紫外可見分光光度法

紫外可見分光光度法第一頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日10.3.1紫外－可見分光光度計(jì)的主要部件紫外－可見儀器光路圖第二頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日

用于提供足夠強(qiáng)度和穩(wěn)定的連續(xù)光譜。分光光度計(jì)中常用的光源有熱輻射光源和氣體放電光源兩類。可見光區(qū)：鎢絲燈和鹵鎢燈（>350nm）紫外光區(qū)：氫燈和氘燈（150~400nm）1.光源第三頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日氙燈氫燈鎢燈第四頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日2.單色器第五頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日色散元件主要是棱鏡、光柵和濾光片。棱鏡色散原理是依據(jù)不同的波長(zhǎng)光通過棱鏡時(shí)有不同的折射率而將不同波長(zhǎng)的光分開。第六頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日棱鏡的光學(xué)特性可用色散率和分辨率來表征；

棱鏡的頂角越大或折射率越大，角色散率越大，分開兩條相鄰譜線的能力越強(qiáng)。色散率

a.角色散率：用dθ/dλ表示，偏向角θ對(duì)波長(zhǎng)的變化率；第七頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日b.線色散率：

用dl/dλ表示，兩條相鄰譜線在焦面上被分開的距離對(duì)波長(zhǎng)的變化率；

c.

倒線色散率：用dλ/dl

表示。第八頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日分辨率：相鄰兩條譜線分開程度的度量：

：兩條相鄰譜線的平均波長(zhǎng)；△λ：兩條譜線的波長(zhǎng)差；

b：棱鏡的底邊長(zhǎng)度；

n：棱鏡介質(zhì)材料的折射率。

分辨率與波長(zhǎng)有關(guān)，長(zhǎng)波的分辨率要比短波的分辨率小，棱鏡分離后的光譜屬于非均排光譜。第九頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日例如：某光譜儀在30000nm附近的分辨率為50000。

表明兩條譜線的波長(zhǎng)差必須大于或等于0.6nm，才能分辨清楚。第十頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日光柵

透射光柵，反射光柵；光柵光譜的產(chǎn)生是光射到每一條槽上后被衍射或散射后，又在一定方向干涉，形成的各級(jí)衍射光譜。它可用于紫外、可見及紅外光區(qū)，而且在整個(gè)波長(zhǎng)區(qū)具有良好的、幾乎均勻一致的分辨能力。第十一頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日

將反射光柵的線槽加工成適當(dāng)形狀能使有效強(qiáng)度集中在特定的衍射角上。圖所示反射光柵是由與光柵表面成β角的小斜面構(gòu)成(閃耀光柵)，β角叫做閃耀角。選擇適宜的閃耀角，可以使90%的有效能量集中在單獨(dú)一級(jí)的衍射上。第十二頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日光柵的分辨率R

光柵的分辨率R

等于光譜級(jí)次（n）與光柵刻痕條數(shù)（N）的乘積：

光柵越寬、單位刻痕數(shù)越多、R越大。

寬度50mm，N=1200條/mm，一級(jí)光譜的分辨率：

R=1×50×1200=6×104第十三頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日狹縫

狹縫過寬，單色光不純，造成偏離朗伯－比耳定律。狹縫過窄，光通量變小，降低了靈敏度。狹縫兩邊的邊緣應(yīng)銳利且位于同一平面上。第十四頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日準(zhǔn)直鏡

使進(jìn)入進(jìn)口狹縫的發(fā)散光變成為平行光線，又將色散后的平行單色光聚集于出口狹縫。第十五頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日可見光區(qū)：玻璃或石英池紫外光區(qū)：石英池盛空白、樣品的吸收池，應(yīng)有相同厚度和透光性。校正吸收池：

A池裝空白、B池裝樣品，測(cè)A；反過來，B池裝空白，A池裝樣品，測(cè)A。兩次測(cè)得的A的差值應(yīng)小于1%。3.吸收池第十六頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日

光電轉(zhuǎn)換器光電池光電管光電倍增管光二極管陣列檢測(cè)器4.檢測(cè)器第十七頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日光電池：特點(diǎn)：光電池內(nèi)阻小，電流難放大，用微電流計(jì)直接測(cè)，適于單色光譜帶寬S較大的低檔儀器；易“疲勞”。硒光電池硅光電池第十八頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日光電管：90VDC直流放大陰極R-+光束e陽(yáng)極絲（Ni）抽真空第十九頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日光電倍增管（photomultipliertube,PMT）石英套光束1個(gè)光子產(chǎn)生106~107個(gè)電子?xùn)艠O，Grill陽(yáng)極屏蔽第二十頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日光二級(jí)管陣列檢測(cè)器：構(gòu)造與原理：晶體硅上緊密排列一系列光二極管檢測(cè)器，光透過晶體硅時(shí)，二極管輸出的電信號(hào)與光強(qiáng)成正比。二極管數(shù)目越多，分辨率越高特點(diǎn)：能進(jìn)行快速光譜采集第二十一頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日例：HP8452A型二極管陣列，在190nm～820nm范圍內(nèi)，由316個(gè)二極管組成。每一個(gè)二極管，可在1/10秒內(nèi)，每隔2nm測(cè)定一次，可同時(shí)并行測(cè)得316個(gè)數(shù)據(jù)，1/10秒就獲得全光光譜。二極管123……316測(cè)定λ（nm）190192194……820第二十二頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日5.訊號(hào)處理與顯示器第二十三頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日10.3.2分光光度計(jì)的類型和光學(xué)性能1.單光束分光光度計(jì)幾種光路類型第二十四頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日結(jié)構(gòu)與原理：從光源到檢測(cè)器只有一束光，用空白液調(diào)T%=100%

