基于核磁共振技術(shù)的代謝組學(xué)研究進展

生命科學(xué)(Xue)領(lǐng)域的核磁共振技術(shù)代謝組學(xué)概述基于核磁共振的代謝組學(xué)研究進展第一頁，共五十五頁。一、生命科學(xué)領(lǐng)(Ling)域的核磁共振第二頁，共五十五頁。磁共振成(Cheng)像(NMRI,NuclearMagneticResonanceImaging)磁共振定域譜(MRS,MagneticResonanceSpectroscopy)核磁共振波譜(NMR,NuclearMagneticResonanceSpectroscopy)核磁共振第三頁，共五十五頁。二、代謝(Xie)組學(xué)概述第四頁，共五十五頁。JeremyKNicholsonImperialCollegeLondon，UK代(Dai)謝組學(xué)的定義Metabonomics:

thequantitativemeasurementof

themulti-parametricmetabolicresponseoflivingsystems

topathophysiologicalstimuliorgeneticmodifications對生物系統(tǒng)因病理生理或基因改變等刺激所致動態(tài)多參數(shù)代謝應(yīng)答的定量測定。J.K.Nicholson,J.C.Lindon,E.Holmes.Xenobiotica,1999,29:1181-89.技術(shù)：NMR動物代謝分析：動物的體液和組織第五頁，共五十五頁。OliverFiehnUniversityofCaliforniaHealthSciencesDriveDavis,USAMetabolomics:

comprehensiveanalysisofallthemetabolitesofanorganism.Thequantitativemeasurementofalllowmolecularweightmetabolitesinanorganism’scellsataspecifictimeunderspecificenvironmentalconditions.生物體所有代謝物的(De)系統(tǒng)分析。本質(zhì)是“給定細胞在給定時間和條件下所有小分子代謝物的(De)定量分析”。

O.Fiehn.PlantMol.Biol.,2002,48:155–171.技術(shù)：GC-MS植物代謝分析：細胞第六頁，共五十五頁。代(Dai)謝組學(xué)的發(fā)展198219831984198919992000200120022004Sadler,BuckinghamandNicholson:

Firstpublicationon1H-NMRofbloodandplasmaNicholson,etal.:

Multi-componentanalysisofspectradatafromraturineNicholsonandWilson:

NMRspectroscopyofbiofluidsNicholson:

DefinitionofMetabonomicsHaselden,etal.:

FirstindependentPharmapublicationofMetabonomicsNicholson,Lindon,andHolmes:

PublicationinNatureonMetabonomicsHolmesandAntti:

ExplanationofstatisticsinMetabonomicsIncreasing#ofpublicationsVanDeGreef:

publicationofMSforurineprofiling19701997Oliver:DefinitionofMetabolomeHorming,etal.:

