鏈激酶的研究進(jìn)展課件

鏈激酶的研究進(jìn)展一、背景血栓栓塞性疾病的致殘率和病死率都很高,嚴(yán)重威脅人類生命和健康。溶栓治療是治療血栓疾病的有效手段,因此溶栓藥物的研究進(jìn)展非常迅速,大致有三個(gè)階段:(1)第一代溶栓劑:以鏈激酶、尿激酶為代表,第一代溶栓劑在臨床治療中的應(yīng)用使血栓性疾病的病死率明顯降低,但它們存在著許多的缺點(diǎn),主要是沒(méi)有溶栓特異性,過(guò)多的降解了纖維蛋白原,導(dǎo)致出血等嚴(yán)重不良反應(yīng)。(2)第二代溶栓劑:以組織纖溶酶原激活劑和單鏈尿激酶為代表,兩者均有一定程度的纖維蛋白特異性,但它們依然存在半衰期短等缺點(diǎn)。(3)第三代溶栓劑:利用基因工程技術(shù)、蛋白質(zhì)技術(shù)和單克隆抗體技術(shù)對(duì)第一代和第二代產(chǎn)品進(jìn)行改造而制成的新型纖溶酶源激活劑產(chǎn)品。此類藥物在特異性、半衰期、溶栓效率等方面進(jìn)行了改進(jìn)和提高,但目前大多處于實(shí)驗(yàn)階段。二、鏈激酶簡(jiǎn)介鏈激酶(streptokinase，SK)是由溶血性鏈球菌的A、C、G族產(chǎn)生的機(jī)體由血纖維蛋白酶原(plasminogen，Pg)最有效的活化劑之一。只有病原性的A、C、G族鏈球菌的染色體上才具有SK基因。并不是所有的A族都能產(chǎn)生有活性的細(xì)胞外sK蛋白。不同來(lái)源的SK基因具有廣泛的異源性，A族和C族鏈球菌的SK基因在棱苷酸序列上只具有90%的同源性。即使在同一族內(nèi)(A族)相同和不同血清塑菌株間也有顯著的異源性。這種基因水平上的異源性導(dǎo)致了蛋白質(zhì)水平上免疫學(xué)和化學(xué)性質(zhì)的差異性。鏈激酶的研究歷史1933年Tillett等發(fā)現(xiàn)β-溶血性鏈球菌的培養(yǎng)濾液能產(chǎn)生一種可以溶解人血凝塊的物質(zhì)。1945年Christensen等發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)能激活纖維蛋白酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白酶,因而命名為鏈激酶。1972年Reddy闡明了SK的作用機(jī)理。1984年,Malke等從C.S.equisimilis中克隆得到了skc的基因。1995年Young等發(fā)現(xiàn)切除SK分子N端的15個(gè)氨基酸后比整個(gè)長(zhǎng)鏈的SK分子更容易在大腸桿菌中表達(dá)。2003年LakshmiV等對(duì)SK的氨基末端的159殘基進(jìn)行了研究分析,結(jié)果表明SK在無(wú)纖維蛋白作用下通過(guò)非蛋白質(zhì)水解來(lái)激活底物Pg。2005年RonaldRBean等研究了SK的α區(qū)域的作用,它能激活Pg中的Glu,Lys及Pm的Lys熒光素標(biāo)記。三、鏈激酶的作用機(jī)理SK與Pg形成等克分子的復(fù)合物，此復(fù)合物本身便是游離Pg分子的活化劑，其具體過(guò)程如下：Pg+SKSK-Pg復(fù)合物Pg+SK-Pg血纖維蛋白溶酶SK-Pg+SK-PlgSK血纖維蛋白溶酶鏈激酶的作用原理是激酶能將纖溶酶原激活為纖溶酶,使具有絲氨酸蛋白酶活性的纖溶酶能降解構(gòu)成血栓骨架的纖維蛋白,從而起到溶解血栓的作用。鏈激酶不能直接使纖溶酶原激活,而是和Pg形成1:1的等分子復(fù)合物,使纖溶酶原發(fā)生構(gòu)象改變,從而暴露出活性部位,該活性部位催化纖溶酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶。纖溶酶有兩個(gè)作用:一是迅速降解纖維蛋白原成小分子產(chǎn)物,這些降解產(chǎn)物不能參與血纖維網(wǎng)的形成從而阻礙血栓的形成;二是纖溶酶可以直接降解纖維蛋白,引起血栓溶解。+纖溶酶原r-SKSK纖溶酶原

