發(fā)酵動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

發(fā)酵動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)第1頁/共34頁2發(fā)酵動(dòng)力學(xué)是研究各種發(fā)酵過程變量在活細(xì)胞作用下的變化規(guī)律，以及各種發(fā)酵條件對(duì)這些變量變化速度的影響。

以化學(xué)熱力學(xué)（研究反應(yīng)的方向）和化學(xué)動(dòng)力學(xué)（研究反應(yīng)的速度）為基礎(chǔ)，對(duì)發(fā)酵過程中各種物質(zhì)的變化進(jìn)行描述。一、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究的內(nèi)容第2頁/共34頁3研究?jī)?nèi)容微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)第3頁/共34頁4二、研究發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的方法

發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究的前提①反應(yīng)器內(nèi)的攪拌系統(tǒng)能保證理想的混合；②溫度、pH等環(huán)境條件能夠控制以保持穩(wěn)定；③細(xì)胞有固有的化學(xué)組成，不隨發(fā)酵時(shí)間和某些發(fā)酵條件的變化而發(fā)生明顯變化；④各種描述發(fā)酵動(dòng)態(tài)的變量對(duì)發(fā)酵條件變化的反應(yīng)無明顯滯后。第4頁/共34頁51.宏觀處理法：把細(xì)胞看成一個(gè)均勻分布的物體，不管微觀反應(yīng)機(jī)制，只考慮各個(gè)宏觀變量之間的關(guān)系，這樣便得出結(jié)構(gòu)模型和非結(jié)構(gòu)模型2.質(zhì)量平衡法：根據(jù)質(zhì)量守恒定律，對(duì)某一物質(zhì)在過程發(fā)生前后的質(zhì)量變化進(jìn)行恒算。

發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究方法第5頁/共34頁6質(zhì)量平衡式物質(zhì)在系統(tǒng)中積累的速度=物質(zhì)進(jìn)入系統(tǒng)的速度+物質(zhì)在系統(tǒng)中生成的速度-物質(zhì)排出系統(tǒng)的速度-物質(zhì)在系統(tǒng)中消耗的速度某物質(zhì)在系統(tǒng)中的含量能夠在線測(cè)量或估計(jì)，通過建立上述平衡方程式，就可以確定該物質(zhì)在系統(tǒng)中變化的動(dòng)力學(xué)。人為加入或排出和通過相界面?zhèn)髻|(zhì)進(jìn)入或排出第6頁/共34頁三、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究步驟7獲得發(fā)酵過程中能夠反映發(fā)酵過程變化的多種理化參數(shù)尋求發(fā)酵過程變化的多種理化參數(shù)與微生物發(fā)酵代謝規(guī)律之間的相互關(guān)系建立多種數(shù)學(xué)模型，描述多種理化參數(shù)隨時(shí)間變化的關(guān)系利用計(jì)算機(jī)和程序控制，反復(fù)驗(yàn)證多種數(shù)學(xué)模型的可行性的適用范圍第7頁/共34頁8氧需求好氧發(fā)酵兼性好氧發(fā)酵厭氧發(fā)酵液體表面發(fā)酵液體深層發(fā)酵深層發(fā)酵操作方法分批發(fā)酵分批補(bǔ)料發(fā)酵連續(xù)發(fā)酵微生物發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究與發(fā)酵的種類、方式密切相關(guān)第8頁/共34頁四、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究的意義通過對(duì)發(fā)酵反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究，進(jìn)行最佳發(fā)酵生產(chǎn)工藝條件的控制。發(fā)酵過程中，菌體的濃度、基質(zhì)濃度、溫度、pH值、溶解氧等工藝參數(shù)的控制方案，可以在這研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化。設(shè)計(jì)合理的發(fā)酵過程，也必須以發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型作為依據(jù)，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行程序設(shè)計(jì)、模擬最合適的工藝流程和發(fā)酵工藝參數(shù)，從而使生產(chǎn)控制達(dá)到最優(yōu)化。發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究還在為試驗(yàn)工廠比擬放大、為分批發(fā)酵過渡到連續(xù)發(fā)酵提供理論依據(jù)。第9頁/共34頁10發(fā)酵過程中，基質(zhì)主要消耗在：①滿足菌體生長(zhǎng)消耗②維持微生物生存的消耗③合成代謝產(chǎn)物的消耗S，基質(zhì)（底物）；G，菌體生長(zhǎng)；M，維持代謝；P，產(chǎn)物合成1、幾個(gè)基本概念五、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型第10頁/共34頁111.維持因數(shù)(m)：?jiǎn)挝恢亓康模ňw）細(xì)胞在單位時(shí)間內(nèi)用于維持代謝消耗的基質(zhì)的量。

