微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座

內(nèi)容提要

一.內(nèi)毒素（LPS）檢測

二.腸道致病菌分離培養(yǎng)

三.細(xì)菌在自然界分布及理化原因?qū)?xì)菌生長影響微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第1頁（一）內(nèi)毒素檢測

目標(biāo)1掌握內(nèi)毒素試驗原理和操作方法。2熟悉內(nèi)毒素試驗意義。微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第2頁檢測內(nèi)毒素方法有家兔發(fā)燒法和鱟（hòu）試驗法，家兔發(fā)燒法比較煩瑣，且靈敏度不高，故現(xiàn)在多用鱟試驗法，鱟試驗法靈敏度高，可檢測小于10ng/ml內(nèi)毒素。微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第3頁微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第4頁微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第5頁內(nèi)毒素生物學(xué)活性：致熱作用、白細(xì)胞反應(yīng)、感染性休克和DIC等。原理：

鱟是一個海洋節(jié)肢動物，其血液中含有一個有核變形細(xì)胞，這種細(xì)胞胞漿中含有凝固酶原和凝固蛋白原。內(nèi)毒素（LPS）

激活凝固蛋白原凝固蛋白（溶解狀態(tài)）

（凝膠狀態(tài)）凝固酶原凝固酶微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第6頁材料：鱟試劑內(nèi)毒素試劑鱟試劑專用溶解水無菌無熱源質(zhì)吸管微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第7頁方法：

（每4個人一組，兩支鱟試劑，一支試驗一支對照）

1.取兩支鱟試劑打開，分別加入0.1ml鱟試劑溶解水，使之溶解2.其中一支加入0.1ml內(nèi)毒素，標(biāo)識上試驗組，另一支加入0.1ml溶解水，作為對照3.垂直放入37℃溫箱，20--30分鐘觀察結(jié)果結(jié)果：試驗組出現(xiàn)凝固，對照組不出現(xiàn)凝固微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第8頁內(nèi)毒素檢測應(yīng)用：（1）檢測輸液用具或生物制品中是否含有內(nèi)毒素（2）臨床上檢測患者是否有革蘭氏陰性菌感染引發(fā)內(nèi)毒素血癥（內(nèi)毒素休克）等微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第9頁二.腸道致病菌分離培養(yǎng)2課時微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第10頁

一.常見培養(yǎng)基特征及用途二.致病性腸道桿菌生物學(xué)性狀三.分離培養(yǎng)方法腸道細(xì)菌分離培養(yǎng)微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第11頁一、培養(yǎng)基概念:是人工配制專供微生物生長繁殖混合營養(yǎng)物制品。成份：充分營養(yǎng)物質(zhì)（水分、碳源、氮源、無機(jī)鹽）；適當(dāng)PH，適宜溫度；適宜氣體環(huán)境。用途：用于微生物繁殖及分離接種，傳代或保留，判別微生類屬，研究微生物生理及生化特性，制造菌苗、疫苗或其它微生物制劑等。微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第12頁二、分類主要用于增菌用于檢測動力及保留菌種用于分離判定細(xì)菌微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第13頁雙糖鐵培養(yǎng)基S-S培養(yǎng)基普通瓊脂培養(yǎng)基血液瓊脂培養(yǎng)基

庖肉培養(yǎng)基微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第14頁培養(yǎng)基制備程序調(diào)配過濾矯正pH（7.0-7.6） 分裝過濾滅菌（121.3℃，20-30分鐘）判定是否有菌放入冰箱冷藏備用因高壓之后pH值會下降0.1左右，所以矯正pH時應(yīng)比所需pH高判定是否有菌可將培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)二十四小時，然后觀察微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第15頁肉湯培養(yǎng)基制作方法1.將已去筋膜及脂肪并經(jīng)絞碎鮮牛肉50克，加蒸餾水100ml，放入冰箱中過夜。2.加熱煮沸半小時至一小時后，用數(shù)層紗布或濾紙過濾，濾液用蒸餾水補(bǔ)足其量為100ml。3.于濾液中加入氯化鈉0.5克，蛋白胨1克，磷酸氫二鉀0.1克，加熱使之完全溶化。微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第16頁4.測定酸堿度并調(diào)至pH7.6，必要時用濾紙過濾。5.按需要分裝于試管或燒瓶內(nèi)，加棉塞，置高壓蒸汽滅菌器內(nèi)，經(jīng)121.3℃、20-30分鐘滅菌。6.滅菌后置37℃溫箱孵育二十四小時，無雜菌生長，即可應(yīng)用或放冰箱備用。微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第17頁液體培養(yǎng)基加入1-2%瓊脂為固體培養(yǎng)基，加入0.5%瓊脂為半固體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基加入血液即為血平板（營養(yǎng)培養(yǎng)基）。微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第18頁血液瓊脂培養(yǎng)基（血平板）在普通瓊脂培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入血液制備而成,是最慣用營養(yǎng)培養(yǎng)基,可供營養(yǎng)要求較高細(xì)菌生長.慣用于分離培養(yǎng)和溶血現(xiàn)象觀察.微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第19頁含有膽酸鹽抑制G+,枸櫞酸鈉和煌綠能抑制大腸桿菌,致病沙門菌和志賀菌能大量生長.含有中性紅指示劑和乳糖,中性紅遇酸變粉紅.慣用于培養(yǎng)腸道致病菌.SS培養(yǎng)基（Salmonella-ShigellaMediun）