和測(cè)定試樣液，都在同一位置，用同一束光先后進(jìn)行。特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，但對(duì)光源發(fā)光強(qiáng)度的穩(wěn)定性要求較高。第二十五頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日2.雙光束分光光度計(jì)第二十六頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日3.光多道二極管陣列檢測(cè)的分光光度計(jì)

由光源發(fā)出的光，經(jīng)色差聚光鏡聚焦后通過樣品池，再聚焦于多色儀的入口狹縫上。透過光經(jīng)全息柵表面色散并投射到二極管陣列檢測(cè)器。第二十七頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日中檔儀器的光學(xué)性能1、波長(zhǎng)范圍：

195～820nm2、波長(zhǎng)準(zhǔn)確度：

儀器顯示的波長(zhǎng)與單色光的實(shí)際波長(zhǎng)之間的誤差≤±0.5nm3、波長(zhǎng)的重現(xiàn)性：≤0.5nm4、透光率測(cè)量范圍：0～150%5、吸光度測(cè)量范圍：－0.1730～+2.00第二十八頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日6、光度準(zhǔn)確度：透光率滿量程誤差±≤0.5%7、光度重復(fù)性：重復(fù)測(cè)定的透光率變動(dòng)值

±≤0.5%8、分辨率單色器分辨兩條靠近的譜線的能力。

260nm處為Δλ=0.3nm

9、雜散光220nmNaI（1%g/ml)所含雜散光的強(qiáng)度百分比≤5%。第二十九頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日短波長(zhǎng)區(qū)校正：苯蒸氣吸收光譜或苯乙醇光譜中波長(zhǎng)區(qū)校正：氫燈或氘燈發(fā)射譜線常用486.13nm（F線）和

656.28nm（C線）長(zhǎng)波長(zhǎng)區(qū)校正：鐠釹玻璃的吸收光譜10.3.3儀器的校正波長(zhǎng)的校正第三十頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日

苯蒸氣在紫外光區(qū)有很特征的吸收峰，常用苯蒸氣對(duì)波長(zhǎng)進(jìn)行校正。

在吸收池內(nèi)滴上一滴液體苯，蓋上吸收池使苯蒸氣充滿吸收池，測(cè)定其吸收光譜，用所測(cè)吸收光譜來校正波長(zhǎng)。第三十一頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日鐠釹玻璃濾光片的吸收光譜第三十二頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日

常用K2CrO4標(biāo)準(zhǔn)溶液來校正吸光度標(biāo)度。在進(jìn)行吸光度測(cè)量時(shí)所用的吸收池要配對(duì)（樣品池和參比池），否則要進(jìn)行校正。吸光度的校正第三十三頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日表：鉻酸鉀溶液的吸光度波長(zhǎng)/nm吸光度2200.45592300.16752400.29332500.4962…………4900.00095000.0000第三十四頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日

使用一段時(shí)間后，磨損和污染會(huì)造成透光性能差異，必要時(shí)進(jìn)行檢查和校正。要求同一濃度的溶液在同一儀器上兩次測(cè)量的誤差應(yīng)小于1%吸收池的校正第三十五頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日10.4紫外－可見分光光度分析方法定性分析定性鑒別純度檢查和雜質(zhì)限量測(cè)定定量分析單組分的定量方法多組分的定量方法第三十六頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日10.4.1定性鑒別依據(jù)：多數(shù)有機(jī)化合物具有紫外吸收光譜特征。1.特征值：2.吸收光譜形狀同一化合物，在相同條件下應(yīng)具有相同的吸收光譜（即吸收曲線）第三十七頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日定性鑒別方法：對(duì)比法a.對(duì)比吸收光譜特征數(shù)據(jù)是否一致第三十八頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日b.對(duì)比吸光度比值或吸光系數(shù)比值例如：維生素B12的定性鑒別第三十九頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日c.對(duì)比吸收光譜一致性

同樣條件下，進(jìn)行：試樣光譜曲線與對(duì)照品光譜曲線對(duì)照，或與文獻(xiàn)記載標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)照。紫外光譜作定性鑒別有其局限性，因光譜只有一個(gè)或幾個(gè)寬吸收帶，特征性不強(qiáng)，形狀變化不大。第四十頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日特別指出：在相同條件下，具有相同吸收光譜的物質(zhì)，可能是同一物質(zhì)。若在相同條件下，吸收光譜不同，則肯定不是同一物質(zhì)。第四十一頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日?qǐng)D三種甾體激素的紫外吸收光譜（10μg/ml甲醇）醋酸氫化可的松醋酸潑尼松醋酸可的松第四十二頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日10.4.2純度檢查1.雜質(zhì)檢查選某λ，此處被檢物有吸收，雜質(zhì)無吸收

