食品中合成著色劑的測(cè)定

1食品中合成著色劑的測(cè)定——色素提取2014.4.282課程目的：掌握食品中合成著色劑的測(cè)定原理；了解高效液相色譜的工作原理及操作方法。3著色劑：通過(guò)使食品著色后改善其感官性狀，增進(jìn)食欲的一類物質(zhì)，這類食品本身具有色澤，因此又稱為色素。天然著色劑：辣椒紅、甜菜紅、紅曲米、胭脂蟲紅、高粱紅、葉綠素銅鈉、姜黃、梔子黃、胡蘿卜素、藻藍(lán)素、可可色素、焦糖色素等等。

合成著色劑：用人工合成的方法從煤焦油中制取，或以苯、甲苯、萘等芳香烴化合物為原料合成的有機(jī)色素。包括莧菜紅、檸檬黃、亮藍(lán)、日落黃、誘惑紅、赤鮮紅等等。4合成著色劑的潛在危害——致瀉性、致癌性國(guó)際：JECFA制定各種合成著色劑的ADI我國(guó)：食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)（GB2760-2011）?，F(xiàn)狀：超量使用，使用工業(yè)色素、染料色素5方便、快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)食品中合成著色劑，是對(duì)其進(jìn)行有效管理的必要手段。測(cè)定手段（GB/T5009.35-2003）：高效液相色譜法薄層色譜法示波極譜法其他：紙上層析、分光光度法6亮藍(lán)、檸檬黃、日落黃7著色劑最大使用量（g/kg）檸檬黃0.1日落黃0.1亮藍(lán)0.025合成著色劑在飲料中的最大使用量（GB2760-2011）同一功能的食品添加劑（相同色澤著色劑、防腐劑、抗氧化劑）在混合使用時(shí)，各自用量占其最大使用量的比例之和不應(yīng)超過(guò)18一、實(shí)驗(yàn)原理1.聚酰胺吸附法提取合成著色劑聚酰胺（尼龍）通過(guò)氫鍵吸附著色劑，天然著色劑（影響測(cè)定）在酸性條件下被洗脫去除，合成著色劑在堿性條件下被洗脫收集，濃縮后上機(jī)測(cè)定。吸附——洗滌——解吸附——濃縮——上機(jī)理化測(cè)定一般步驟：除雜質(zhì)、收集目標(biāo)物、調(diào)整濃度、上機(jī)92.1色譜法基本原理色譜法（又層析法）：是一種物理或物理化學(xué)的分離分析方法。是利用混合物中各組分在兩相（固定相和流動(dòng)相）中吸附、分配、離子交換、親和力、分子尺寸等差異，使固定相各組分的保留作用不同，當(dāng)兩相做相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，不同組分產(chǎn)生反復(fù)多次的差速遷移從而分離分析。102.2高效液相色譜法高效液相色譜法（HPLC）：是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器

高效、高速、高靈敏度、高自動(dòng)化113.結(jié)果分析保留時(shí)間（定性）：組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)信號(hào)最大值時(shí)的時(shí)間；根據(jù)樣品中各物質(zhì)被洗脫至檢測(cè)器的時(shí)間差異來(lái)進(jìn)行定性分析；峰面積（定量）：峰與峰底之間的面積，反映組分含量；根據(jù)樣品峰面積與標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的比較來(lái)進(jìn)行定量分析。12試劑配方作用聚酰胺粉吸附檸檬酸溶液20g檸檬酸，100mL水溶解調(diào)PHPH4的水（70℃）水+檸檬酸溶液，調(diào)至PH=4，加熱洗滌甲醇-甲酸溶液60mL甲醇+40mL甲酸洗滌無(wú)水乙醇-氨水-水70mL乙醇+20mL氨水+10mL水解吸附乙酸銨溶液1.54g乙酸銨，純水定容至1000mL，乙酸調(diào)PH至4流動(dòng)相合成著色劑標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度0.05mg/mL定量分析50%乙醇定容樣品其他乙酸、甲醇、氨水、蒸餾水水二、試劑與器材13二、試劑與器材器材：燒杯、玻棒、吸管、移液管、G3漏斗、抽濾瓶*2、針筒、溫度計(jì)、5mL玻璃離心管電子天平、水浴鍋14三、實(shí)驗(yàn)步驟取樣、脫氣稱取飲料20g，倒入50mL燒杯，碳酸飲料用電爐加熱或超聲除去二氧化碳。（已脫氣）。2.色素吸附稱取聚酰胺3g(約3平勺)，用少許PH4的水（70℃）調(diào)成糊狀，加入待測(cè)樣品，攪拌5min。153.除雜質(zhì)組裝好G3漏斗，將樣品倒入漏斗，抽濾；PH4的水（70℃）洗滌3次，每次20mL（洗滌沉淀物）；甲醇-甲酸洗滌3次，每次20mL（洗滌天然色素）；

