十二頁(yè)，共七十七頁(yè)。分子量范圍適宜凝膠濃度T%

<10420~301-4×10415~204104-1×10510~15105-5×1055~10>5×1052~5表分離蛋白質(zhì)選擇聚丙烯酰胺凝膠濃度參考值在濃度為7.5%的凝膠中，大多數(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)能得到滿意的分離效果。因此，把濃度為7.5%凝膠稱為標(biāo)準(zhǔn)膠。對(duì)于一個(gè)未知樣品，常用7.5%的標(biāo)準(zhǔn)膠或4%-10%的凝膠梯度來(lái)測(cè)試，而后選出適宜的凝膠濃度。13第十三頁(yè)，共七十七頁(yè)。2.1.3分離效應(yīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分為:連續(xù)性電泳不連續(xù)性電泳:凝膠層的不連續(xù)性緩沖液離子成分的不連續(xù)性pH值的不連續(xù)性電位梯度的不連續(xù)性電泳時(shí)產(chǎn)生的3種物理效應(yīng):濃縮效應(yīng)電荷效應(yīng)分子篩效應(yīng)14第十四頁(yè)，共七十七頁(yè)。A.樣品的濃縮效應(yīng)緩沖液成分及pH的不連續(xù)性濃縮膠pH6.7緩沖液濃縮膠Tris-HCl,電極緩沖液Tris-Gly緩沖液樣品濃縮膠分離膠15第十五頁(yè)，共七十七頁(yè)。緩沖液成分及pH的不連續(xù)性導(dǎo)致蛋白質(zhì)樣品濃縮效應(yīng)示意圖快離子慢離子蛋白質(zhì)樣品

解離度：Cl>蛋>

Glymclcl>m蛋蛋>mGlyGly凝膠中Cl－為快離子，Gly－為慢離子，蛋白質(zhì)樣品被夾在中間。16第十六頁(yè)，共七十七頁(yè)。凝膠層的不連續(xù)性

樣品進(jìn)入濃縮膠有一個(gè)堆積濃縮效應(yīng)(緩沖液pH8.3)

蛋白質(zhì)從“－”極向“＋”極移動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入分離膠，速度變慢，堆積濃縮。緩沖液樣品濃縮膠分離膠17第十七頁(yè)，共七十七頁(yè)。E：每厘米的電壓降

E＝I(電流強(qiáng)度)/(電導(dǎo)率)E與電泳速度成正比電泳開(kāi)始后，由于快離子泳動(dòng)率最大，在快離子后面形成一個(gè)離子濃度低的低電導(dǎo)區(qū)，產(chǎn)生較高的電位梯度，使蛋白質(zhì)和慢離子加速移動(dòng)，蛋白質(zhì)樣品被進(jìn)一步濃縮。電位梯度的不連續(xù)性18第十八頁(yè)，共七十七頁(yè)。B.

電荷效應(yīng)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)入分離膠后，pH增大(pH8.9)，Gly－解離度增大，不存在快、慢離子之分，蛋白質(zhì)樣品在均一電場(chǎng)強(qiáng)度和pH條件下泳動(dòng)。由于各種蛋白質(zhì)pI不同，所載有效電荷不同，因此質(zhì)點(diǎn)的有效遷移率不同，形成不同區(qū)帶。緩沖液濃縮膠分離膠19第十九頁(yè)，共七十七頁(yè)。C.

分子篩效應(yīng)分離膠的孔徑小，各分子由于大小和形狀不同，所受阻力不同，表現(xiàn)出不同的泳動(dòng)速度，即分子篩作用。分子量小，形狀為球形的泳動(dòng)速度最快。緩沖液濃縮膠分離膠20第二十頁(yè)，共七十七頁(yè)。2.2PAGE的優(yōu)點(diǎn)1）聚丙烯酰胺凝膠電滲作用較小；2）聚丙烯酰胺凝膠孔徑可控制；3）聚丙烯酰胺凝膠對(duì)熱穩(wěn)定，無(wú)色透明；4）丙烯酰胺是比較純的化合物。5）分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中。21第二十一頁(yè)，共七十七頁(yè)。2.3影響凝膠聚合的因素1）形成凝膠的試劑的純度；2）凝膠濃度；3）溫度和氧氣的影響。22第二十二頁(yè)，共七十七頁(yè)。第三節(jié)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳

