微生物遺傳育種課件基因重組與育種

微生物遺傳育種課件基因重組與育種第一頁，共一百零四頁，2022年，8月28日第二頁，共一百零四頁，2022年，8月28日

重組與突變的不同點：

突變是指一個細胞的同一個基因組中某一點或某一DNA片段發(fā)生的變異；而重組是來自兩個細胞的不同基因組間遺傳物質(zhì)交換的結(jié)果，重組可在微生物細胞不發(fā)生突變的情況下形成新的基因型與表型。第三頁，共一百零四頁，2022年，8月28日雜交（Hybridization）:是指不同基因型的親本個體或細胞（指單細胞生物）交配而產(chǎn)生子代的過程。重組是分子水平上的概念，而雜交是細胞水平上的概念。雜交中必然含有重組，但重組則不限于雜交這一種形式。第四頁，共一百零四頁，2022年，8月28日第一節(jié)細菌、放線菌的接合及育種一、細菌的接合作用

接合（Conjugation）：指供體菌與受體菌的完整細胞經(jīng)過直接接觸而傳遞大段DNA（包括質(zhì)粒）遺傳信息的現(xiàn)象。第五頁，共一百零四頁，2022年，8月28日（一）接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)1946年，J.Lederberg和E.L.Tatum將來自E.coliK12的兩種營養(yǎng)缺陷型菌株混合培養(yǎng)，其遺傳標記如圖。結(jié)果在單獨培養(yǎng)的平板上無菌落，而在混合培養(yǎng)的平板上長出了原養(yǎng)型菌落。第六頁，共一百零四頁，2022年，8月28日對接合現(xiàn)象的解釋：（1）可能是細菌接合后發(fā)生基因重組的結(jié)果；（2）細菌并沒有接合，而是交換了DNA（轉(zhuǎn)化）；（3）細菌細胞并沒有接合，而是通過培養(yǎng)基交換了養(yǎng)料，即互養(yǎng)；（4）細菌細胞并沒有接合，而是親本細菌發(fā)生了回復突變的結(jié)果；（5）雖經(jīng)接合而未發(fā)生基因重組，只是形成異核體或雜合二倍體。第七頁，共一百零四頁，2022年，8月28日（二）接合作用的證明1、轉(zhuǎn)化作用的排除由于在報道接合試驗結(jié)果之前轉(zhuǎn)化實驗已經(jīng)是眾所周知，因此有人懷疑該結(jié)果是由轉(zhuǎn)化所導致的。1950年，設計了U形管實驗否定了這一推測（見右圖）第八頁，共一百零四頁，2022年，8月28日2、互養(yǎng)的排除營養(yǎng)缺陷型細菌通過培養(yǎng)基交換養(yǎng)料而產(chǎn)生的現(xiàn)象稱為互養(yǎng)。Lederberg和Tatum將培養(yǎng)過一種營養(yǎng)缺陷型細菌的培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌、過濾，然后加入到另一營養(yǎng)缺陷型菌培養(yǎng)物中。即使前一種菌在培養(yǎng)、滅菌、過濾之前曾發(fā)生過裂解，也不能是后一種菌產(chǎn)生原養(yǎng)型。第九頁，共一百零四頁，2022年，8月28日3、回復突變的排除若要發(fā)生兩種突變的回復突變，其幾率為10－12，這是不可能的。第十頁，共一百零四頁，2022年，8月28日4、異核體和雜合二倍體的排除A＋B—A—B＋A＋B—A—B＋A＋B＋異核體雜合二倍體單倍重組體異核體和雜合二倍體的遺傳性狀不穩(wěn)定，在傳代過程中會發(fā)生性狀分離，但事實恰恰相反，原養(yǎng)型菌落的基因型是穩(wěn)定的，證明是單倍重組體。第十一頁，共一百零四頁，2022年，8月28日（三）接合的機制1、接合作用中兩菌株性別的存在Lederberg和Tatum認為在兩個細菌的親本細胞在接合過程中起同等作用—即E.coli的性系統(tǒng)被認為是同宗配合。1952年，W.Hayes利用Lederberg和Tatum所做的雜交實驗，對（A）Met－Bio－（Sms或Smr）×（B）Thr－Leu－B1－（Smr或Sms）進行研究。結(jié)果表明，在雜交期間，兩品系所起的作用是不同的，是一種單向異宗配合過程，兩品系在獲得的同時發(fā)生了性別的變化。其中，供體品系相當于雄性，而受體品系相當于雌性。第十二頁，共一百零四頁，2022年，8月28日2、F因子的存在（1）E.coli的某些種（如品系A）記為F＋，帶有一個性因子，或致育因子F（fertilityfactor），而另一個不育型品系記作F－，記不帶有性因子；（2）雜交F＋×

F－是可育的，雜交F－×

F－是不育的；（3）F因子可以傳遞，從F＋到F－細菌，但必須通過細胞接觸；（4）F因子能夠自發(fā)喪失，一旦喪失就不再恢復，除非通過另一個F＋細胞在傳遞過來。F＋細胞經(jīng)低濃度的吖啶橙處理后喪失F因子，也會偶爾自發(fā)地或經(jīng)紫外線處理喪失。第十三頁，共一百零四頁，2022年，8月28日3、F因子及F＋細胞的特性F＋是一種可遺傳性狀，能夠自我復制，類似于染色體基因，但不是染色體基因，其轉(zhuǎn)移的頻率可高達70％以上。