Metabolicprofilesofmetabolitesinhuman第七頁，共五十五頁。代謝(Xie)組學(xué)的中心任務(wù)對生物體液和組織中內(nèi)源性代謝物質(zhì)進行系統(tǒng)測量和分析。對生物體在受到病理生理上的刺激以及某種基因修飾所帶來的代謝物的動態(tài)變化進行量化和編錄，從而得到生物體代謝隨時間及生化過程的變化而改變的信息。將這些信息與病生理過程中的生物學(xué)事件關(guān)聯(lián)起來，從而確定此變化規(guī)律相關(guān)的靶器官和作用部位，進而確定相關(guān)的生物標志物。第八頁，共五十五頁。系(Xi)統(tǒng)生物學(xué)(SystemsBiology)的組成表現(xiàn)型(phenotype)個體(individual)器官(organ)組織(tissue)細胞(cell)代謝物(metabolite)蛋白質(zhì)(protein)mRNADNA代謝組(metabonome/metabolome)蛋白質(zhì)組(proteome)轉(zhuǎn)錄組(transcriptome)基因組(genome)代謝組學(xué)(metabonomics/metabolomics)蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)轉(zhuǎn)錄組學(xué)(transcriptomics)基因組學(xué)(genomics)系統(tǒng)生物學(xué)(SystemsBiology)第九頁，共五十五頁。不同組學(xué)關(guān)系及分析(Xi)技術(shù)NMR,GC&MSGene第十頁，共五十五頁。MetabolomicsisMoreTimeSensitiveThanOther“Omics”MetabolomicsProteomicsGenomicsResponseResponseResponseTime第十一頁，共五十五頁。GenomicsTranscriptomicsProteomicsMetabonomicsTargetmaterialGene,chromosome(geneticcode)mRNA(geneticcode)Protein(functionoftheprotein)LowmolecularweightmetabolitesMW100,000-120,000100,000-120,0005,000-20,000100-5000CharacteristicsContextindependentContextdependentContextdependentContextdependentAnalysisMapping,sequencingSequencingSeparation,characterizationSeparation,characterizationMethodsDNAsequencerHybridization2Dgel,MaldiTOFNMR,MS,GC,LCHuman30,000genome>109?~2,500各種組(Zu)學(xué)技術(shù)的比較第十二頁，共五十五頁。代謝組學(xué)分析(Xi)檢測技術(shù)UPLC,HPLCCE/microfluidicsLC-MSFT-MSQqQ-MSNMRspectroscopyX-raycrystallographyGC-MSLIFdetection第十三頁，共五十五頁。?簡便：樣品不需復(fù)雜預(yù)處理，檢測不需嚴格分析條件，避免引入干擾物的可能。?快捷：常規(guī)1HNMR譜只需幾分鐘，且對低分子量和高分子量的代謝物均能給出定性和半定量的信息。?避免漏檢：不需預(yù)先選定化合物，在對待測物知識非常有限(Xian)的情況下意義尤為重要?；贜MR的代謝組學(xué)的特點第十四頁，共五十五頁。?不破壞樣品的原有組成：NMR方法具有無損傷性,可以在生理條件下對樣品進行實時檢測且不影響混合物的生理生化性質(zhì)甚至化學(xué)平衡，以達到模擬體內(nèi)條件和進行分子水(Shui)平的分析需要。?NMR方法可以進行實時和動態(tài)的檢測?；贜MR的代謝組學(xué)的特點第十五頁，共五十五頁。?

分析組織的高分辨魔角旋轉(zhuǎn)(HR-MAS)NMR方法：消除了磁場不均勻性、化學(xué)位移各向異性和偶極－偶極相互作用帶來的譜線增寬影響，從而可以獲得與液體高分辨NMR

相媲美的分辨率。?無偏向性:NMR對所有化合物的靈敏度是一樣的,氫譜中譜峰和化合物的氫原子是一一對應(yīng)的,所測的每個氫原子都有其(Qi)相關(guān)的譜峰,并且信號的強弱反映樣品中各組分的相對含量。基于NMR的代謝組學(xué)的特點第十六頁，共五十五頁。?多參數(shù)：從核磁譜圖中的多種參數(shù)得出結(jié)構(gòu)(Gou)信息。對于藥物代謝來說，可以通過化學(xué)位移、譜峰的多重性、偶合常數(shù)、弛豫時間、NOE效應(yīng)、譜峰強度等多種參數(shù)對同一問題做全面的反映。?多核與多維NMR：解決同一問題可采用多核（1H、13C、15N、31P、23Na、7Li、139La等）和多維（2DCOSY、NOESY、TOCSY、HSQC）等多種核磁共振編輯手段和實驗方法。基于NMR的代謝組學(xué)的特點第十七頁，共五十五頁。?檢測靈敏度低(Di)：500MHz譜儀的1HNMR的檢測限理論為10μM。?水峰過強：體液中的生物分子一般其濃度為毫摩爾級，水中質(zhì)子濃度約為100mol/L，是生物分子濃度的105