一般來講指維持細(xì)胞最低活性所需消耗的能量。（碳，氮，氧等的維持因數(shù)mc,mn,mo）ms:以基質(zhì)消耗為基準(zhǔn)的維持因數(shù)，X:菌體干重；S:基質(zhì)量t:發(fā)酵時(shí)間；M:表示維持。第11頁/共34頁12基質(zhì)的消耗速度

基質(zhì)的消耗比速率2.比速（率）:單位時(shí)間內(nèi)，單位干菌體消耗基質(zhì)或形成產(chǎn)物（菌體）的量(消耗的基質(zhì)用于維持代謝，菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成)。比速率是生物反應(yīng)中用于描述反應(yīng)速度的常用概念第12頁/共34頁13菌體的比生長(zhǎng)速率產(chǎn)物的比生產(chǎn)速率第13頁/共34頁143.生長(zhǎng)得率：菌體的生長(zhǎng)量相對(duì)于基質(zhì)消耗量的收得率。YX/s:相對(duì)與基質(zhì)消耗的實(shí)際生長(zhǎng)得率系數(shù)Yg/s:相對(duì)于基質(zhì)消耗的（純生長(zhǎng)）理論得率系數(shù)

特定的基質(zhì)及在特定環(huán)境條件下培養(yǎng)的特定微生物，它是一個(gè)常數(shù)，又稱最大生長(zhǎng)得率或生長(zhǎng)得率常數(shù)。第14頁/共34頁154.產(chǎn)物得率：產(chǎn)物的合成相對(duì)于基質(zhì)消耗量的收得率。YP/s:相對(duì)于基質(zhì)消耗的實(shí)際產(chǎn)物得率系數(shù)Yps:相對(duì)于基質(zhì)消耗的產(chǎn)物理論得率系數(shù)理論產(chǎn)物得率取決于產(chǎn)物的生物合成途徑，對(duì)于由特定基質(zhì)經(jīng)特定途徑產(chǎn)生的特定產(chǎn)物來說，它是一個(gè)常數(shù)，不因菌株和發(fā)酵條件的不同而異。第15頁/共34頁16第16頁/共34頁17μ：菌體的生長(zhǎng)比速

s：?jiǎn)我幌拗菩曰|(zhì)濃度

Ks：半飽和常數(shù)μmax:最大比生長(zhǎng)速率s1.Monod方程式2、微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)μmμm/2ks第17頁/共34頁莫諾方程成立的假設(shè)條件：菌體生長(zhǎng)為均衡型非結(jié)構(gòu)式生長(zhǎng)，細(xì)胞成分只需要用一個(gè)參數(shù)即菌體濃度表示；只有一種底物是生長(zhǎng)限制性底物，并且沒有反饋抑制性產(chǎn)物出現(xiàn)；微生物生長(zhǎng)沒有動(dòng)態(tài)滯后性。18第18頁/共34頁19Monod方程中單一限制性基質(zhì)可以是培養(yǎng)基中任何一種與微生物生長(zhǎng)有關(guān)的營(yíng)養(yǎng)物，只要該基質(zhì)相對(duì)缺乏，就成為限制性生長(zhǎng)因子。實(shí)際過程中，可能出現(xiàn)多種限制性基質(zhì)和抑制性物質(zhì)，影響了Monod方程的適用性。第19頁/共34頁20

