臨床微生物學檢驗：實驗5

臨床微生物學檢驗

第五個實驗周

目的要求1.掌握下呼吸道標本的分離培養(yǎng)及檢測方法2.掌握的銅綠假單胞菌形態(tài)染色、培養(yǎng)特性、菌落特征和鑒定方法3.掌握流感、副流感嗜血桿菌形態(tài)染色、培養(yǎng)特性、菌落特征和鑒定方法

菌種試劑菌種：流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌、金黃色葡菌球菌標本：模擬痰標本

主要試劑：X、V、X＋V因子紙片，氧化酶試劑，革蘭染色液不發(fā)酵細菌微量生化編碼管

第一天實驗內(nèi)容模擬痰標本①分離培養(yǎng)：接種（1個大血平/人+1個Mac/人+1個巧克力/人）②涂片干燥固定后革蘭染色流感嗜血桿菌或副流感嗜血桿菌：①菌落觀察、涂片干燥固定后革蘭染色②衛(wèi)星試驗（1個小血平板/人）因子試驗（MH平板1個/人）③轉(zhuǎn)種巧克力平板（2個/組）

痰液及上呼吸道標本

肉眼觀察培養(yǎng)前處理①直接涂片檢查②

血平板、Mac

特殊細菌培養(yǎng)初報

巧克力平板

選擇適當培養(yǎng)基和條件

菌落觀察分離鑒定涂片純培養(yǎng)

生化鑒定藥敏

最終報告

②合格痰標本：白細胞＞25/低倍視野，鱗狀上皮細胞＜10/低倍視野①洗痰、胰酶均質(zhì)化嗜血桿菌屬形態(tài)：G-b細小呈球桿狀短絲狀或多形態(tài)

培養(yǎng)：5-10%CO2

營養(yǎng)要求高生長需X或V因子

巧克力平板菌落:直徑0.5-1.5mm、圓形、光滑、濕潤、無色或灰白色半透明小菌落革蘭陰性短小球桿菌（有多形性）副流感嗜血桿菌革蘭染色結(jié)果培養(yǎng)基：巧克力平板血液中含有X、V因子，V因子處于抑制狀態(tài)，加熱80-90℃10-15min可破壞V因子的抑制物使V因子發(fā)揮作用。巧克力瓊脂中加入抗生素可提高檢出率

菌落特征:巧克力平板上無色或灰白色半透明小菌落衛(wèi)星試驗：金葡菌能合成釋放V因子，在金葡菌菌落周圍，流感嗜血桿菌菌落較大，遠離則小因子試驗：MH平板上貼上X、V、X＋V因子紙片，不同嗜血桿菌會在所需因子紙片周圍生長副流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌衛(wèi)星試驗（血平板）金黃色葡萄球菌（劃線或點種）

流感嗜血桿菌（密集涂布于平板上）衛(wèi)星試驗陽性結(jié)果

嗜血桿菌（密集涂布于平板上）X＋VVX因子試驗（MH平板）操作方法、注意事項X＋V生長，V生長因子試驗結(jié)果第一天實驗內(nèi)容模擬痰標本①分離培養(yǎng)：接種（1個大血平/人+1個Mac/人+1個巧克力/人）②涂片干燥固定革蘭染色流感嗜血桿菌或副流感嗜血桿菌：①巧克力平板上菌落觀察、涂片干燥固定革蘭染色衛(wèi)星試驗（1個小血平板/人）因子試驗（1個MH平板/人）③轉(zhuǎn)種巧克力平板（2個/組）部分接種流感，部分接種副流感一個接種流感嗜血桿菌，一個接種副流感②金葡點種或劃線第二天實驗內(nèi)容嗜血桿菌：①觀察分區(qū)劃線結(jié)果，觀察菌落特點②衛(wèi)星現(xiàn)象結(jié)果觀察③因子試驗結(jié)果觀察痰標本：血平板菌落觀察和革蘭染色、氧化酶試驗。麥康凱和巧克力平板上菌落觀察。取Mac上淺粉紅色的菌落接種相應(yīng)的微量生化編碼系統(tǒng)（非發(fā)酵菌微量生化編碼系統(tǒng)）。