F因子是獨立于染色體外的小型環(huán)狀DNA分子，具有自體復制及轉(zhuǎn)移到其他細胞中去的能力。大小約是細菌基因組DNA的2％，分子量為6.3×106d、94.5kb。整個基因組編碼94個蛋白質(zhì)，其中1／3的基因與接合作用有關。第十四頁，共一百零四頁，2022年，8月28日

F因子基因組有三個主要的基因叢，分別負責插入、復制和轉(zhuǎn)移的功能。A.轉(zhuǎn)移區(qū)（Transfer-region）：是一個操縱子，由22個基因組成，33kb，位于F因子結(jié)構圖的60～93kb之間。其中，traJ、A、L、E、N、B、W、V、C、U、F、H這些基因與性菌毛的合成與裝配有關；traY、Z、M、I、G、D等基因產(chǎn)物與DNA的轉(zhuǎn)移有關；traG和traN的基因產(chǎn)物與細菌結(jié)合有關；traS和traT的基因產(chǎn)物與表面排斥有關。第十五頁，共一百零四頁，2022年，8月28日B.復制區(qū)（replication-region）：位于F因子結(jié)構圖譜的40～49kb，包含一個特異的復制蛋白基因frp（Freplicationproteins）、決定不相容性基因inc（incompatibility）和一個復制起始點oriV（vegetativeoriginofreplication）。C.插入?yún)^(qū)（insertionregion）：位于F因子結(jié)構圖譜的93～17.6kb，包含四個插入序列，IS3有直接重復的兩個，另外兩個是IS2和，它們主要與F因子的整合、切除、易位有關。γδ第十六頁，共一百零四頁，2022年，8月28日F因子的主要表現(xiàn)型是細胞表面有性菌毛，即F＋細胞表面都有性菌毛。F性菌毛分布在大腸桿菌的表面，數(shù)目與F因子相當，長度為1～20um。

性菌毛的功能：A.是兩性細胞接合時轉(zhuǎn)移DNA的通道，又叫性纖毛橋（sexpilibridge）；B.又是特異phage吸附的部位。第十七頁，共一百零四頁，2022年，8月28日4、接合時DNA轉(zhuǎn)移的機制接合時DNA轉(zhuǎn)移的機制目前不詳，但可以確定的是：在接合時，性菌毛的存在是必需的。第十八頁，共一百零四頁，2022年，8月28日（四）F因子的三種存在形式1、F＋：F因子在細胞中以游離狀態(tài)存在。2、Hfr（highfrequencyofrecombination）:F因子在細胞中以整合狀態(tài)存在。Hfr與F＋的異同：（1）F＋與Hfr均能與F－菌株雜交；（2）F＋與Hfr均能合成細胞表面附屬物—性菌毛；（3）Hfr菌株總是從F＋菌株中得到，而F＋卻從未在Hfr菌株中得到過；（4）Hfr經(jīng)吖啶橙處理后性質(zhì)不變，而F＋經(jīng)吖啶橙處理后失去F因子；（5）Hfr與F－雜交后，F(xiàn)－性質(zhì)一般不會變；而F＋與F－雜交后，F(xiàn)－變?yōu)镕＋。第十九頁，共一百零四頁，2022年，8月28日3、F′：攜帶有部分核染色體基因的F′因子，含有F′因子的菌株稱為F′菌株。第二十頁，共一百零四頁，2022年，8月28日（五）三種“雄性”菌株與F－接合后的結(jié)果1、F＋

×F－2F＋由性菌毛將不同接合型的的細菌連在一起，并且在細胞間形成胞質(zhì)橋（也稱接合管）。在形成接合對以后，F(xiàn)＋菌的F因子進行DNA滾環(huán)復制。單鏈轉(zhuǎn)入F－菌，并合成新的互補鏈。第二十一頁，共一百零四頁，2022年，8月28日2、Hfr

×F－Hfr＋F－Hfr的染色體雙鏈中的一條鏈在F因子處發(fā)生斷裂，由環(huán)狀變?yōu)榫€狀，F(xiàn)因子則位于線狀單鏈DNA的末端，整段線狀染色體（單鏈）也以5′－末端引導，等速地轉(zhuǎn)移至F－細胞。通過接合而獲得新性狀的受體細胞稱為接合子。（conjugant）第二十二頁，共一百零四頁，2022年，8月28日第二十三頁，共一百零四頁，2022年，8月28日3、F′

×F－2F′Hfr菌株的F因子的反常切除所形成的F因子有兩種類型：I型：包含了染色體一個區(qū)域和不完全的F′因子。II型：帶有完整的F因子DNA和位于F因子插入兩端的染色體基因。第二十四頁，共一百零四頁，2022年，8月28日第二十五頁，共一百零四頁，2022年，8月28日F′菌的共同特征（1）I型F′一般攜帶的基因是Hfr上的末端，這部分基因在Hfr×