加入SDS（十二烷基磺酸鈉）和少量巰基乙醇，則生物大分子的遷移率主要取決于它的分子量，而與原來(lái)所帶電荷、分子形狀無(wú)關(guān)。23第二十三頁(yè)，共七十七頁(yè)。3.1基本原理：

1、由于SDS是陰離子，使多肽表面覆蓋的負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了原來(lái)的電荷差異。2、改變了蛋白質(zhì)單體分子的構(gòu)象，不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的短軸長(zhǎng)度都相同，長(zhǎng)軸長(zhǎng)度隨其分子量的大小成正比變化。

3、由于不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物具有相同的荷質(zhì)比，并具有相似的構(gòu)象，因而有如下公式：

lgM=K1—K2μR（K1、K2為常數(shù)，μR為相對(duì)遷移率）24第二十四頁(yè)，共七十七頁(yè)。

實(shí)際測(cè)定時(shí)，以幾種標(biāo)準(zhǔn)單體蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)值對(duì)其μR作圖，根據(jù)樣品的μR值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上就可查出其分子量。標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量未知蛋白在一定的凝膠濃度下，多肽鏈分子量的對(duì)數(shù)與多肽鏈的相對(duì)遷移率成線性關(guān)系，所以可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線求未知多肽鏈分子量。相對(duì)遷移率25第二十五頁(yè)，共七十七頁(yè)。3.2SDS的操作步驟1.安裝膜具（1）（2）26第二十六頁(yè)，共七十七頁(yè)。（3）（4）（5）27第二十七頁(yè)，共七十七頁(yè)。2.配制凝膠溶液3.灌膠

凝膠配方儲(chǔ)存液凝膠終濃度T(C=3%)3%5%10%15%20%單體儲(chǔ)液ml3.45101520濃縮膠緩沖液2.4分離膠緩沖液7.57.57.57.510%SDS0.20.30.30.30.3雙蒸水1417.212.27.22.210%過(guò)硫酸銨ul1010101010TEMEDul101010101028第二十八頁(yè)，共七十七頁(yè)。插入梳子29第二十九頁(yè)，共七十七頁(yè)。膠凝后用夾子將玻璃夾出將封膠條輕輕撕掉30第三十頁(yè)，共七十七頁(yè)。旋轉(zhuǎn)180度，

凹玻璃向里加緩沖液31第三十一頁(yè)，共七十七頁(yè)。4.樣品制備

將0.5ml樣品液，0.25ml10%SDS和0.25ml1%巰基乙醇于小試管中，置100℃水浴中煮沸3分鐘后，取出冷卻，然后，加入0.25ml上樣緩沖液(0.05%溴酚蘭+40%蔗糖溶液)，混合。取出混合樣品40微升加入樣品槽，每個(gè)樣品重復(fù)兩個(gè)。32第三十二頁(yè)，共七十七頁(yè)。5.加樣33第三十三頁(yè)，共七十七頁(yè)。6.電泳接通電源，電流恒定為80mA，待溴酚蘭指示劑移至離下端0.5cm（約3小時(shí)），切斷電源，拔去插頭，倒出電極緩沖液。34第三十四頁(yè)，共七十七頁(yè)。7.剝膠注意保持膠的完整性。35第三十五頁(yè)，共七十七頁(yè)。8染色

1.染色液：考馬思亮藍(lán)G-2501.0克甲醇450ml

冰醋酸100ml

加H2O到1000ml9脫色

1.脫色液：甲醇100ml

冰醋酸100ml

加H2O到1000ml36第三十六頁(yè)，共七十七頁(yè)。電泳后的凝膠經(jīng)考馬斯亮籃染色、脫色后的凝膠照片Mark:Myosin200000wβ-galactosidase116250Phosphorylaseb97400Serumalbumin66200Ovalbumin45000Carbonicanhydrase31000Trysininhibitor21500Lysozyme14400Aprotinin650037第三十七頁(yè)，共七十七頁(yè)。10凝膠（脫色之后）結(jié)果分析