倍!?檢測動態(tài)范圍有限：很難同時檢測同一樣品中含量相差很大的物質(zhì)。?譜峰重疊及譜線較寬。NMR檢測生物樣品中存在的問題第十八頁，共五十五頁。代謝組學(xué)中主流技術(shù)(Shu)的比較ChromatographyMassSpectrometryNMRObjectiveYesYesYesReproducibilityPoorGoodGoodResolutionFairFairGoodSensitivitySelectiveSelectiveFairUnbiaseddetection(Simultaneous)NoNoYesHolisticNoNoYesMolecularinformationPoorFairRichSamplepreparationExtensiveExtensiveLittlePre-knowledgerequirementsYesYesNoinvivo/insituImpossibleAlmostimpossibleYesThroughputFairHighHighRecurrentexpenditureHighHighLowLabourintensivenessFairFairLowCostpersampleFair/lowFairLow第十九頁，共五十五頁。AnalyticalApproachesBio-systemsExogenousEndogenousExposureassessmentBio-monitoringDiseasediagnosticsTimecourseDoseresponseToxins,DrugsEnvironmentaletcMetabolicpathwaysDatabasesMol.Biosyst.2009,5:288;J.Proteome.Res.2009,8:5657;2009,8:352.代謝組學(xué)方法和流(Liu)程第二十頁，共五十五頁。三、基于NMR的代謝(Xie)組學(xué)研究進展第二十一頁，共五十五頁。

在藥物毒理代謝組學(xué)的研究領(lǐng)域，最為矚目的工作是國際COMET(ConsortiumforMetabonomicToxicology)計劃，旨在建立代謝組數(shù)據(jù)庫，并為目標器官及其位點的毒性建立預(yù)測性專家系統(tǒng)。他們已經(jīng)建立起了第一個基于機器學(xué)習(xí)的實驗室嚙(Nie)齒動物肝臟和腎臟毒性預(yù)測的專家系統(tǒng)。1.毒理研究第二十二頁，共五十五頁。

腎毒素：HgCl2、CdCl2、Na2CrO4、硝酸鈾酰、苯酚、對氨(An)基苯酚、六氯丁二烯(HCBD)、順鉑、2-溴乙胺(BEA)、丙烯亞胺(PI)等

肝毒素：肼、異硫氫酸萘(ANIT)、半乳糖胺(GaIN)、羥丁基甲苯(BHT)

第二十三頁，共五十五頁。例1.各種腎毒素對大鼠尿液1HNMR譜的影響。

A,對照組；B，20mg/kgNa2CrO4(腎臟近曲小管毒)組；C，50mg/kg對氨基苯酚(腎臟近直小管毒)組；D，50mg/kg丙烯亞胺(令腎髓質(zhì)壞(Huai)死)組；E，250mg/kg2-溴乙胺(產(chǎn)生急性腎乳頭壞死)組。第二十四頁，共五十五頁。-25-20-15-10-50510152025-30-20-10010PC1PC2PAPANITControl-15-10-5051015-40-30-20-10010PC1PC2ANITControla-naphthylisothiocyanite(ANIT)p-Aminophenol(PAP)Control第二十五頁，共五十五頁。尿中乳酸升高：急性腎小管受損TMAO、DMA、DMG和(He)琥珀酸水平升高：腎乳頭受損氨基酸，乳酸（血中）升高：急性肝受損氨基酸，乳酸（尿中）升高：腎小管損壞尿中琥珀酸升高，α-酮戊二酸升高，檸檬酸降低：腎小管酸中毒或線粒體酶活性降低?；撬嵘撸焊闻K受損酮體含量升高：線粒體中酶代謝紊亂肌酸含量升高：睪丸毒一些重要的NMRmarkers第二十六頁，共五十五頁。

基于NMR的代謝(Xie)組學(xué)方法不僅能區(qū)分組織器官的正常與非正常的狀態(tài)，而且能給出毒性作用的靶器官以及作用機制，識別出毒性的生物標記物。第二十七頁，共五十五頁。2.藥物(Wu)代謝及安全性評價藥物種類：利尿劑（乙酰唑胺），抗菌素（氨比西林、芐基青霉素、先鋒霉素、氟氯西林、青霉素），中樞神經(jīng)藥（脫氧麻黃堿），抗炎解熱鎮(zhèn)痛藥（氨茴酸、萘普生、布洛芬、阿斯匹林、退熱凈、撲熱息痛），抗滴蟲藥（滅滴靈），治關(guān)節(jié)炎藥（青霉胺），抗癌藥物（[Au(Ph2P(CH2)2PPh2)2]Cl、IF、CarboplationPt(II)(NH3)2