F－時是低頻轉(zhuǎn)移的，而在F′×

F－時卻是高頻轉(zhuǎn)移的。（2）II型F′菌使本來轉(zhuǎn)移頻率差異懸殊的兩部分基因具有相同的頻率。（3）F′菌的最大特點是能構建穩(wěn)定的部分二倍體。第二十六頁，共一百零四頁，2022年，8月28日F因子轉(zhuǎn)導：通過F′因子的轉(zhuǎn)移而使受體菌改變它的遺傳性狀的現(xiàn)象稱為F因子轉(zhuǎn)導或或性因子轉(zhuǎn)導或簡稱性導（Fduction或sexduction）擬表型菌：指表型上屬于F′而遺傳性上仍是F＋

的菌，也就是說表面沒有性菌毛，因而喪失了表面排斥性。第二十七頁，共一百零四頁，2022年，8月28日第二十八頁，共一百零四頁，2022年，8月28日（六）中斷雜交實驗原理：

如果人為地中斷正在基因轉(zhuǎn)移的雜交對，然后測定受體菌里遺傳標記重組頻率，就能知道基因連鎖情況。第二十九頁，共一百零四頁，2022年，8月28日1957年，和F.Jocob設計了中斷雜交實驗。供體菌Hfr，受體菌F－thr－leu－lac－gal－azirtonrstrr，將大約10倍的F－菌和Hfr對數(shù)期菌混合，輕輕振蕩培養(yǎng)，在不同時間間隔取樣，在組織攪拌器中劇烈振蕩后，將培養(yǎng)物經(jīng)適當稀釋后，涂布在含鏈霉素且以葡萄糖作為碳源的基本培養(yǎng)基上進行選擇。第三十頁，共一百零四頁，2022年，8月28日中斷雜交實驗第三十一頁，共一百零四頁，2022年，8月28日中斷雜交實驗的結(jié)果：基因是以ori、thr、leu、azi、ton、lac、gal的順序連續(xù)轉(zhuǎn)移的。在這個實驗中，對Hfr菌的條件是，str基因在整個待測順序的后端，如果strs基因率先進入受體，獲得的重組體將在第一次選擇性培養(yǎng)基上被str殺死。另外，thr、leu選擇性標記應位于前端，如位于后端則無法測序。第三十二頁，共一百零四頁，2022年，8月28日二、放線菌的接合作用（一）放線菌基因重組的發(fā)現(xiàn)1955年，Sermonti夫婦在天蘭色鏈霉菌（streptomycescoelicoler）ISS株中首次發(fā)現(xiàn)通過遺傳性交換而產(chǎn)生的重組，接著，Hopwood也用S.coelicolerA3(2)發(fā)現(xiàn)了同樣的重組。第三十三頁，共一百零四頁，2022年，8月28日（二）放線菌的性別1、三種性別原始致育型（IF，initialfertility）：相當于E.coli的F＋正常致育型（NF，normalfertility）：相當于E.coli的Hfr超致育型（UF，ultrafertility）：相當于E.coli的F－第三十四頁，共一百零四頁，2022年，8月28日2、認為IF相當于E.coli的F＋、UF相當于E.coli的F－的理由（1）IF以0.3％的頻率轉(zhuǎn)變?yōu)閁F，在經(jīng)uv處理的IF群體中曾經(jīng)得到作為受體高度可育的UF菌株，這種情況類似于從F＋菌株中得到F－菌株；（2）IF×UF雜交中，UF受體菌株全部轉(zhuǎn)變?yōu)镮F，而染色體基因重組頻率大約為10－4，兩者相差萬倍。這種情況與F＋×

F－相似。第三十五頁，共一百零四頁，2022年，8月28日3、認為NF相當于Hfr的理由（1）IF和NF都產(chǎn)生對于UF菌株具有抑制作用的次甲霉素，而UF菌株則不產(chǎn)生這一抗菌素；（2）IF×UF雜交子代全部都是IF，這種轉(zhuǎn)變和染色體基因轉(zhuǎn)移無關，但是NF×UF雜交則不同，UF轉(zhuǎn)變?yōu)镹F都伴隨著染色體重組；（3）NF菌株來自IF或是IF的雜交子代，與E.coli中的一樣。第三十六頁，共一百零四頁，2022年，8月28日（三）放線菌的致育因子經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)在S.coelicoler中存在著一種稱為Scp1的致育因子。Scp1和F因子一樣也是一種質(zhì)粒，具有轉(zhuǎn)移性，在自身轉(zhuǎn)移的同時還能夠帶動染色體進行轉(zhuǎn)移。此外Scp1還帶有與產(chǎn)生次甲霉素有關的基因，Scp1屬于附加體質(zhì)粒。第三十七頁，共一百零四頁，2022年，8月28日（四）天蘭色鏈霉菌三種致育類型與大腸桿菌的三種致育類型之間的區(qū)別1、大腸桿菌中F－×