1、計(jì)算遷移率（Rm值）：相對(duì)遷移率=2、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以標(biāo)準(zhǔn)蛋白亞基的Rm值為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)分子量的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，即可繪制出測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的標(biāo)準(zhǔn)的線圖。3、計(jì)算未知蛋白亞基樣品的分子量：根據(jù)未知樣品樣的Rm值，從上述標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中即可查出其分子量。蛋白樣品距加樣端遷移距離(cm)溴酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端距離(cm)38第三十八頁(yè)，共七十七頁(yè)。3.3注意事項(xiàng)

1．丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是神經(jīng)毒性試劑，并對(duì)皮膚有刺激作用，注意避免直接接觸。大量操作時(shí)應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。2．丙稀酰胺和甲叉雙丙烯酰胺溶液應(yīng)裝在棕色瓶中，置冰箱內(nèi)（4℃）保存。可貯存1～2個(gè)月。測(cè)定pH（4.9～5.2）可檢查其是否失效，失效不能聚合。

3．TEMED要密封保存，過(guò)硫酸銨溶液最好當(dāng)天配制，以防止氧化失效。

4．凝膠的聚合速度與溫度關(guān)系很大，溫度低時(shí)，聚合速度減慢，必須根據(jù)實(shí)驗(yàn)時(shí)的溫度調(diào)整3號(hào)、4號(hào)試劑的用量，以使凝膠在30min內(nèi)聚合。39第三十九頁(yè)，共七十七頁(yè)。等電聚焦凝膠電泳是依據(jù)蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)進(jìn)行分離的技術(shù)，等電聚焦中，蛋白質(zhì)分子在含有載體兩性電解質(zhì)形成的一個(gè)連續(xù)而穩(wěn)定的線性pH梯度中電泳。載體兩性電解質(zhì)是脂肪族多氨基多羧酸，在電場(chǎng)中形成正極為酸性，負(fù)極為堿性的連續(xù)的pH梯度。蛋白質(zhì)分子在偏離其等電點(diǎn)的pH條件下帶有電荷，因此可以在電場(chǎng)中移動(dòng)；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)遷移至其等電點(diǎn)位置時(shí)，其靜電荷數(shù)為零，在電場(chǎng)中不再移動(dòng)，據(jù)此將蛋白質(zhì)分離。第四節(jié)等電聚焦40第四十頁(yè)，共七十七頁(yè)。兩性電解質(zhì)載體(carrierampholytes)(1)易溶于水，在pI處應(yīng)有足夠的緩沖能力，形成穩(wěn)定的pH梯度，不致被蛋白質(zhì)或其它兩性電解質(zhì)改變pH梯度。(2)在pI處應(yīng)有良好的電導(dǎo)及相同的電導(dǎo)系數(shù)，以保持均勻的電場(chǎng)。(3)分子量小，可通過(guò)透析或分子篩法除去，便于與生物大分子分開(kāi)。(4)化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，也無(wú)變性作用，其化學(xué)組成不同于蛋白質(zhì)。41第四十一頁(yè)，共七十七頁(yè)。