400mLPH4的水洗滌至PH為4。4.解吸附

更換抽濾瓶。用乙醇-氨水-水溶液洗滌三次至無(wú)色（5mL、10mL、5mL），收集解吸液。5.樣品濃縮及保存解吸液倒入蒸發(fā)皿中，80℃水浴蒸發(fā)至約2mL，以乙酸（一小滴）調(diào)節(jié)PH至6。收集樣品至離心管，加水定容至5mL。4000轉(zhuǎn)離心8min。標(biāo)記并保存于4℃冰箱，以備下次課上機(jī)測(cè)定。163g聚酰胺20g飲料70℃PH4水，糊狀加熱脫氣混合攪拌5minG3漏斗抽濾70℃PH4水，20mL，洗3次甲醇-甲酸，20mL，洗3次70℃PH4水，400mL洗滌乙醇-氨水-水，洗三次，5ml、10mL、5mL更換抽濾瓶收集濾液，80℃水浴至2mL乙酸調(diào)PH至6，離心管定容至5mL，4℃冰箱保存抽濾過(guò)程注意攪拌、倒廢液清洗漏斗：自來(lái)水-鹽酸-蒸餾水目標(biāo)物注意密封性！直至漏斗下水滴PH為4直至漏斗下水滴為無(wú)色1小滴172.1色譜法基本原理色譜法（又層析法）：是一種物理或物理化學(xué)的分離分析方法。是利用混合物中各組分在兩相（固定相和流動(dòng)相）中吸附、分配、離子交換、親和力、分子尺寸等差異，使固定相各組分的保留作用不同，當(dāng)兩相做相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，不同組分產(chǎn)生反復(fù)多次的差速遷移從而分離分析。182.2高效液相色譜法高效液相色譜法（HPLC）：是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器

高效、高速、高靈敏度、高自動(dòng)化19四大系統(tǒng)：1．高壓輸液系統(tǒng)（高壓泵：使流動(dòng)相連續(xù)不斷地送入色譜柱）2．進(jìn)樣系統(tǒng)（可同時(shí)進(jìn)120個(gè)樣，標(biāo)記每個(gè)進(jìn)樣孔所放的樣品）3．分離系統(tǒng)：色譜柱4．檢測(cè)系統(tǒng)：光電二極管陣列檢測(cè)器，一次進(jìn)樣可得不同波長(zhǎng)下的色譜圖輔助裝置：5.梯度洗脫裝置等：適于分析極性差別較大的復(fù)雜組分高效液相色譜儀A、B泵按一定程序不斷改變流動(dòng)相的配比，使溶劑極性、離子強(qiáng)度或PH值改變，從而改進(jìn)復(fù)雜樣品的分離，提高分離效應(yīng)203.結(jié)果分析保留時(shí)間（定性）：組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)信號(hào)最大值時(shí)的時(shí)間；根據(jù)樣品中各物質(zhì)被洗脫至檢測(cè)器的時(shí)間差異來(lái)進(jìn)行定性分析；峰面積（定量）：峰與峰底之間的面積，反映組分含量；根據(jù)樣品峰面積與標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的比較來(lái)進(jìn)行定量分析。21

高效液相色譜法1，安裝色譜柱，活化（新柱子）2，沖洗色譜柱：按照甲醇甲醇+水甲醇+緩沖液，每次沖洗30min。3，預(yù)熱:打開高效液相色譜儀（泵），預(yù)熱3min，待檢測(cè)器氘燈不再閃爍。

流動(dòng)相：純甲醇乙酸銨溶液（pH=4，0.02mol/L）：1.54g乙酸銨，純水定容至1000mL，乙酸調(diào)PH至4純水：清洗用流速：1mL/min檢測(cè)器波長(zhǎng)：（經(jīng)紫外分光光度計(jì)或3D通道獲得）

檸檬黃、日落黃:254nm，亮藍(lán):629nm上樣體積：10μL

22離心：取已定容的樣品，分裝到已標(biāo)記EP管，每組2管，打開Empower軟件3000rpm、5min取上清1.5ml加入已標(biāo)記的進(jìn)樣瓶創(chuàng)建項(xiàng)目、方法設(shè)定樣品：樣品瓶位置編號(hào)、樣品名稱、運(yùn)行時(shí)間12min，方法組程序設(shè)置：梯度洗脫及波長(zhǎng)設(shè)置進(jìn)樣檢測(cè)、數(shù)據(jù)記錄：保留時(shí)間和峰面積結(jié)果計(jì)算，對(duì)比國(guó)標(biāo)，做出評(píng)價(jià)關(guān)檢測(cè)器燈：按甲醇-水沖洗柱子30min甲醇-甲醇沖柱子30min波長(zhǎng)：254、629nm放入進(jìn)樣瓶，記號(hào)各樣品的位置編號(hào)關(guān)檢測(cè)器燈：按甲醇-水沖洗柱子30min甲醇-甲醇沖柱子30min檸檬黃：2.7min日落黃：4.8min亮藍(lán)：5.8min標(biāo)準(zhǔn)液濃度：50μg/ml設(shè)定樣品：樣品瓶位置編號(hào)、樣品名稱、運(yùn)行時(shí)間12min，方法組設(shè)定樣品：樣品瓶位置編號(hào)、樣品名稱、運(yùn)行時(shí)間12min，方法組運(yùn)行監(jiān)視器，基線237.結(jié)果分析（1）保留時(shí)間（2）含量計(jì)算

X——試樣中著色劑含量（g/kg）A——樣液中著色劑含量（μg）V2——進(jìn)樣體積（mL）V1——試樣稀釋總機(jī)體（mL）m——試樣質(zhì)量（g）結(jié)果保留兩位有效數(shù)字標(biāo)準(zhǔn)曲線：檸檬黃：日落黃：X：樣品中色素含量（ng/ml），Y：峰面積24著色劑最大使用量（g/kg）檸檬黃0.1日落黃0.1亮藍(lán)0.025合成著色劑在飲料中的