F－是不育的，但在天蘭色鏈霉菌中UF

×

UF是可育的，只是頻率較低，說明還有另外一種致育因子的存在；2、大腸桿菌中F＋×

F＋或Hfr×Hfr雜交的可育性很低，除非使其中一個成為

F－的擬表型，但在天蘭色鏈霉菌中NF×NF和IF×IF雜交中一部分是高度可育的；3、大腸桿菌中F＋×

F－的子代都是F－而Hfr×

F－的子代都是F－，但在天蘭色鏈霉菌中IF×UF的子代是IF，NF×UF的子代也是NF。第三十八頁，共一百零四頁，2022年，8月28日三、采用接合技術育種Hfr細菌和F－細菌接觸帶來兩個細菌細胞的接合和染色體從Hfr細菌向F－細菌轉(zhuǎn)移。因此，接合雜交是確定特定基因的粗略位置的有效方法，也是育種的一種手段。一般采用液體接合培養(yǎng)法，在接合時注意通氣和選擇標記。選擇性標記可以用抗性標記，也可以用營養(yǎng)缺陷型。第三十九頁，共一百零四頁，2022年，8月28日第二節(jié)轉(zhuǎn)化與育種轉(zhuǎn)化（transformation）：受體細胞直接吸收來自供體細胞的離體DNA片段，并通過交換把它整合到自己的基因組中，從而獲得了供體細胞的某些遺傳性狀的現(xiàn)象。獲得新性狀的受體稱為轉(zhuǎn)化子（transformant）。＊轉(zhuǎn)化不是兩個細胞的直接接觸，而是供體細胞的離體DNA與受體細胞直接接觸而轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)。第四十頁，共一百零四頁，2022年，8月28日一、轉(zhuǎn)化過程轉(zhuǎn)化包括兩個基本過程（1）從供體菌中提取遺傳物質(zhì)DNA并轉(zhuǎn)移到受體中；（2）供體的遺傳物質(zhì)在受體中的作用。第四十一頁，共一百零四頁，2022年，8月28日第四十二頁，共一百零四頁，2022年，8月28日第四十三頁，共一百零四頁，2022年，8月28日第四十四頁，共一百零四頁，2022年，8月28日第四十五頁，共一百零四頁，2022年，8月28日（一）轉(zhuǎn)化DNA的特點1、轉(zhuǎn)化子的數(shù)目與DNA濃度的關系在一定條件下轉(zhuǎn)化子的數(shù)目與轉(zhuǎn)化DNA的濃度成正比。細菌生長量每毫升中轉(zhuǎn)化子數(shù)1041051031021022040608010012010100培養(yǎng)時間每毫升中轉(zhuǎn)化子數(shù)10－310－210－1DNA轉(zhuǎn)化的飽和濃度第四十六頁，共一百零四頁，2022年，8月28日2、DNA片段的大小與轉(zhuǎn)化子數(shù)目的關系對于轉(zhuǎn)化作用來說，轉(zhuǎn)化DNA片段必須具有一定的大小。一般認為，轉(zhuǎn)化DNA片段的大小沒有上限，但是在制備轉(zhuǎn)化子過程中，往往人工打斷供體DNA分子，獲得的片段約107dal（大約10個基因左右）。在受體細胞攝取DNA時，可能還會進一步斷裂，所以僅僅有大約0.5％的供體基因組能夠進入受體細胞。能發(fā)生轉(zhuǎn)化作用的核苷酸鏈至少不低于450bp。第四十七頁，共一百零四頁，2022年，8月28日3、單雙鏈DNA與轉(zhuǎn)化活性的關系單鏈DNA的轉(zhuǎn)化活性低，而雙鏈DNA的轉(zhuǎn)化活性高。因而，DNA完整的雙鏈結(jié)構對于轉(zhuǎn)化活性來說是必要的。第四十八頁，共一百零四頁，2022年，8月28日4、轉(zhuǎn)化DNA的命運大量的實驗證明，在轉(zhuǎn)化作用中遺傳重組是由供體的單鏈序列取代了受體DNA的單鏈序列，使受體的DNA標記變成了供體的遺傳標記，并恒定表達，遺傳給它的后代。第四十九頁，共一百零四頁，2022年，8月28日（二）受體細胞的特點1、受體細胞的感受態(tài)（1）概念