利用聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)的緩沖液在電場(chǎng)作用下沿電場(chǎng)方向在凝膠內(nèi)制造一個(gè)pH梯度。每種蛋白質(zhì)都將遷移至與它的pI相一致的pH處。凝膠中加有兩性電解質(zhì)溶液（pH9-3）加電場(chǎng)后在凝膠內(nèi)形成一個(gè)穩(wěn)定pH梯度加樣品，然后繼續(xù)電泳凝膠染色表明樣品按照各自pI值沿著pH梯度分布42第四十二頁(yè)，共七十七頁(yè)。等電聚焦電泳進(jìn)行過(guò)程中等電聚焦電泳結(jié)束后（＋）（＋）（－）（－）低pH低pH高pH高pH43第四十三頁(yè)，共七十七頁(yè)。試劑與器材試劑：兩性電解質(zhì)載體pH3-10、10%四甲基乙二胺、10%過(guò)硫酸銨、5%H3PO4、2%NaOH、40%蔗糖、0.04％考馬斯亮蘭R250、7%醋酸器材：圓盤(pán)電泳槽、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、脫色搖床44第四十四頁(yè)，共七十七頁(yè)。操作方法1.凝膠柱的制備（1）玻璃管的一端插在橡皮帽中(與橡皮接觸的部分凝膠不易聚合，可在橡皮帽中先加一滴40%的蔗糖)（2）配膠表10mL7.5%凝膠的配制試劑名稱 體積(mL) 凝膠貯液 2.5 兩性電解質(zhì)載體 0.5 10%TEMED 0.1 蛋白質(zhì)混合樣品 0.1 蒸餾水 6.75 混勻后置真空干燥器中抽氣10min 10%過(guò)硫酸銨 0.05 45第四十五頁(yè)，共七十七頁(yè)。（3）將配好的凝膠溶液用細(xì)長(zhǎng)頭滴管加到預(yù)先準(zhǔn)備好的玻管中，至離上端1cm處，再用注射器緩緩加水3-5mm高。（4）待凝膠聚合2.電泳

小心地拔出玻管，并用蒸餾水洗去蔗糖溶液，把管固定到電泳槽上槽的洞中（安裝時(shí)要保證凝膠管垂直且橡膠塞孔密封不漏）在上槽中加入5%磷酸緩沖液，在下槽中裝入2%氫氧化鈉溶液。避免管下有氣泡。上槽接電泳儀的正極，下槽接負(fù)極，打開(kāi)電源，先調(diào)電壓至100V，待電壓穩(wěn)定后再升到300V，電泳2h以上至電流降為0，將電壓調(diào)至0，關(guān)閉電源。46第四十六頁(yè)，共七十七頁(yè)。3．剝膠

電泳結(jié)束后，取下凝膠管，用蒸餾水充分洗凈兩端電極液，在凝膠條的正極端插一銅絲為標(biāo)記。用灌滿水的注射器長(zhǎng)針頭插入凝膠與玻管管壁之間，邊壓水邊慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)玻管，推針前進(jìn)，同時(shí)注入水，靠水流壓力和潤(rùn)滑力將玻璃管內(nèi)壁與凝膠分開(kāi)，凝膠條即可流出。4.固定染色

取其中一條凝膠條放在一塊潔凈的玻板上，用尺量出固定前的凝膠條長(zhǎng)度。放入染色液中同時(shí)進(jìn)行固定染色1-2h，用蒸餾水漂洗數(shù)次后用脫色液脫色，直至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰，量出蛋白帶距正極端的距離。47第四十七頁(yè)，共七十七頁(yè)。5.pH梯度的制作

取另一條凝膠條放在玻板上，從凝膠的正極端開(kāi)始，每隔0.5cm切下一段，依次放入已編好號(hào)并裝有1mL蒸餾水的試管中，浸泡過(guò)夜。次日用酸度計(jì)分別測(cè)定每管浸提液的pH值。以凝膠長(zhǎng)度為橫坐標(biāo)，pH值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)pH梯度曲線。6.蛋白質(zhì)樣品等電點(diǎn)的計(jì)算

