也說說體外診斷試劑標(biāo)準(zhǔn)品、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品那些事9

6/6也說說體外診斷試劑標(biāo)準(zhǔn)品、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品那些事（9）第九篇紛繁復(fù)雜的企業(yè)參考品上一篇講了質(zhì)控物/品,這一篇來說說企業(yè)參考品。企業(yè)參考品在試劑盒的研發(fā)中處于比較重要的分量，關(guān)系到試劑盒開發(fā)的質(zhì)量和整體進度。企業(yè)參考品往往有以下幾個用途：①產(chǎn)品研發(fā)環(huán)節(jié)，用于原材料選擇和確定，產(chǎn)品反應(yīng)體系、反應(yīng)條件的確認(rèn)和優(yōu)化，產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的確認(rèn)和優(yōu)化；②產(chǎn)品生產(chǎn)環(huán)節(jié)，依據(jù)體系文件的規(guī)定，使用企業(yè)參考品的全套或部分，用于產(chǎn)品放行；③產(chǎn)品注冊報批或上市后監(jiān)督抽驗環(huán)節(jié)，在沒有國家標(biāo)準(zhǔn)品、國家參考品的情況下，依據(jù)產(chǎn)品技術(shù)要求，廠家可以使用企業(yè)參考品進行型式檢驗；④使用環(huán)節(jié)，可以提供給用戶用于方法和產(chǎn)品的選擇、驗證或確認(rèn)，檢驗結(jié)果質(zhì)量控制等。關(guān)于企業(yè)參考品，有以下幾點想要闡明：一、企業(yè)參考品一般是對定性產(chǎn)品而言的我們往往將定性產(chǎn)品的質(zhì)控物質(zhì)稱為參考品，這是有歷史緣由的，在第一篇里提到，WHO對定量測定傾向于使用“標(biāo)準(zhǔn)品”一詞，對定性測定側(cè)重于使用“參考品”這個術(shù)語。二、企業(yè)參考品與試劑盒里的質(zhì)控品不是一回事定性試劑盒里往往還帶有質(zhì)控品/對照品，本文所說的企業(yè)參考品不是指這些質(zhì)控品/對照品，兩者的用途不一樣。試劑盒里的陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品一般用于結(jié)果判定或試驗有效性的判斷，例如某乙肝表面抗原試劑盒（ELISA方法），試劑盒里有陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品，其用途在說明書里有明確規(guī)定，每一板實驗，都要加質(zhì)控品，說明書“結(jié)果判定”項下有4點規(guī)定“①試驗有效性：陽性對照孔平均值≥1.00；陰性對照平均值≤0.10；②臨界值計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15；③陰性判定：樣品OD值<臨界值為乙肝表面抗原陰性；④陽性判定：樣品OD值≥臨界值為乙肝表面抗原陽性”。再舉例某新冠病毒核酸檢測試劑盒（熒光PCR法），試劑盒里有陽性對照和陰性對照各1支，隨樣品參與核酸提取、擴增過程，在結(jié)果判讀欄規(guī)定“陰性對照各檢測靶標(biāo)應(yīng)無Ct值，陽性對照各檢測靶標(biāo)Ct≤30,需同時滿足，否則本次實驗無效?！盤CR試劑盒通常還會有內(nèi)標(biāo)（InternalControl，IC）。內(nèi)標(biāo)是指在同一反應(yīng)管中與靶序列共同擴增的一段非靶序列分子。內(nèi)標(biāo)與企業(yè)參考品、上述提到的試劑盒里的陽性、陰性質(zhì)控品/對照品也不是一回事。內(nèi)標(biāo)的最大特點是與靶序列共同擴增，可以對管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進行質(zhì)量控制。而其他的質(zhì)控品處理過程與樣品一致，都是獨立擴增。內(nèi)標(biāo)有兩種形式，一種是使用天然樣品中含有的內(nèi)參基因作為內(nèi)標(biāo)，另一種是人工添加的內(nèi)標(biāo)。企業(yè)參考品是對產(chǎn)品的各項性能進行確認(rèn)或驗證的質(zhì)控品，IVD產(chǎn)品的性能包括正確度、精密度、靈敏度、特異性、檢測范圍等各項指標(biāo)，所以參考品的組成往往不是一只，是一個“panel”。三、企業(yè)參考品的研發(fā)是IVD試劑盒研發(fā)的一部分企業(yè)參考品的用途是全面評價和確認(rèn)產(chǎn)品的各項性能，發(fā)揮“標(biāo)尺”、“砝碼”作用，是IVD研發(fā)、生產(chǎn)及應(yīng)用全過程中進行產(chǎn)品安全有效性評價的必備核心耗材。在研制試劑盒的同時，一般沒有現(xiàn)成的參考品，研發(fā)人員要根據(jù)所研制的試劑盒的方法原理、預(yù)期用途、擬達到的性能指標(biāo)以及研發(fā)計劃和節(jié)點安排，進行企業(yè)參考品的設(shè)計和實施。