只有在某一特定條件下培養(yǎng)的部分細胞才有吸收DNA的能力，這種細胞稱為感受態(tài)細胞。這種感受態(tài)細胞所處的狀態(tài)稱為感受態(tài)（competence）。第五十頁，共一百零四頁，2022年，8月28日（2）感受態(tài)的特點和影響因素特點：感受態(tài)不是一種透性特征，而是在適當?shù)纳L條件下獲得的一種生理特征影響因素：受菌齡的影響：一般認為感受態(tài)出現(xiàn)在細菌生長對數(shù)期的后期；受遺傳因素的影響；受環(huán)境條件的影響。第五十一頁，共一百零四頁，2022年，8月28日2、感受態(tài)的比例不同的細菌的感受態(tài)的比例是不同的，一般為10％～20％。3、感受態(tài)可在細胞間轉(zhuǎn)移第五十二頁，共一百零四頁，2022年，8月28日4、感受態(tài)因子（CF）1963年，R.Pakula和W.Walczak首次從鏈球菌中分離得到；1972年，Leonard和Cale純化的一種蛋白質(zhì)，稱為CF。該蛋白質(zhì)在感受態(tài)轉(zhuǎn)移中起作用。在感受態(tài)細胞表面存在著一種特定的抗原，而非感受態(tài)細胞則沒有這種抗原。細菌細胞在特定的時期產(chǎn)生一種感受態(tài)因子（CF），CF與膜上的受體結(jié)合，刺激核內(nèi)DNA產(chǎn)生另一個蛋白——自溶素（Autolysin），自溶素轉(zhuǎn)運至細胞膜和細胞壁之間的周質(zhì)內(nèi)作用于細胞膜，并改變膜的成分，使細胞膜便于DNA的吸收。第五十三頁，共一百零四頁，2022年，8月28日二、轉(zhuǎn)化過程的基因重組及育種（一）轉(zhuǎn)化技術用于基因定位在轉(zhuǎn)化過程中，兩個連鎖的基因可以同時轉(zhuǎn)化，但能夠同時轉(zhuǎn)化的基因卻不一定是連鎖的，因為包含這兩個基因的DNA片段可以同時被受體細菌所吸收。第五十四頁，共一百零四頁，2022年，8月28日如果a+和b+是連鎖的，那么當DNA濃度下降時，a+b+轉(zhuǎn)化頻率的下降與a+或b+的轉(zhuǎn)化頻率下降相同；相反，如果a+和b+并不連鎖，那么a+b+轉(zhuǎn)化頻率下降將遠遠超過a+或b+的轉(zhuǎn)化頻率。這是因為在DNA低濃度范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)生與DNA的濃度成正比。當a+、

b+兩個基因位于同一DNA片段上是，a+b+轉(zhuǎn)化子與DNA濃度成正比的增加；當a+b+基因分別位于不同的DNA片段上是，在一定的DNA濃度內(nèi)，a+b+轉(zhuǎn)化子與DNA濃度的平方成正比。通過這樣的實驗檢測轉(zhuǎn)化基因的連鎖情況可以方便的繪制出遺傳圖譜。第五十五頁，共一百零四頁，2022年，8月28日以trp+和tyr+DNA作為供體q＝trp+tyr—＋trp—tyr+trp+tyr—trp+tyr+trp—tyr+＋＋第五十六頁，共一百零四頁，2022年，8月28日共轉(zhuǎn)指數(shù)：如將DNA加入到受體菌中，會產(chǎn)生、和三種轉(zhuǎn)化子，將型轉(zhuǎn)化子在其中所占的比例稱為共轉(zhuǎn)指數(shù)（cotransferindex）共轉(zhuǎn)指數(shù)＝a+b+＋＋a+b+a－b+a+b－第五十七頁，共一百零四頁，2022年，8月28日（二）轉(zhuǎn)化育種利用在轉(zhuǎn)化過程中供體菌可將遺傳性狀傳遞給受體菌的這種特性，育種工作者可以采用轉(zhuǎn)化的方法達到育種的目的。第五十八頁，共一百零四頁，2022年，8月28日第三節(jié)轉(zhuǎn)導與育種一、轉(zhuǎn)導的概念通過完全缺陷或部分缺陷的噬菌體為媒介，把供體細胞的DNA片段攜帶到受體細胞中，通過交換和整合，從而使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)導（transduction）。獲得新性狀的受體細胞就稱為轉(zhuǎn)導子（transductant）。轉(zhuǎn)導有兩種類型，即普遍轉(zhuǎn)導和局限轉(zhuǎn)導。第五十九頁，共一百零四頁，2022年，8月28日二、轉(zhuǎn)導現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)及證明1952年，N.Zinder和Lederberg在研究鼠傷寒沙門氏菌遺傳重組時，采用兩種營養(yǎng)缺陷型菌：LA2:phe+trp+met－h(huán)is－LA22:phe－trp－met+his+在將兩者混合培養(yǎng)后獲得了原養(yǎng)型。同時，再將兩者放入Davis管中培養(yǎng)時仍出現(xiàn)重組體，這就證明在兩株菌之間有一種過濾性因子起作用。第六十頁，共一百零四頁，2022年，8月28日過濾性因子是噬菌體（phage）的證明：過濾性因子不會因DNase處理而失去活性，說明它不是裸露在溶液中的DNA，故可以排除轉(zhuǎn)化作用，另外由于兩個菌是隔離培養(yǎng)的因而也可以排除接合作用；過濾性因子與從溶源性菌分離到的噬菌體P22具有相同大小的質(zhì)量；用抗P22的血清或加熱處理，使P22的感染性和過濾性因子的功能失活的速率相同；抗P22的沙門氏菌菌株同時也對過濾性因子表現(xiàn)為抗性。因此可以證明：過濾性因子就是溫和型噬菌體P22。第六十一頁，共一百零四頁，2022年，8月28日三、普遍性轉(zhuǎn)導（generalizedtransduction）