微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第20頁SS培養(yǎng)基微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第21頁腸道桿菌生物學(xué)性狀埃希菌屬：大腸埃希菌沙門菌屬：傷寒沙門菌甲型、乙型副傷寒沙門菌志賀菌屬：痢疾志賀菌腸桿菌科主要菌屬及代表菌種微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第22頁1大腸桿菌:

生物學(xué)性狀:G-鏡下為桿狀，多數(shù)菌株有周鞭毛，菌毛，無芽孢，兼性厭氧

營養(yǎng)要求不高,可在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長，發(fā)酵葡萄糖等,產(chǎn)酸產(chǎn)氣最適宜溫度為37度,最適宜pH為7.4腸道桿菌生物學(xué)性狀微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第23頁菌落特點：

圓形，凸起，灰白色，表面光滑，濕潤，直徑2-3mm微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第24頁腸產(chǎn)毒型大腸桿菌（輕度腹瀉，腸毒素，定植因子）腸侵襲型大腸桿菌（與志賀菌相關(guān)，與菌痢相同里急后重，不產(chǎn)生腸毒素）腸致病型大腸桿菌（最早發(fā)覺引發(fā)腹瀉大腸桿菌，嬰幼兒）腸出血型大腸桿菌（出血性結(jié)腸炎和溶血性尿毒綜合征病原體，輕度水瀉伴猛烈腹痛血便，常見食品污染）腸集聚型大腸桿菌（嬰兒和旅行者連續(xù)水樣腹瀉偶有血便，不侵襲細(xì)胞，在細(xì)胞表面自動聚集，形成磚樣排列）分類：（胃腸炎）微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第25頁（2）傷寒桿菌生物學(xué)特征:G-鏡下為桿狀,有菌毛，除個別外都有周鞭毛，普通無莢膜，均無芽孢。兼性厭氧，營養(yǎng)要求不高,不發(fā)酵乳糖或者蔗糖，對葡萄糖，麥芽糖，甘露糖發(fā)酵，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，其它沙門菌產(chǎn)酸產(chǎn)氣，可在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長最適宜溫度為37度,最適宜pH為7.4微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第26頁菌落特點:圓形,凸起,無色，細(xì)小，半透明,表面光滑,濕潤,直徑2-3mm.微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第27頁1、相同形態(tài)染色—從形態(tài)上無法區(qū)分

中等大小G-桿菌

多有鞭毛、菌毛腸道桿菌生物學(xué)性狀微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第28頁2、活潑生化反應(yīng)腸道桿菌生物學(xué)性狀乳糖發(fā)酵試驗初步判別腸道致病菌和腸道非致病菌腸道致病菌腸道非致病菌多數(shù)不發(fā)酵乳糖多數(shù)發(fā)酵乳糖微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第29頁腸道桿菌生物學(xué)性狀-/+-+傷寒桿菌--+痢疾桿菌-

⊕

⊕大腸桿菌硫化氫乳糖葡萄糖菌名微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第30頁

將糞便標(biāo)本以分區(qū)劃線法接種到SS培養(yǎng)基。(每個試驗室8個平板）(接種好后，做好標(biāo)識，用膠布按班綁好)放入37℃溫箱中培養(yǎng)二十四小時。取出放4℃冰箱中保留備用。分離培養(yǎng)方法微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第31頁三、消毒滅菌（2課時）1.細(xì)菌在自然界分布及理化原因?qū)?xì)菌影響2.高壓蒸汽滅菌法微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第32頁空氣中細(xì)菌檢驗（每個班1個平皿）

原理：依據(jù)空氣中攜帶有微生物氣溶膠（以固體或液體微小顆粒分散于空氣中分散體系稱為氣溶膠，其中氣體是分散介質(zhì)）粒子在地心引力作用下，以垂直自然方式沉降到瓊脂培養(yǎng)基上。

方法：在室內(nèi)選擇一處放一個平皿。揭開皿蓋，皿蓋扣置于皿底下，暴露放置15min，即蓋上皿蓋，放入37℃培養(yǎng)二十四小時，觀察結(jié)果。1.1細(xì)菌在自然界分布微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第33頁1.2.1紫外線對細(xì)菌影響（每個試驗室1個培養(yǎng)皿）原理：紫外線主要作用于DNA，使一條DNA鏈上兩個相鄰胸腺嘧啶以共價鍵結(jié)合成二聚體，從而干擾DNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄造成細(xì)菌變異或死亡。對病毒也有破壞作用。