被檢物弱吸收，雜質(zhì)較強(qiáng)吸收第四十三頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日2.雜質(zhì)限量檢查

藥物無吸收，配雜質(zhì)最高限量液C限雜質(zhì)有吸收選λ測(cè)，

測(cè)定A值，作為A限，若被檢藥物A>A限，則該藥品不合格。第四十四頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日例：腎上腺素中微量雜質(zhì)

——腎上腺酮含量計(jì)算2mg/mL-0.05mol/L的HCl溶液，λ310nm下測(cè)定規(guī)定A310≤0.05

即符合要求的雜質(zhì)限量≤0.06%第四十五頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日第四十六頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日10.4.3單組分的定量方法溶劑的選擇第四十七頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日測(cè)定波長(zhǎng)的選擇選靈敏度高，干擾少的地方測(cè)定第四十八頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日

吸光系數(shù)法標(biāo)準(zhǔn)曲線法標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法定量的方法第四十九頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日1.吸光系數(shù)法（絕對(duì)法）求百分含量：第五十頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日還可以采取如下方法：表觀值第五十一頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日例：精密稱取B12樣品25.0mg，用水溶液配成100ml。精密吸取10.00ml，又置100ml容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在1cm的吸收池中，于361nm處測(cè)定吸光度為0.507，求B12的百分含量？第五十二頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日解：第五十三頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日或解：第五十四頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日2.標(biāo)準(zhǔn)曲線法第五十五頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日蘆丁含量測(cè)定第五十六頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日0.710mg/25mL第五十七頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日3.標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法第五十八頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日注：當(dāng)樣品溶液與標(biāo)準(zhǔn)品溶液的稀釋倍數(shù)相同時(shí)第五十九頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日例：

維生素B12的含量測(cè)定精密吸取B12注射液2.50mL，加水稀釋至10.00mL；另配制對(duì)照液，精密稱定對(duì)照品25.00mg，加水稀釋至1000mL。在361nm處，用1cm吸收池，分別測(cè)定吸光度為0.508和0.518，求B12注射液的濃度以及標(biāo)示量的百分含量（該B12注射液的標(biāo)示量為100μg/mL）第六十頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日解：對(duì)照法第六十一頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日10.4.4多組分的定量方法－計(jì)算分光光度法計(jì)算分光光度法可分：

第六十二頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日三種情況：1．兩組分吸收光譜不重疊（互不干擾）兩組分在各自λmax下不重疊→分別按單組分定量第六十三頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日第六十四頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日2．兩組分吸收光譜部分重疊

λ1→測(cè)A1→b組分不干擾→可按單組分定量測(cè)Ca

λ2→測(cè)A2→a組分干擾→不能按單組分定量測(cè)Ca

第六十五頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日第六十六頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日3．兩組分吸收光譜完全重疊

——混合樣品測(cè)定（1）解線性方程組法（2）等吸收雙波長(zhǎng)消去法（3）系數(shù)倍率法（4）其他方法第六十七頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日（1）解線性方程組法

步驟：第六十八頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日第六十九頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日（2）等吸收雙波長(zhǎng)消去法步驟：消除a的影響測(cè)b第七十頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日第七十一頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日消去b的影響測(cè)a

第七十二頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日雙波長(zhǎng)法須滿足兩個(gè)基本條件：

a.

選定的兩個(gè)波長(zhǎng)下干擾組分具有等吸收點(diǎn)

b.

選定的兩個(gè)波長(zhǎng)下待測(cè)物的吸光度差值應(yīng)足夠大；第七十三頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日（3）系數(shù)倍率法前提：干擾組分b不成峰形無等吸收點(diǎn)第七十四頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日續(xù)前步驟：b曲線上任找一點(diǎn)→λ1

另一點(diǎn)→λ2abλ1

λ2第七十五頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日優(yōu)點(diǎn)：同時(shí)將待測(cè)組分和干擾組分在λ2處的信號(hào)放大K倍，使ΔA值增大，靈敏度提高。但K值以5～7為限，否則因噪聲的放大，使信噪比減小而不利于測(cè)量。第七十六頁(yè)，共八十六頁(yè)，2022年，8月28日（4）導(dǎo)數(shù)光譜法A=CLE=CL?f（λ）把一個(gè)吸收光譜寫成一個(gè)波長(zhǎng)的函數(shù)：A～λ函數(shù)圖：0

階光譜圖函數(shù)圖：函數(shù)圖：函數(shù)圖：一階導(dǎo)數(shù)光譜圖二階導(dǎo)數(shù)光譜圖……n階導(dǎo)數(shù)光譜圖