通過完全缺陷的phage對供體菌任何DNA小片段的“誤包”，而實現(xiàn)其遺傳性狀傳遞至受體菌的轉(zhuǎn)導現(xiàn)象，稱為普遍性轉(zhuǎn)導。第六十二頁，共一百零四頁，2022年，8月28日第六十三頁，共一百零四頁，2022年，8月28日第六十四頁，共一百零四頁，2022年，8月28日（一）完全普遍轉(zhuǎn)導噬菌體在進行包裝時，有極少數(shù)phage（10－6～10－8）的衣殼將與頭部DNA相仿的一小段供體DNA片段誤包在內(nèi)，形成完全不含phage自身DNA的假噬菌體，這種假噬菌體稱為完全缺陷噬菌體。由完全缺陷噬菌體介導的普遍性轉(zhuǎn)導稱為完全普遍轉(zhuǎn)導。第六十五頁，共一百零四頁，2022年，8月28日（二）流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導簡稱流產(chǎn)轉(zhuǎn)導（abortivetransduction）。經(jīng)轉(zhuǎn)導而獲得了供體菌DNA片段的受體菌，如果其外源DNA在體內(nèi)既不進行交換、整合、復制，也不迅速消失，而進行轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯及性狀表達，這種現(xiàn)象稱為流產(chǎn)轉(zhuǎn)導。

流產(chǎn)轉(zhuǎn)導的受體菌可以在選擇性培養(yǎng)基上形成微小的菌落。第六十六頁，共一百零四頁，2022年，8月28日四、局限性轉(zhuǎn)導（specializedtransduction）指通過部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并獲得表達的轉(zhuǎn)導現(xiàn)象。特點：1、只能是個別特定基因；2、該特定基因由部分缺陷噬菌體攜帶；3、缺陷噬菌體是由于在其形成過程中所發(fā)生的低頻率“誤切”或由于雙重溶源菌的裂解而形成。

第六十七頁，共一百零四頁，2022年，8月28日第六十八頁，共一百零四頁，2022年，8月28日局限轉(zhuǎn)導第六十九頁，共一百零四頁，2022年，8月28日第七十頁，共一百零四頁，2022年，8月28日（一）低頻轉(zhuǎn)導（LFT，lowfrequencytransduction）由于宿主染色體上進行不正常的切離的頻率極低，因此在裂解物中所含的部分缺陷phage的比例也極低。這種裂解物稱為LFT裂解物。LFT裂解物在低m.o.i.情況下感染宿主，可獲得極少量的局限轉(zhuǎn)導，這就是低頻轉(zhuǎn)導。m.o.i.：稱作感染復數(shù)，是指每一個敏感細胞所能吸附的相應phage的數(shù)量。第七十一頁，共一百零四頁，2022年，8月28日（二）高頻轉(zhuǎn)導（HFT，highfrequencytransduction）雙重溶源菌：在高m.o.i.情況下，受體菌會同時吸附缺陷型phage和完整phage，并且可以同時整合在受體菌的核染色體組上，這時的受體菌稱為雙重溶源菌。此時，正常的phage稱為助體phage。由雙重溶源菌形成的裂解物稱為HFT裂解物。高頻轉(zhuǎn)導：用低m.o.i.的HFT裂解物去感染受體細胞，則可高頻率的發(fā)生局限轉(zhuǎn)導，這就是高頻轉(zhuǎn)導。第七十二頁，共一百零四頁，2022年，8月28日五、轉(zhuǎn)導用于基因定位普遍性轉(zhuǎn)導噬菌體通?？梢杂糜诶L制供體菌遺傳圖譜。應用于基因定位的共轉(zhuǎn)導現(xiàn)象：

P1噬菌體的基因組約為染色體長度的2.4％，P1噬菌體感染E.coli后可以隨意包裹寄主DNA片段，只要這個片段包含的基因座位不超過E.coli遺傳圖譜的兩分鐘距離，均可一起被轉(zhuǎn)導，這是一般用接合和轉(zhuǎn)化作用來進行基因定位所難以實現(xiàn)的，對細菌染色體小片段的精細結(jié)構十分有用。兩個鄰近的基因一起被轉(zhuǎn)導的現(xiàn)象稱為共轉(zhuǎn)導（co－transduction)。第七十三頁，共一百零四頁，2022年，8月28日當轉(zhuǎn)導的DNA片段進入受體后，與受體同源分子進行重組，當另一個基因的標記被選擇時，那么另一個鄰近基因的發(fā)現(xiàn)頻率隨著它們二者之間距離的減少而增大，這個頻率稱為共轉(zhuǎn)導頻率（cotransductionfrequency）。用下式表示：

F＝（1－d／L）3

d為兩個基因之間的距離，L是P1基因組或轉(zhuǎn)導片段長度（在遺傳圖譜上用分鐘表示）。比如：有兩個基因的共轉(zhuǎn)導頻率是65％，L為2分鐘（約76kb）。這兩個基因之間的距離為0.26分鐘（約10kb）。第七十四頁，共一百零四頁，2022年，8月28日六、轉(zhuǎn)導育種利用轉(zhuǎn)導法選育目的菌，首要的任務是要獲得轉(zhuǎn)導噬菌體。轉(zhuǎn)導噬菌體的獲得：噬菌體侵染供體菌后，在感染末期，少數(shù)噬菌體會將供體菌的DNA誤認為是它們自己的DNA，并以其外殼蛋白將細菌DNA包圍起來，從而形成轉(zhuǎn)導噬菌體。由于細菌DNA的任何部分都可以被包裝，因此，要獲得目的轉(zhuǎn)導子必須要通過那些選擇性標記。第七十五頁，共一百零四頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)導育種的過程操作過程如下：