）樣本：鼠尿，鼠膽汁，人尿，人淋巴液，血漿方法：1HNMR,13C,19FNMR,31P,1H-1HCOSY,1H-19FCOSY第二十八頁，共五十五頁。?在藥物開發(fā)階段，代謝組學(xué)不僅可以進行早期活體毒理測試，而且能為(Wei)藥物分子的篩選提供依據(jù)；?在藥物臨床應(yīng)用前，它能幫助確定藥物的安全性生物標記物和代謝表型；?評價將動物模型實驗應(yīng)用于人類疾病的可行性。第二十九頁，共五十五頁。3.病理診斷(Duan)及病理生理學(xué)

代謝組學(xué)相對于基因組學(xué)研究來說，在疾?。ㄈ绨┌Y，糖尿病，心血管疾病，肥胖，哮喘）領(lǐng)域是一個相對較新，不斷獲得更加廣泛認可的分析方法。利用代謝組學(xué)的方法可以實現(xiàn)對疾病的診斷，通過對生物標記物的尋找和相關(guān)代謝網(wǎng)絡(luò)的研究，探尋生物標記物的代謝途徑和疾病的產(chǎn)生機理，實現(xiàn)對疾病的診斷。第三十頁，共五十五頁。1957年，“NMR醫(yī)學(xué)研究系”1979年，利用體液的氫譜對癌癥進行診斷

1986年，利用人血漿中脂蛋白峰的甲基和亞(Ya)甲基的線寬區(qū)別進行惡性腫瘤的診斷近年來，通過對血漿、血清、腦脊液、卵巢囊液、組織液、鼠肝提取液的NMR分析，對體液NMR技術(shù)進行癌癥或一些特異的腫瘤如：子房瘤、卵巢瘤、腦瘤、肝臟淋巴瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性膠質(zhì)瘤進行檢測診斷的可能性進行了研究。第三十一頁，共五十五頁。臨床和生化研究的一個重要領(lǐng)域：利用高分辨NMR技術(shù)研究慢性腎功能衰竭(chronicrenalfailure,CRF)者的生化異常。利用NMR技術(shù)可以研究先天性代謝失常，包括2-羥基戊二酸尿癥、棕色糖尿病、酪氨酸血癥、先天性血色沉著病、先天性尿道鈣結(jié)石，在其它疾病如腦白質(zhì)病、糖尿病、神經(jīng)病等(Deng)方面也取得了一些有益的研究成果。第三十二頁，共五十五頁。例1.Urinesamples–Cataract（白(Bai)內(nèi)障）Cataract(48)Control(48)第三十三頁，共五十五頁。例(Li)2.Serumsamples-cardiovasculardisease(冠心病)BrindleJTetal.,2002.NatMed.8(12),1439-45.第三十四頁，共五十五頁。4.

食品安全及質(zhì)(Zhi)量控制目前對飲食的安全可靠性和食品的質(zhì)量控制引起了科學(xué)領(lǐng)域和公眾的特別關(guān)注，促進了在食品領(lǐng)域的代謝組學(xué)分析和對其質(zhì)量控制方面的研究。第三十五頁，共五十五頁。