紫外線殺菌作用強(qiáng)，而穿透能力弱。普通玻璃、紙張、水蒸氣、塵埃等均能阻擋。紫外線中波長為240-300nm者含有殺菌能力，其中265-266nm殺菌作用最強(qiáng)。慣用于消毒物體表面，手術(shù)室無菌試驗室，傳染病房空氣消毒及不耐熱物品消毒。1.2理化原因?qū)?xì)菌影響微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第34頁紫外線對細(xì)菌影響

取一個平皿，用密涂法將細(xì)菌涂布于培養(yǎng)皿中，然后按圖所表示揭開平皿蓋，置于紫外線下照射30分鐘，然后蓋好蓋子，置37℃培養(yǎng)24h后取出觀察結(jié)果。微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第35頁

1促進(jìn)菌體蛋白質(zhì)變性或凝固。2干擾細(xì)菌酶系統(tǒng)和代謝。3損傷細(xì)菌細(xì)胞膜，影響細(xì)菌化學(xué)組成，物理結(jié)構(gòu)和生理活動，從而發(fā)揮防腐、消毒至滅菌作用。

1.2.2化學(xué)消毒劑對細(xì)菌影響微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第36頁

有些化學(xué)藥品濃度高時能殺滅病原微生物，稱為化學(xué)消毒劑；濃度低時能抑制細(xì)菌生長，稱為防腐劑；

（只能外用，對細(xì)菌敏感性不一樣）化學(xué)消毒劑對細(xì)菌影響微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第37頁化學(xué)消毒劑分類1高效消毒劑：殺滅細(xì)菌芽孢在內(nèi)全部微生物，適合用于不耐熱力滅菌但要進(jìn)入人體內(nèi)部物品，如內(nèi)窺鏡等。次氯酸鈉、過氧化氫、甲醛、環(huán)氧乙烷等2中效消毒劑：不能殺滅芽孢，但能殺滅繁殖體（包含結(jié)核桿菌），真菌和大多病毒，如喉鏡，麻醉器材碘酊、乙醇等3低效消毒劑：能殺滅大多細(xì)菌繁殖體，但不能殺滅芽孢，結(jié)核桿菌及一些抵抗力強(qiáng)真菌和病毒。新潔爾滅、洗必泰、高錳酸鉀等微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第38頁影響消毒滅菌原因1微生物種類2微生物污染程度3環(huán)境中有機(jī)物4消毒劑性質(zhì)、濃度與作用時間5溫度、濕度、酸堿度6化學(xué)拮抗物微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第39頁化學(xué)消毒劑對細(xì)菌影響方法：取一普通平皿培養(yǎng)基，一部分寫上“前”，另一部分寫上“后”，然后將手指在寫有“前”部分沾一下，再將手指用酒精進(jìn)行消毒，在寫有“后”部分沾一下。放入37℃溫箱培養(yǎng)二十四小時后觀察。

（每個試驗室2個平皿）微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第40頁方法：用“打咳法”進(jìn)行檢驗。取一個血瓊脂平皿培養(yǎng)基（咽喉部多為葡萄球菌），打開平皿蓋，對著平皿咳嗽幾次（口腔前約10厘米），然后放入37℃溫箱培養(yǎng)二十四小時后觀察菌落數(shù)量及特征。

咽喉部細(xì)菌檢驗微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第41頁2高壓蒸氣滅菌法原理：蒸汽被限制在密閉容器內(nèi)，伴隨熱力作用壓力不停升高，蒸汽溫度也對應(yīng)升高，在103.4kPa蒸汽壓力下時，溫度可達(dá)121.3℃。維持15~20分鐘后可殺死細(xì)菌包含芽孢在內(nèi)全部微生物。微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第42頁高壓蒸氣滅菌器1)結(jié)構(gòu)高壓蒸氣滅菌器是一個雙層金屬圓筒，兩層之間盛水，外層堅厚，其上或前方有金屬厚蓋。蓋旁附有螺旋，借以緊閉蓋門，使蒸氣不能外溢。高壓蒸氣滅菌器上裝有排氣閥、安全閥，以調(diào)整器內(nèi)壓力，裝有溫度計及壓力表以示內(nèi)部溫度和壓力。器內(nèi)裝有帶孔金屬擱板，用以放置欲滅菌對象。微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第43頁高壓蒸汽滅菌法壓力：1.05kg/㎡

或103.425KPa溫度:

121.3℃時間：15-20min完全殺滅細(xì)菌繁殖體和芽孢用途：適合用于耐高溫、高壓，不怕潮濕物品，如敷料、手術(shù)器械、藥品、細(xì)菌培養(yǎng)基等微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第44頁全自動高壓蒸汽滅菌鍋微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第45頁SystecD-2002D雙門高壓滅菌器電熱臥式圓形壓力蒸汽滅菌器(型號YXQ-WY21-600)微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第46頁臺式蒸汽滅菌器BA-30微生物實驗醫(yī)學(xué)知識醫(yī)學(xué)知識專家講座第47頁全自動噴淋式