先將供體菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，然后向其中加入噬菌體，繼續(xù)培養(yǎng)是一部分供體菌發(fā)生裂解反應而釋放出轉(zhuǎn)導噬菌體。加入氯仿以殺死仍活著的供體菌，待完全溶菌后低速離心以除去菌體殘渣，上清液經(jīng)Dnase處理和微孔濾膜除菌后，即制成供體菌裂解液。將受體菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，向其中加入供體菌裂解液，待轉(zhuǎn)導噬菌體吸附后，低速離心收集菌體。將該菌體轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)即可從中獲得目的轉(zhuǎn)導子。首先要進行噬菌體效價的測定。所謂噬菌體效價就是1ml培養(yǎng)液中含有活噬菌體的數(shù)目。第七十六頁，共一百零四頁，2022年，8月28日第四節(jié)微生物原生質(zhì)體融合和育種一、原生質(zhì)體融合的概念所謂原生質(zhì)體融合，就是將雙親株的微生物細胞分別通過酶解脫壁，使之成為原生質(zhì)體。然后在高滲的條件下混合，并加入物理的、化學的、生物的助融條件，使雙親株的原生質(zhì)體間發(fā)生相互凝集。通過細胞質(zhì)融合、核融合，而后發(fā)生基因組間的交換、重組，進而可以在適宜的條件下再生出微生物的細胞壁來，從而獲得重組子的過程。第七十七頁，共一百零四頁，2022年，8月28日

狹義的原生質(zhì)體（protoplast）即細胞壁被徹底酶解完全脫壁后形成的

1、原生質(zhì)體

廣義的原生質(zhì)體既包括狹義的原生質(zhì)體也包括不完全脫壁后形成的圓球體（spheroplast）

物理的：瞬時高壓的交變電場或激光等2、助融條件化學的：聚乙二醇、二甲亞砜、伴刀豆球蛋白A、磷脂酰絲氨酸、溶血卵磷脂等

生物的：仙臺病毒、雞新城疫病毒、等關于原生質(zhì)體概念的解釋：第七十八頁，共一百零四頁，2022年，8月28日二、原生質(zhì)體融合在生物工程中的地位生物工程（biotechnology）細胞工程基因工程酶工程發(fā)酵工程固定化細胞基因體外重組染色體移植或引入細胞器移植核移植固定化酶酶分子的改造和修飾發(fā)酵自動化產(chǎn)品后處理泛指遺傳工程組織培養(yǎng)原生質(zhì)體融合第七十九頁，共一百零四頁，2022年，8月28日1、原生質(zhì)體融合是一種更為廣泛，更為隨機的基因重組方式；2、原生質(zhì)體融合方式，可以打破微生物的種屬界限，實現(xiàn)遠緣菌株間的基因重組；3、原生質(zhì)體融合可以使遺傳物質(zhì)傳遞更為完全，可以獲得更多基因重組的機會，有利于提高育種速度；4、借助融合劑可同時將幾個親本的原生質(zhì)體隨即融合在一起，從而獲得綜合幾個親本性狀的重組體，加速育種進程；5、原生質(zhì)體融合可以和其它育種方法相結(jié)合，把從其它方法得到的優(yōu)良性狀通過原生質(zhì)體融合在組合到一個單株中，提高菌株產(chǎn)量的幾率增大；三、原生質(zhì)體融合及原生質(zhì)體技術的理論與實踐意義第八十頁，共一百零四頁，2022年，8月28日6、原生質(zhì)體融合可以大大提高遺傳重組的頻率；7、在生產(chǎn)菌種的選育中，可以應用具有較高產(chǎn)量性狀的菌株作為融合時出發(fā)菌株，以期達到理想育種的目的；8、可以應用滅活的原生質(zhì)體進行融合，從而提高篩選效率，省去育種過程中對親株的遺傳標記，省去人力、物力和時間，也可防止因增加標記而降低出發(fā)菌株的產(chǎn)量；9、原生質(zhì)體技術有助于建立工業(yè)微生物的轉(zhuǎn)化體系，開辟新的育種途徑；10、對微生物制備原生質(zhì)體后直接再生育種、原生質(zhì)體誘變后再生育種、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化育種、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)導育種、原生質(zhì)體固定化等原生質(zhì)體技術在微生物育種與工業(yè)生產(chǎn)中近年來已日趨廣泛開展；11、在理論上，微生物的原生質(zhì)體融合可用于研究噬菌體與寄主間的關系，深入了解溶源機理及免疫因子和存在部位；研究原噬菌體的DNA在寄主染色體上的結(jié)合位點；第八十一頁，共一百零四頁，2022年，8月28日12、在細胞學研究方面，通過原生質(zhì)體融合，有助于研究核質(zhì)關系及細胞質(zhì)遺傳問題；13、微生物原生質(zhì)體融合，可用于遺傳性分析等理論研究。第八十二頁，共一百零四頁，2022年，8月28日