因此，企業(yè)參考品的研發(fā)是IVD試劑盒研發(fā)的一方面，有的時候，可能花在企業(yè)參考品研制上的成本和時間不會比試劑盒本身要少。以新冠病毒檢測試劑為例，研發(fā)時需要做交叉反應(yīng)的確認(rèn)，包括與其他人類冠狀病毒、甲流和乙流各種流感病毒、呼吸道各種病毒、腸道各種病毒、肺炎支原體、肺炎衣原體、相關(guān)細菌和真菌的交叉反應(yīng)，據(jù)了解，這些毒株、菌株的可獲得性成為新冠產(chǎn)品研發(fā)中的重要和關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。再例如，腫瘤相關(guān)突變基因檢測試劑，其參考品的研制也比較復(fù)雜，包括來源（例如臨床樣本、永生化細胞系、基因編輯細胞系、基因工程構(gòu)建產(chǎn)品、質(zhì)粒），基因及突變位點、突變類型、片段長度、突變頻率的設(shè)計，參考品的制備（例如細胞克隆、核酸提取、純化、制備）、定性鑒定和表征、定量測定等等都是系統(tǒng)性的復(fù)雜工程。四、企業(yè)參考品設(shè)計時應(yīng)遵循的一些原則企業(yè)參考品的設(shè)計應(yīng)客觀合理，應(yīng)能充分評價產(chǎn)品的質(zhì)量，幫助發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品在設(shè)計或者生產(chǎn)中的一些缺陷和問題，這是根本目的，這樣可以避免在臨床試驗階段甚至上市后才發(fā)現(xiàn)問題，從而少走彎路。在實際工作中，會經(jīng)常有同仁問道：陽性參考品是3支就滿足要求，還是5支滿足要求？全用質(zhì)?；蚣毎悼梢詥?？不覆蓋所有的型別，可以嗎？其實對于這些問題，我們要深刻認(rèn)識到企業(yè)參考品相當(dāng)于是對產(chǎn)品考評的考卷，如果你想產(chǎn)品60分就ok，那可以只出滿分是60分的考卷，如果你想產(chǎn)品到90分以上，那你可以出100分的試卷。企業(yè)參考品通常包括陽性參考品、陰性參考品、精密度參考品、檢出限參考品等。在企業(yè)參考品的基質(zhì)選擇上，企業(yè)參考品的基質(zhì)應(yīng)可能與臨床被檢樣本相同或接近（例如血清、血漿、組織切片）。陽性參考品主要評估產(chǎn)品的敏感性，應(yīng)具有代表性、滿足臨床樣本的分布類型、遺傳標(biāo)記代表性，應(yīng)包括強陽性參考品、中等陽性參考品、弱陽性參考品，其中應(yīng)以中等陽性參考品為主。如被測物包括不同的型別及亞型，一般情況下應(yīng)覆蓋。陰性參考品主要評估產(chǎn)品的特異性，陰性參考品除了有不含被測物的正?；颊邩颖就猓€應(yīng)設(shè)置一定數(shù)量的含有可能會產(chǎn)生交叉反應(yīng)物質(zhì)的樣本，包括分析物的結(jié)構(gòu)類似物、具有同源性序列的核酸片段、易引起相同或相似的臨床癥狀的其他病原體、采樣部位正常寄生或易并發(fā)的其他微生物等。建議還應(yīng)設(shè)置干擾評價的參考品，如常見的內(nèi)源性干擾物質(zhì)、常用藥物及其代謝物、樣本添加劑等。重復(fù)性參考品一般設(shè)置包含中陽性和弱陽性至少兩個濃度水平的參考品。檢出限參考品是評價產(chǎn)品檢出能力的重要工具，對于定性產(chǎn)品尤為重要。檢出限參考品的濃度水平可采用90～95%陽性檢出水平或略高于試劑盒檢出限的水平，如100%陽性檢出水平。五、企業(yè)參考品制備企業(yè)參考品制備一般包含以下過程：——原材料來源：樣本來源途徑，企業(yè)可以自行收集并建立，也以購買商業(yè)化盤，可以委托專業(yè)機構(gòu)進行定制；——定性表征：化學(xué)結(jié)構(gòu)、組份或生物學(xué)特征的確證，例如抗原性分析、免疫原性分析，生化分析、基因序列測定，肽圖、活菌計數(shù)、效價（效力）試驗、純度試驗等；——處理加工過程：過濾、滅活、添加、調(diào)整、配制、分裝等；——定值過程：應(yīng)使用適當(dāng)?shù)姆椒ɑ蚪饦?biāo)準(zhǔn)方法對被測物的濃度、滴度、效價、突變頻率、DNA含量等進行確認(rèn)；——穩(wěn)定性研究：要對保存期穩(wěn)定性、使用穩(wěn)定性（開瓶、凍融等）等進行研究，確定效期。企業(yè)要建立自己的參考品，并固定化下來。舉例來講，對于定性試劑盒而言，檢出限這個指標(biāo)非常關(guān)鍵，因此檢出限參考品的合理設(shè)置也就顯得尤為重要，但在實際工作中，我們會發(fā)現(xiàn)有的企業(yè)設(shè)置該參考品時不太科學(xué)，往往隨意選擇一個臨床的強陽性樣本，然后進行倍比稀釋，對系列稀釋的參考品進行檢測，直至檢測到結(jié)果為陰性，并將上一個稀釋度參考品設(shè)置為檢出限參考品，這樣并不能清楚的確定參考品中的被測物的具體濃度（或滴度、效價等），從而也無法保持參考品批次間的一致性。相對于定量試劑，定性試劑顯得更為多樣和復(fù)雜，體現(xiàn)在企業(yè)參考品