目前主要研究方向：酒精飲料和釀造食品（啤酒、葡萄酒、蒸餾酒、醬油、醋），咖啡和茶類，水果和蔬菜（果汁、柑橘、獼猴桃、芒果、黑樹(Shu)莓、甜瓜、西瓜、西紅柿、萵苣、蕓苔、土豆、胡蘿卜、玉米、小麥），橄欖油，牛奶和乳制品（牛奶、奶酪、黃油和人造黃油），蜂蜜，魚和肉類。還有其它的研究如松露、菌類和藏紅花。第三十六頁，共五十五頁。PCA(A)andOPLS-DA(B)3Dscoreplotsderivedfromthe1HNMRspectraofbeefsirloin(orchuck)extractsobtainedfromAustralia,Korea,NewZealand,andtheUnitedStatesofAmerica.例1.Extractsfrombeefsirloin(牛里(Li)脊肉)第三十七頁，共五十五頁。例(Li)2.Beer（啤酒）Thesamecompany,protocol(Genome),pipe-line(Proteome),butdifferenttaste(Metabolome)第三十八頁，共五十五頁。例3.Wine（葡萄(Tao)酒）RedwineMoretanninsandphenolicsWhitewineMoreaminoacid第三十九頁，共五十五頁。例4.蜂(Feng)蜜（Honey）CJ(Chinesejujube，棗花),LJ(Lonicerajaponica，金銀花),FS(Flossophorae，槐花),FCI(Floschrysanthemiindici，菊花),EJ(Eriobotryajaponica，枇杷)不同花蜜的NMR譜第四十頁，共五十五頁。例(Li)4.蜂蜜（Honey）相同產(chǎn)地不同花源相同花源不同產(chǎn)地相同廠家不同批次第四十一頁，共五十五頁。5.營養(yǎng)代謝研究

代謝組學(xué)的方法可以幫助識別和常量營養(yǎng)物的最終攝入效應(yīng)密切相(Xiang)關(guān)的代謝物，并且有助于定義各種常量營養(yǎng)物的正常攝入范圍。營養(yǎng)代謝組學(xué)（Nutrimetabolomics）定義的提出。第四十二頁，共五十五頁。

飲食與營養(yǎng)科學(xué)與代謝組學(xué)相結(jié)合系統(tǒng)地表征在不同健康狀態(tài)（健康，亞健康，疾?。┫拢嬍沉?xí)慣，地域差異，營養(yǎng)結(jié)構(gòu)（種類和用量），營養(yǎng)相關(guān)疾病等對機體造成的細微代謝變化，這些變化概況(Kuang)為探索不同飲食或營養(yǎng)條件下機體內(nèi)的細胞，組織和器官的生物標記物，代謝整體水平以及代謝作用機制，并有可能為機體的健康狀況(Kuang)動態(tài)地況(Kuang)進行診斷和營養(yǎng)搭配提供新的策略。第四十三頁，共五十五頁。6.功能基因組的研究

隨著人類基因組測序工作的完成，人們已(Yi)經(jīng)步入到了后基因組時代即對功能基因組學(xué)的研究。通常，功能基因組學(xué)利用基因組提供的信息和產(chǎn)物，運用遺傳或其他新的實驗技術(shù)，通過識別基因在一個或多個生物模型中的作用來全面認識和分析基因的功能。第四十四頁，共五十五頁。

基因產(chǎn)生變異的生物體在生長速率等表型上可能沒有顯著的改變，這是因為細胞內(nèi)的代謝物濃度的改變補償了變異產(chǎn)生的影響。但是這也同時意味著生物體在代謝表型上可能會有顯著的變化。代謝組學(xué)作為功能基因組學(xué)研究應(yīng)用的一個重要方法，主要是從基因表達譜的終點——代謝物組的信息來鑒定或推測出基因的功能。“基因組學(xué)告訴我們什么可能發(fā)生，代謝組學(xué)則告訴我們發(fā)生了什么”，二者相(Xiang)互關(guān)聯(lián)，將會從現(xiàn)象到本質(zhì)探尋生命的奧秘。第四十五頁，共五十五頁。7.中醫(yī)藥現(xiàn)代化

代謝組學(xué)有可能在中醫(yī)“病、證、方”的研究體系中發(fā)揮作用，在規(guī)范中醫(yī)基于證的診斷標準、探索證候的動態(tài)內(nèi)涵和演變規(guī)律，以及提示證與疾病療效的相關(guān)性和科學(xué)性方面扮演重要的角色。另外在中藥質(zhì)量控制、整體療效和中藥安全(Quan)性也進行了初步研究。第四十六頁，共五十五頁。8.微生物領(lǐng)域的研究

微生物代謝組學(xué)是力求在特定的條件下分析微生物體系中所有代謝物的動