Ks

，微生物對(duì)基質(zhì)的飽和常數(shù),當(dāng)μ=1/2μmax，s=Ks

當(dāng)s<<Ks，基質(zhì)濃度很低時(shí)，提高S，可明顯提高μ，一級(jí)反應(yīng)。當(dāng)s>>Ks，基質(zhì)濃度較高時(shí)，μ與s無關(guān)，零級(jí)反應(yīng)。當(dāng)s趨近于無窮大時(shí)，μ=μmax.μmax是理論上最大的生長(zhǎng)潛力。μmμm/2kss第20頁/共34頁21米氏方程μmμm/2kss莫諾方程第21頁/共34頁22莫諾方程與米氏方程二者形式相同，但微生物生長(zhǎng)是細(xì)胞群體生命活動(dòng)的綜合表現(xiàn)，機(jī)理非常復(fù)雜。Monod方程與米氏方程的區(qū)別與聯(lián)系是：Monod方程是對(duì)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的總結(jié)，是經(jīng)驗(yàn)方程（empiricalmodel）；米氏方程是根據(jù)酶反應(yīng)機(jī)理推導(dǎo)得出，是機(jī)理方程（mechanisticmodel）。第22頁/共34頁由于微生物的代謝產(chǎn)物，特別是次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成途徑特別復(fù)雜，其動(dòng)力學(xué)過程不僅受菌體自身基因型的限制，還與其生活的外部條件有密切關(guān)系。目前整個(gè)動(dòng)態(tài)變化過程的規(guī)律仍不是十分清楚，大多數(shù)研究只是限于宏觀變量的非結(jié)構(gòu)模型。233、微生物的產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)第23頁/共34頁24根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物形成是否偶聯(lián)進(jìn)行分類Luedeking-Piret模型是一常見的分批發(fā)酵產(chǎn)物合成動(dòng)力學(xué)模型，它把產(chǎn)物生成速率看作是菌體生長(zhǎng)速率和菌體濃度的函數(shù)，用數(shù)學(xué)式表示為：式中：α——與生長(zhǎng)偶聯(lián)的產(chǎn)物形成系數(shù)

β——非生長(zhǎng)偶聯(lián)的相關(guān)系數(shù)第24頁/共34頁25偶聯(lián)型：產(chǎn)物生成速率與細(xì)胞生長(zhǎng)速率有緊密聯(lián)系，合成的產(chǎn)物通常是分解代謝的直接產(chǎn)物，如葡萄糖厭氧發(fā)酵生成乙醇，或者好氣發(fā)酵生成中間代謝物(氨基酸或維生素)。這類初級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)速率與生長(zhǎng)直接有關(guān)。式中α>0，β＝0

混合型：生長(zhǎng)與產(chǎn)物生成相關(guān)(如乳酸、檸檬酸、谷氨酸等的發(fā)酵)，發(fā)酵產(chǎn)物生成速率可由Luedeking-Piret模型數(shù)學(xué)式描述，式中α>0，β>0。該混合型模型復(fù)雜的形成是將常數(shù)α、β作為變數(shù)，它們?cè)诜峙l(fā)酵的四個(gè)時(shí)期分別具有特定的數(shù)值。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物形成是否偶聯(lián)進(jìn)行分類第25頁/共34頁26非生長(zhǎng)偶聯(lián)型：在生長(zhǎng)和產(chǎn)物無關(guān)聯(lián)的發(fā)酵模式中，細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)，無產(chǎn)物，但細(xì)胞停止生長(zhǎng)后，則有大量產(chǎn)物積累，產(chǎn)物的形成速率只與細(xì)胞積累量有關(guān)。產(chǎn)物合成發(fā)生在細(xì)胞生長(zhǎng)停止之后(即產(chǎn)生于次級(jí)生長(zhǎng))，故習(xí)慣上把這類與生長(zhǎng)無關(guān)聯(lián)的產(chǎn)物稱為次級(jí)代謝產(chǎn)物，但不是所有次級(jí)代謝產(chǎn)物一定是與生長(zhǎng)無關(guān)聯(lián)的。大多數(shù)抗生素和微生物毒素的發(fā)酵都是非生長(zhǎng)偶聯(lián)的例子，非偶聯(lián)型發(fā)酵的生產(chǎn)速率只與已有的菌體量有關(guān)，而比生產(chǎn)速率β為一常數(shù)，與比生長(zhǎng)速率μ沒有直接關(guān)系。因此，其產(chǎn)率和產(chǎn)物濃度高低取決于細(xì)胞生長(zhǎng)期結(jié)束時(shí)的生物量。式中α＝0，β>0