求出蛋白質(zhì)聚焦部位距凝膠條正極端的實(shí)際長(zhǎng)度為：固定后的蛋白區(qū)帶中心距凝膠條正極端的距離

固定染色前凝膠條長(zhǎng)度固定染色后凝膠條長(zhǎng)度 計(jì)算出蛋白質(zhì)聚焦部位距凝膠條正極端的實(shí)際長(zhǎng)度后，直接從pH梯度曲線上求出該蛋白質(zhì)等電點(diǎn)。48第四十八頁(yè)，共七十七頁(yè)。等電點(diǎn)聚焦的顯著優(yōu)點(diǎn)1.分辨率高2.很稀的樣品都可分離，且重現(xiàn)性好3.可用于測(cè)定蛋白質(zhì)或多肽的等電點(diǎn)等電點(diǎn)聚焦的缺點(diǎn)1.要求使用無(wú)鹽溶液，而某些蛋白質(zhì)在無(wú)鹽溶液中溶解度低，可能產(chǎn)生沉淀；2.樣品中各組分都聚焦到其等電點(diǎn)，對(duì)一些在等電點(diǎn)不溶解或發(fā)生變性的蛋白質(zhì)不適用。49第四十九頁(yè)，共七十七頁(yè)。注意事項(xiàng)鹽離子可干擾pH梯度形成并使區(qū)帶扭曲。為防止上述影響，進(jìn)行IEF時(shí)，樣品應(yīng)透析或用SephadexG-25脫鹽，也可將樣品溶解在水或低鹽緩沖液中使其充分溶解，以免不溶小顆粒引起拖尾。加樣量則取決于樣品中蛋白質(zhì)的種類(lèi)、數(shù)目以及檢測(cè)方法的靈敏度。如用考馬斯亮藍(lán)R-250染色，加樣量可為50-150g；如用銀染色，加樣量可減少到1g。一般樣品濃度以0.5-3mg/mL為宜，最適當(dāng)加樣體積為10-30l。50第五十頁(yè)，共七十七頁(yè)。第五節(jié)雙向凝膠電泳雙向凝膠是一種由任意兩個(gè)凝膠電泳組合而成的，即在第一向電泳后再在與第一向垂直的方向上進(jìn)行第二向電泳。其基本原理一般與組成它的兩個(gè)單向電泳基本原理相同。51第五十一頁(yè)，共七十七頁(yè)。第一向：等電聚焦電泳第二向：SDS

雙向電泳后的凝膠經(jīng)染色后蛋白呈現(xiàn)二維分布圖：水平方向反映出蛋白在pI上的差異，垂直方向反映出它們?cè)诜肿恿可系牟顒e。第一向電泳：等電聚焦電泳聚焦后凝膠放置在SDS凝膠上，進(jìn)行第二向電泳第二向電泳：SDS分子量大分子量小pH9pH3pH9pH352第五十二頁(yè)，共七十七頁(yè)。53第五十三頁(yè)，共七十七頁(yè)。操作步驟：