（1）標記菌株的篩選；（2）原生質(zhì)體的制備；（3）原生質(zhì)體的再生；（4）原生質(zhì)體的融合；（5）融合子的選擇；（6）實用型菌株的篩選。四、原生質(zhì)體融合育種的基本程序原生質(zhì)體融合一般包括如下步驟：第八十三頁，共一百零四頁，2022年，8月28日BAABa+b-a-b+菌株標記細胞壁溶菌酶AB細胞膜加PEG混合融合的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)再生平皿2BA134篩選融合子溫浴穩(wěn)定高產(chǎn)重組子標記的營養(yǎng)體細胞原生質(zhì)體1－a+b-2－a+b+3－a-b-4－a-b+原生質(zhì)體的形成融合CW再生穩(wěn)定正變株的篩選細胞原生質(zhì)體融合程序示意圖第八十四頁，共一百零四頁，2022年，8月28日（一）標記菌株的篩選在原生質(zhì)體融合過程中，為了便于篩選，通常對于所用的親株都要進行一定的遺傳標記。

一般可以采用營養(yǎng)缺陷標記和抗藥性標記。第八十五頁，共一百零四頁，2022年，8月28日（二）原生質(zhì)體的制備

在細菌和放線菌中主要采用溶菌酶；在酵母菌和霉菌中一般可用蝸牛酶和纖維素酶。第八十六頁，共一百零四頁，2022年，8月28日影響原生質(zhì)體制備的因素1、菌體的預處理為了使酶的作用效果更好一些，可對菌體進行預處理，包括菌體培養(yǎng)階段的預處理和酶解前的預處理。對于細菌可加入甘氨酸、青霉素和D－環(huán)絲氨酸等，對于放線菌可以使用甘氨酸（1－4％）等，在酵母菌中加入EDTA和巰基乙醇等。

第八十七頁，共一百零四頁，2022年，8月28日2、菌體的培養(yǎng)時間

為了使菌體易于原生質(zhì)體化，一般選擇對數(shù)生長期的菌體。一般對于細菌采用對數(shù)生長期后期為好，對于放線菌采用對數(shù)生長期與穩(wěn)定期之間的轉(zhuǎn)換期最為合適。第八十八頁，共一百零四頁，2022年，8月28日3、酶濃度一般來講，酶濃度增加，原生質(zhì)體形成率增加，但是超過一定范圍，則原生質(zhì)體形成率增加的效果不明顯；酶濃度過低，則導致原生質(zhì)體再生率下降。通常，采用當原生質(zhì)體形成率和再生率之積達到最大時的酶濃度作為最佳酶濃度。第八十九頁，共一百零四頁，2022年，8月28日4、酶解溫度

溫度對酶解作用有雙重影響。一方面，隨著溫度的提高，酶解反應速度加快；另一方面，隨著溫度的增加，酶蛋白逐漸變性而失活。因此，最適溫度是這兩方面的共同結(jié)果。一般在選擇最佳溫度時，除了考慮酶的最適溫度外，還要以原生質(zhì)體再生率加以校正。第九十頁，共一百零四頁，2022年，8月28日5、酶解時間原生質(zhì)體的制備質(zhì)量與酶解時間有密切的關系。酶解時間過短，原生質(zhì)體形成不完全，結(jié)果會影響到融合；酶解時間過長，原生質(zhì)體脫壁太完全，原生質(zhì)體的質(zhì)膜也會受到損傷，從而會影響到再生，最終也不利于融合。因此，選擇一個最適的酶解時間對于原生質(zhì)體融合是非常重要的。第九十一頁，共一百零四頁，2022年，8月28日6、原生質(zhì)體制備液（滲透壓穩(wěn)定劑）

高滲透壓在原生質(zhì)體制備中不僅起到保護原生質(zhì)體免于膨脹作用，而且有助于酶與底物的結(jié)合。滲透壓穩(wěn)定劑的選擇：細菌－蔗糖、丁二酸鈉、NaCl等酵母菌－山梨醇、甘露醇等霉菌－KCL、NaCl等

滲透壓穩(wěn)定劑的濃度一般采用0.3～0.8％mol/L。第九十二頁，共一百零四頁，2022年，8月28日原生質(zhì)體形成率＝破壁前菌數(shù)－剩余菌數(shù)破壁前菌數(shù)×100％原生質(zhì)體形成率的計算第九十三頁，共一百零四頁，2022年，8月28日（三）原生質(zhì)體的再生

一般在進行原生質(zhì)體再生時，采用含有滲透壓穩(wěn)定劑的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。滲透壓穩(wěn)定劑的選擇同制備時是一樣的。原生質(zhì)體的再生是一個復雜的過程，其影響因素有很多，包括菌體本身的再生特性、原生質(zhì)體制備的條件、再生培養(yǎng)基的成分、再生培養(yǎng)條件等等。第九十四頁，共一百零四頁，2022年，8月28日原生