實(shí)驗(yàn)二培養(yǎng)材料消毒和接種

實(shí)驗(yàn)二培養(yǎng)材料消毒和接種第一頁，共二十五頁，2022年，8月28日一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握植物組織培養(yǎng)中的無菌操作技術(shù)2、掌握植物外植體表面消毒的常規(guī)方法第二頁，共二十五頁，2022年，8月28日操作前的準(zhǔn)備工作接種室在接種前4-5d必須通風(fēng)換氣。在接種前一天對接種室進(jìn)行全面消毒，一般用40%福爾馬林進(jìn)行全面噴霧，并密閉24h，然后打開換氣窗10-15min.。

第三頁，共二十五頁，2022年，8月28日A:實(shí)驗(yàn)器具和材料的準(zhǔn)備

B:用75%的酒精擦拭超凈工作臺，然后室內(nèi)及超凈工作臺用紫外燈殺菌20min-30min。注意：臺面上的用品不要放置太多或重疊放置，以免降低滅菌效果。

C:關(guān)紫外燈、打開風(fēng)機(jī)，過5-10min進(jìn)入緩沖間，以75%洗手和手臂，更換無菌服、帽子和口罩。進(jìn)入接種室。（注：沒有特別情況，盡量不要下工作臺）

第四頁，共二十五頁，2022年，8月28日D:用70－75％乙醇消毒雙手。試驗(yàn)用具也應(yīng)該用酒精消毒。點(diǎn)燃酒精燈，將金屬器械在其火焰上灼燒，冷卻待用。

注意：所有操作應(yīng)在火焰近處并經(jīng)過灼燒進(jìn)行。移液管不能灼燒，培養(yǎng)瓶口、塑料材料、橡膠材料過火焰不能時間太長。

第五頁，共二十五頁，2022年，8月28日接種時在近火焰處打開瓶口，使瓶傾斜，以免空氣中微生物落入瓶中

錯

誤

第六頁，共二十五頁，2022年，8月28日整個接種操作應(yīng)在近火焰處進(jìn)行，且動作要迅速

正

確

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第七頁，共二十五頁，2022年，8月28日接種過程中盡可能達(dá)到懸空要求防止操作帶來的污染

正

確

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第八頁，共二十五頁，2022年，8月28日培養(yǎng)器材的清洗與滅菌在細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)中，離體細(xì)胞對任何毒性物質(zhì)都十分敏感。毒性物質(zhì)包括解體的微生物和細(xì)胞殘余物以及非營養(yǎng)的化學(xué)物質(zhì)。某些化學(xué)物質(zhì)僅0.01μg/L就會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，因此對培養(yǎng)器皿的清洗是組織培養(yǎng)中一項(xiàng)極為重要的環(huán)節(jié)。第九頁，共二十五頁，2022年，8月28日A、新購買的玻璃儀器表面常附著有游離的堿性物質(zhì)，可先用0.5％的去污劑洗刷，再用自來水洗凈，然后浸泡在1％～2％鹽酸溶液中過夜（不可少于四小時），再用自來水沖洗，最后用無離子水沖洗兩次，在100℃～120℃烘箱內(nèi)烘干備用。

第十頁，共二十五頁，2022年，8月28日B、使用過的玻璃儀器的清洗

先用自來水洗刷至無污物，再用合適的毛刷沾去污劑（粉）洗刷，然后用自來水徹底洗凈去污劑，用無離子水洗兩次，烘干備用。清洗后器皿內(nèi)外不可掛有水珠，否則重洗.C、金屬用品洗滌

金屬用品一般不宜用各種洗滌液洗滌（新的可以用熱洗衣粉水洗凈），需要清洗時，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥

第十一頁，共二十五頁，2022年，8月28日（1）干熱滅菌

適用于玻璃器皿和金屬器械的滅菌。操作方法：150℃、40min（2）濕熱滅菌

適用于各種器皿、培養(yǎng)基、器皿、蒸餾水、棉塞、紙等。121℃維持20~30min

第十二頁，共二十五頁，2022年，8月28日（3）過濾滅菌培養(yǎng)基中某些成分遇到高溫分解（如某些生長調(diào)節(jié)劑GA3、玉米素等），就需要過濾滅菌。滅菌方法：將生長調(diào)節(jié)劑或酶配成一定濃度，用注射器注入微孔濾膜慮。制培養(yǎng)基時，現(xiàn)將培養(yǎng)基高壓滅菌，待降至50℃左右時，加入適量的激素。第十三頁，共二十五頁，2022年，8月28日（4）射線滅菌