蛋白樣品的制備↓等電聚焦凝膠溶液的配制↓灌注毛細(xì)管凝膠↓組裝第一向電泳槽↓聚焦電泳↓停止電泳↓取出毛細(xì)管膠↓毛細(xì)管膠置平衡液中平衡54第五十四頁(yè)，共七十七頁(yè)。↓組裝第二向電泳槽↓配制SDS-丙烯胺凝膠溶液↓灌裝SDS-電泳膠↓第一向凝膠與第二向凝膠拼接↓接通電源進(jìn)行SDS-電泳↓停止電泳取膠↓凝膠置固定液中固定↓銀染法顯色↓結(jié)果分析55第五十五頁(yè)，共七十七頁(yè)。大腸桿菌全蛋白提取液雙向電泳凝膠染色后照片56第五十六頁(yè)，共七十七頁(yè)。樣品的溶解是2-DE成功分離蛋白質(zhì)的最關(guān)鍵因素之一。溶解的目標(biāo)：1、樣品中非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和聚積體完全破壞，從而形成各個(gè)多肽的溶解液（否則樣品中結(jié)合牢固的蛋白復(fù)合物可能使2-DE中出現(xiàn)新的蛋白點(diǎn)，相應(yīng)的表示單個(gè)多肽的點(diǎn)的強(qiáng)度會(huì)下降）；2、溶解方法必須允許可能干擾2-DE分離的鹽、脂類(lèi)、多糖和核酸等物質(zhì)的去除；3、溶解方法要保證樣品在電泳過(guò)程中保持溶解狀態(tài)。57第五十七頁(yè)，共七十七頁(yè)。增加樣品溶解性的手段變性劑：通過(guò)改變?nèi)芤褐械臍滏I結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。表面活性劑：經(jīng)過(guò)變性劑處理而暴露蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)后，還常需至少一種表面活性劑來(lái)溶解疏水基團(tuán)。常用的表面活性劑有離子去污劑SDS、非離子去污劑TritonX-100和NP-40、兩性離子去污劑CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。還原劑：在變性劑和表面活性劑聯(lián)用條件下，加用還原劑可使已變性的蛋白質(zhì)展開(kāi)更完全，溶解更徹底。常用含自由巰基的DTT或-巰基乙醇，以及不帶電荷的三丁基膦（TBP）進(jìn)行還原。58第五十八頁(yè)，共七十七頁(yè)。起載體作用的兩性電解質(zhì)：即便在變性劑和表面活性劑存在的情況下，某些蛋白質(zhì)也需要在鹽離子的作用下才能保持其處于溶解狀態(tài)，否則這些蛋白質(zhì)在其處于pI點(diǎn)時(shí)會(huì)發(fā)生沉淀。Carrierampholytes的作用在于捕獲樣品中的少量鹽分，從而保證蛋白質(zhì)的溶解性。應(yīng)用時(shí)，兩性電解質(zhì)的濃度應(yīng)小于0.2％（w/v)。濃度過(guò)高會(huì)使IEF的速度降低。另外，為了保證實(shí)驗(yàn)的精確性，在選擇不同pH范圍的IPG膠條時(shí)，也應(yīng)使兩性電解質(zhì)的pH值與之相符合。59第五十九頁(yè)，共七十七頁(yè)。非變性2D：兩向均在非變性條件下進(jìn)行，這樣分離的蛋白質(zhì)點(diǎn)的等電點(diǎn)和表觀分子量同生理?xiàng)l件下獲得的這些蛋白的值是一樣的；非變性/SDS-2D：第一向采用非變性IEF，之后在2%SDS溶液中平衡；第二向也在SDS存在的條件下進(jìn)行。適于分析非共價(jià)鍵連接的蛋白－蛋白間的相互作用。非變性/還原/SDS-2D：非變性條件下IEF聚焦，之后用8M尿素＋5%β-ME＋2%SDS進(jìn)行平衡，再進(jìn)行第二向SDS-PAG電泳。此時(shí)分離的蛋白質(zhì)點(diǎn)可進(jìn)行點(diǎn)的切取、蛋白酶消化、MALDI-TOF-MS分析鑒定，提供關(guān)于斷裂二硫鍵連接的多肽的信息。變性2D：樣品先用2%SDS＋5%β-ME＋95℃變性5min，IEF在8M尿素＋1%NP-40條件下進(jìn)行，之后膠條用2%SDS＋5%β-ME平衡，然后進(jìn)行SDS。該技術(shù)適于DNA序列和多肽結(jié)構(gòu)的分析，或分析被碳?xì)滏I連接和其它翻譯后修飾所引起的多肽結(jié)構(gòu)微異質(zhì)性，但此方式顯示的大于100Kd的蛋白質(zhì)點(diǎn)少于第三種方式雙向電泳的分類(lèi)60第六十頁(yè)，共七十七頁(yè)。第六節(jié)毛細(xì)管電泳

又稱高效毛細(xì)管電泳(HPCE),是指離子或帶電粒子以毛細(xì)管為分離室,以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力,依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的液相分離分析技術(shù)。61第六十一頁(yè)，共七十七頁(yè)。

一、高效毛細(xì)管電泳基本原理

在電解質(zhì)溶液中，位于電場(chǎng)中的帶電離子在電場(chǎng)力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同可實(shí)現(xiàn)分離。1.經(jīng)典電泳分離法的不足

所用分離柱的柱徑大，柱較短，分離效率不高（遠(yuǎn)低于HPLC），溫度影響大。高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn)。62第六十二頁(yè)，共七十七頁(yè)。2.高效毛細(xì)管電泳技術(shù)上的重要突破高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn)：一是采用了0.05mm內(nèi)徑的毛細(xì)管；二是采用了高達(dá)數(shù)千伏的電壓。毛細(xì)管的采用使產(chǎn)生的熱量能夠較快散發(fā)，大大減小了溫度效應(yīng)，使電場(chǎng)電壓可以很高。電壓升高，電場(chǎng)推動(dòng)力大，又可進(jìn)一步使柱徑變小，柱長(zhǎng)增加，高效毛細(xì)管電泳的柱效遠(yuǎn)高于高效液相色譜，理論塔板數(shù)高達(dá)幾十萬(wàn)塊/米，特殊柱子可以達(dá)到數(shù)百萬(wàn)。63第六十三頁(yè)，共七十七頁(yè)。3.基本概念有效長(zhǎng)度(Ld,cm):毛細(xì)管的入口端到檢測(cè)器窗口的距離；