（上述實驗每人均做）流感嗜血桿菌培養(yǎng)24h菌落菌落:直徑0.5-1.5mm、圓形、光滑、濕潤、無色或灰白色半透明小菌落流感嗜血桿菌培養(yǎng)48h菌落同學分離的流感嗜血桿菌菌落流感嗜血桿菌衛(wèi)星試驗陽性結(jié)果流感嗜血桿菌和副流感嗜血桿菌衛(wèi)星現(xiàn)象結(jié)果（二者衛(wèi)星現(xiàn)象均陽性，上面“+”，下面“-”）溶血嗜血桿菌的衛(wèi)星試驗陽性流感嗜血桿菌衛(wèi)星試驗陽性某同學做的“衛(wèi)星試驗”副流感嗜血桿菌因子試驗結(jié)果流感嗜血桿菌因子試驗結(jié)果X+V因子周圍生長流感嗜血桿菌因子試驗結(jié)果X+V因子周圍生長溶血嗜血桿菌因子試驗結(jié)果

X因子V因子β溶血流感嗜血桿菌++-副流感嗜血桿菌-+-

X因子V因子β溶血

流感嗜血桿菌++-

溶血嗜血桿菌+++

副流感嗜血桿菌-+-

副嗜沫嗜血桿菌-+-

副溶血嗜血桿菌-++

杜克雷嗜血桿菌+--

嗜沫嗜血桿菌---

幾種嗜血桿菌對生長因子需求痰培養(yǎng)平板上致病菌的初步判斷原則：需要結(jié)合“痰標本涂片、培養(yǎng)及臨床表現(xiàn)”才能判斷培養(yǎng)出來的細菌是定植還是致病菌①患者的血象、體溫、胸痛和肺部啰音等體現(xiàn)感染的臨床表現(xiàn)。②痰涂片鏡檢見大量白細胞吞噬細菌③痰涂片見到的細菌培養(yǎng)大量生長（占所分出細菌的50%以上）綠色色素、金屬光澤、特殊氣味、β-溶血環(huán)血平板麥康凱平板巧克力平板巧克力平板：菌落圓形、大小不一、邊緣不整、扁平、濕潤、常呈融合態(tài)，特殊氣味、色

素不易觀察到。血平：類似巧克力瓊脂上菌落，綠色色素、特殊氣味，有金屬光澤、有β溶血。

銅綠假單胞菌菌落形態(tài)革蘭染色銅綠假單胞菌G-b、菌體長短不一、球桿狀或長絲狀

可疑菌落（痰培養(yǎng)中優(yōu)勢菌）涂片革蘭染色革蘭陰性桿菌氧化酶(+)

非發(fā)酵菌鑒定系統(tǒng)鑒定到種

非發(fā)酵菌微量生化鑒定系統(tǒng)第三天實驗內(nèi)容1.不發(fā)酵菌微量編碼系統(tǒng)結(jié)果判斷2.痰標本鑒定結(jié)果報告非發(fā)酵菌微量生化鑒定系統(tǒng)DNA酶試驗

原理：甲基綠與長鏈DNA結(jié)合呈綠色，而短鏈的寡核苷酸不與甲基綠結(jié)合，呈灰白色。

精氨酸雙水解酶試驗（在非發(fā)酵菌鑒定中不加石蠟油）

原理：精氨酸經(jīng)兩次水解后,生成鳥氨酸、氨及二氧化碳。鳥氨酸又在脫羧酶的作用下生成腐胺。氨及腐胺均為堿性物質(zhì)，故可使培養(yǎng)基變堿，用指示劑指示出來。

乙酰胺利用試驗

原理：許多非發(fā)酵菌產(chǎn)生一種脫酰胺酶，可使乙酰胺經(jīng)脫酰胺作用釋放氨，使培養(yǎng)基變堿。

非發(fā)酵菌微量編碼系統(tǒng)結(jié)果判斷枸櫞酸鹽麥芽糖精氨酸甘露醇木糖乙酰胺DNA硝酸鹽葡萄糖(厭氧)葡萄糖(需氧)氧化酶III