主要是利用紫外燈進(jìn)行照射，適合實(shí)驗(yàn)室空氣、操作臺等，滅菌時間20-30min。

注意：關(guān)燈后5min后再進(jìn)入。超凈工作臺關(guān)燈后要打開風(fēng)機(jī)、（5）火焰灼燒滅菌

用火焰灼燒達(dá)到滅菌目的，適用于接種器皿的滅菌。

第十四頁，共二十五頁，2022年，8月28日（6）消毒劑

適用外植體、實(shí)驗(yàn)器皿、操作表面、皮膚等。

幾種常用消毒劑的效果比較消毒劑使用濃度(%)消毒時間(min.)效果殘液去除難易乙醇70-750.1-3好易新潔爾滅10～205～30好易氯化汞0.1～12～15最好最難過氧化氫10～125～15較好最易抗菌素4～50mgl-130～60較好較難次氯酸鈣/納9～105～30好易第十五頁，共二十五頁，2022年，8月28日二、實(shí)驗(yàn)原理用于進(jìn)行組織培養(yǎng)的組織、器官和細(xì)胞稱為外植體。在組織培養(yǎng)中，外植體如果是帶菌的，在接種前都必須進(jìn)行表面消毒，這是取得培養(yǎng)成功的最基本的和重要的前提。常用消毒劑對外植體進(jìn)行消毒。從室外取的材料，一般先用自來水沖洗數(shù)分鐘.第十六頁，共二十五頁，2022年，8月28日接種材料使用消毒劑后，要用無菌水洗滌3～5遍，最后用無菌紙擦干凈。使用消毒劑的原則是既要達(dá)到消毒目的，又不能損傷植物組織和細(xì)胞，還要符合就地取材的原則。對一些容易污染、較難滅菌的外植體進(jìn)行表面消毒時，用單一消毒劑不能收到好的效果，所以常選用兩種消毒劑交替浸泡法。第十七頁，共二十五頁，2022年，8月28日一般，首先用75％乙醇浸泡外植體數(shù)秒鐘至30s，然后置于0.1％氯化汞溶液5～10min或含有2％活性氧的次氯酸鈉溶液5～30min，然后用無菌水洗滌。有時在氯化汞或次氯酸鈉滅菌后，用無菌水洗，進(jìn)一步剝?nèi)讓咏M織或器官如葉片后，再用次氯酸鈉滅菌3～5min，無菌水漂洗3次后，切割、用于接種。

消毒溶液對外植體消毒是在超凈工作臺上進(jìn)行。完成表面消毒的接種材料要盡快放置于培養(yǎng)基中。

第十八頁，共二十五頁，2022年，8月28日三、實(shí)驗(yàn)材料器材：超凈工作臺、鑷子、酒精燈、脫脂棉、燒杯、廣口瓶、培養(yǎng)皿。藥品及材料：0.1%升汞、酒精、次氯酸鈉、無菌水、綠豆種子、培養(yǎng)基。第十九頁，共二十五頁，2022年，8月28日四、實(shí)驗(yàn)步驟（1）準(zhǔn)備好培養(yǎng)基，無菌水，培養(yǎng)皿及接種工具。（2）將培養(yǎng)基、無菌水、接種工具置于接種臺上，打開超凈臺紫外燈開關(guān)，照射至少20分鐘，關(guān)閉臺內(nèi)的紫外燈，通風(fēng)五分鐘后，再開日光燈進(jìn)行無菌操作。（3）接種前用肥皂洗手，特別是將手指洗凈，然后用沾有75%酒精的棉球把手消毒一次。（4）將綠豆種子在流水下沖洗干凈。第二十頁，共二十五頁，2022年，8月28日（5）將種子放于廣口瓶中，用75%的酒精溶液浸泡30s，無菌水沖洗，然后用0.1%升汞溶液浸泡3、5、10min，期間不斷搖動溶液，用無菌水洗滌5遍待用。（6）取出培養(yǎng)皿，有必要的話可以用沾有75%的酒精的棉球把皿表面擦一下。第二十一頁，共二十五頁，2022年，8月28日（7）接種用的鑷子使用前插入95%的乙醇溶液中，使用鑷子時在酒精燈上燒片刻，冷卻后待用。也可以插入培養(yǎng)基邊緣促使其冷卻。第二十二頁，共二十五頁，2022年，8月28日（8）在酒精燈火焰旁揭去培養(yǎng)皿封口膜，在靠近火焰處，右手用滅菌的鑷子夾取綠豆種子，將其放在培養(yǎng)基上，用鑷子輕輕按一下，使其部分浸入培養(yǎng)基。每瓶可放8-12個外植體。（9）封上封口膜，標(biāo)上接種日期、材料名稱、姓名等，將接種材料移到培養(yǎng)室培養(yǎng)。第二十三頁，共二十五頁，2022年，8月28日第二十四頁，共二十五頁，20