遷移時(shí)間(tmmin):帶電粒子在電場(chǎng)作用下做定向移動(dòng)的時(shí)間；電泳速度(Uecm/s):在單位時(shí)間內(nèi)，帶電粒子在毛細(xì)管中定向移動(dòng)的距離；電場(chǎng)強(qiáng)度(EV/cm):

在給定長(zhǎng)度毛細(xì)管的兩端施加一個(gè)電場(chǎng)后所形成的電效應(yīng)的強(qiáng)度；電泳淌度(μepcm2/(V.s)):帶電粒子在毛細(xì)管中定向移動(dòng)的速度與所在電場(chǎng)強(qiáng)度之比；64第六十四頁(yè)，共七十七頁(yè)。電滲流：毛細(xì)管內(nèi)壁表面的電荷所引起的管內(nèi)液體的整體流動(dòng)，源于外加電場(chǎng)對(duì)管壁溶液雙電層的作用；１.使液體沿毛細(xì)管壁均勻移動(dòng)；２.使攜帶不同電性的分子均向負(fù)極移動(dòng)，中性分子也隨著電滲流一起移動(dòng)。樣品分子泳動(dòng)方向電滲流方向65第六十五頁(yè)，共七十七頁(yè)。4.分離過(guò)程

電場(chǎng)作用下，柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象。帶電粒子的遷移速度=電泳和電滲流兩種速度的矢量和正離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向一致，在負(fù)極最先流出中性粒子無(wú)電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽(yáng)離子后流出陰離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向相反，ν電滲流>ν電泳時(shí),陰離子在負(fù)極最后流出,在這種情況下,不但可以按類(lèi)分離,除中性粒子外,同種類(lèi)離子由于受到的電場(chǎng)力大小不一樣也同時(shí)被相互分離。66第六十六頁(yè)，共七十七頁(yè)。二毛細(xì)管電泳儀系統(tǒng)電泳儀進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)67第六十七頁(yè)，共七十七頁(yè)。進(jìn)樣系統(tǒng)

靜壓力進(jìn)樣和電動(dòng)進(jìn)樣進(jìn)樣體積一般在納升級(jí)進(jìn)樣長(zhǎng)度必須控制在毛細(xì)管總長(zhǎng)度的1%~2%，否則將影響分離效率68第六十八頁(yè)，共七十七頁(yè)。

分離系統(tǒng)毛細(xì)管:由熔融石英制成,內(nèi)徑通常為25~75μm,外徑為350~400μm，有效長(zhǎng)度為80~100cm;恒溫系統(tǒng):控制柱溫變化在±0.10C；高壓電源:電流0~300μA電壓0~30KV,電壓穩(wěn)定性在±0.1%;69第六十九頁(yè)，共七十七頁(yè)。檢測(cè)系統(tǒng)常用的檢測(cè)方式是紫外-可見(jiàn)光吸收.檢測(cè)器位于距樣品盤(pán)約毛細(xì)管總長(zhǎng)的2/3~4/5處,對(duì)毛細(xì)管壁內(nèi)部分進(jìn)行光聚焦；此外，熒光，激光誘導(dǎo)熒光，質(zhì)譜等檢測(cè)方法也被應(yīng)用于毛細(xì)管電泳;70第七十頁(yè)，共七十七頁(yè)。高效毛細(xì)管電泳儀實(shí)圖71第七十一頁(yè)，共七十七頁(yè)。ＣＥ現(xiàn)有六種分離模式

1.毛細(xì)管區(qū)帶電泳(capillaryzoneelectrophoresis,CZE)

又稱毛細(xì)管自由電泳,是CE中最基本、應(yīng)用最普遍的一種模式。