根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物形成是否偶聯(lián)進(jìn)行分類第26頁/共34頁274、微生物的基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)假設(shè)發(fā)酵過程沒有中間代謝產(chǎn)物積累，則含碳基質(zhì)的質(zhì)量平衡算式為：消耗的含碳基質(zhì)=維持代謝消耗量+菌體生長(zhǎng)消耗量+產(chǎn)物合成消耗量即：第27頁/共34頁28微分后：式中：ms——維持系數(shù)，即單位菌體、單位時(shí)間內(nèi)用于菌體維持生命活動(dòng)的基質(zhì)量——單純用于合成單位菌體所消耗的基質(zhì)量——單純用于合成單位產(chǎn)物所消耗的基質(zhì)量上式反映了基質(zhì)消耗與菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)物生成之間的關(guān)系。因此，當(dāng)生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型和產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型確定后，基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)模型即可確定。第28頁/共34頁29六、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1.實(shí)驗(yàn)材料菌種：雅致放射毛霉AS3.2778培養(yǎng)基：斜面培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基（參考實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)）試劑：DNS試劑2.實(shí)驗(yàn)步驟菌種斜面培養(yǎng)：配制PDA培養(yǎng)基100ml，分裝試管，滅菌后擺成斜面，將雅致放射毛霉接種于斜面上，25℃培養(yǎng)48h。種子培養(yǎng)：斜面菌種在25℃恒溫培養(yǎng)48h后，轉(zhuǎn)接于500mL搖瓶，裝液量為150mL，160r/min25℃，搖床培養(yǎng)16h為種液。第29頁/共34頁30發(fā)酵培養(yǎng):5L發(fā)酵罐中裝入3.5L的發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基在在121℃下滅菌30min，溫度降至30℃時(shí)，接入種液，接種量為4%．控制適宜的通氣比、保持罐壓為0.05MPa、發(fā)酵溫度30℃、攪拌速度160r/min條件下發(fā)酵84h．每12h取樣1次進(jìn)行菌體生長(zhǎng)量、還原糖產(chǎn)量、蔗糖糖消耗測(cè)定．結(jié)果為3次重復(fù)。3.分析方法菌體生物量的測(cè)定：采用比濁法，發(fā)酵液以蒸餾水稀釋，5000r/min離心10min，除去上清液，菌體沉淀用生理鹽水洗2-3次再離心去上清液，用生理鹽水重懸并進(jìn)行適當(dāng)稀釋，測(cè)定其OD600nm。第30頁/共34頁31還原糖的測(cè)定：（1）在堿性條件下，還原糖與3、5－二硝基水楊酸共熱，3、5－二硝基水楊酸被還原為3－氨基－5－硝基水楊酸（棕紅色物質(zhì)），還原糖則被氧化成糖酸及其它物質(zhì)。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色深淺的程度呈一定的比例關(guān)系，可在722型分光光度計(jì)540nm波長(zhǎng)測(cè)定棕紅色物質(zhì)的吸光度值。查標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，可求出發(fā)酵液中還原糖的含量。（2）取4支干燥試管,編號(hào),按下表所示的量,精確加入待測(cè)液和試劑(ml):管號(hào)項(xiàng)目空白還原糖0123樣品量02.02.02.0蒸餾水3.51.51.51.53、5－二硝基水楊酸試劑1.51.51.51.5總體積5.05.05.05.0第31頁/共34頁32加完試劑后,將各管搖勻，戴上小漏斗，在沸水浴中加熱5分鐘，立即用冷水冷卻至室溫，再向各管中加入蒸餾水20.0ml，用橡皮塞塞住管口，顛倒混勻。切勿用力振搖，引入氣泡。在540