復(fù)合物纖溶酶纖溶酶原被溶解血管再通血栓SK被溶解四、鏈激酶的修飾Pizzo用羰基二酰亞胺唑(1，1，_carbonyldiimidzazole)活化PEG，然后將其偶聯(lián)到sK蛋白Lys殘基的ε-NH2上，反應(yīng)機(jī)制如下圖：結(jié)果發(fā)現(xiàn)PEG—SK幾乎不被人抗SK抗體所識(shí)別，而且PEG—SK的半衰期也大大地延長(zhǎng)了。因此從功能性來(lái)衡量，PEG—SK不僅具有SK所具有的全部生物學(xué)活性，而且在許多方面還優(yōu)于SK，所以修飾的SK便能很好地用于溶血栓疾病的治療。五、重組鏈激酶及其三種突變體的活性研究

（1）SK及其三種突變體基因的克?。?）SK及其三種突變體在大腸桿菌中的表達(dá)的表達(dá)及其分離純化（3）SK及其突變體的活性比較（1）野生型SK基因的克隆根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的SK基因設(shè)計(jì)引物，對(duì)鏈球菌基因組進(jìn)行PCR增,測(cè)序獲得ska基因序列，根據(jù)測(cè)得ska序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，產(chǎn)物經(jīng)電泳分離純化后,直接連接到pGEM-T質(zhì)粒上,大量擴(kuò)增后再用NdeI/BamHI切下ska,連接到經(jīng)同樣酶切的pET-15b上,構(gòu)建表達(dá)野生型SK的表達(dá)質(zhì)粒pSK,酶切鑒定。表達(dá)SKΔC42質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)所測(cè)ska的序列設(shè)計(jì)引物通過(guò)PCR擴(kuò)增出編刪除SKC-末端的42個(gè)氨基酸殘基所得的突變體(SKΔC42)的基因skaΔC42,克隆pGEM-T載體上,再用NdeI/BamHI從上切下該基因,并連接到pET-15b上,構(gòu)建表達(dá)SKΔC42的表達(dá)質(zhì)粒pSKΔC42。表達(dá)SK-K59E和SKΔC42K59E的表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)所測(cè)序列設(shè)計(jì)引物，分別通過(guò)PCR擴(kuò)增出C-末端編碼區(qū)和刪除編碼C-末端42氨基酸殘基ska片段,兩個(gè)片段PCR產(chǎn)物分別連接到pGEM-T質(zhì)粒上,構(gòu)建pGEM-T-SKLK59E和pGEM-TSKSK59E,連在pGEM-T-SKLK59E質(zhì)粒上的ska片段中編碼Lys59的密碼子AAA突變成了編碼Glu的GAA,連在pGEM-T-SKLK59E質(zhì)粒上的ska片段中編碼Lys59的密碼子AAA突變成了編碼Glu的GAA且刪除了C-末端42個(gè)氨基酸殘基的編碼區(qū),將這兩個(gè)片段從上述兩個(gè)質(zhì)粒上用AflII與BamHI切下,分別連接到經(jīng)同樣酶切過(guò)的pSKΔC42及pSK上,分別構(gòu)建表達(dá)SK-K59E、SKΔC42K59E的表達(dá)質(zhì)粒pSK-K59E及pSKΔC42K59E。（2）編碼野生型SK及各種突變體的基因在大腸桿菌中的表達(dá)將表達(dá)質(zhì)粒pSK、pSKΔC42、pSK-K59E及pSKΔC42K59E分別轉(zhuǎn)E.coliBL21(DE3),液體培養(yǎng)重組大腸桿菌BL21(DE3)，至OD6001.0時(shí)，加入1mMIPTG，30℃誘導(dǎo)4h，離心收集菌體，SDS。結(jié)果表明重組SK、SKΔC42、SK-K59E、SKΔC42K59E分別占大腸桿菌總蛋白的45%、44%、44%、46%，由此可見(jiàn),無(wú)論是C-末端刪除還是K59突變成E59,都不影響SK或其突變體(SKΔC42、SK-K59E、SKΔC42K59E)在大腸桿菌中的表達(dá)量。重組SK及其突變體的分離純化

細(xì)胞裂解液中的可溶性SK或突變體經(jīng)親和層析,凝血酶酶切后,再經(jīng)DEAE-Sephadex離子交換層析及Superdex200凝膠過(guò)濾層析,分別得到了電泳純的重組SK、SKΔC42、SK-K59E、SKΔC42K59E。（3）SK及其突變體的活性比較

對(duì)純化的重組SK、SKΔC42、SK-K59E、SKΔC42K59E的活性測(cè)定表明,各1nmol的以上四種蛋白在2h內(nèi)水解酪蛋白形成的透明圈的直徑都是2cm,說(shuō)明以上SK及其突變體具有同樣的活性,且與等摩爾的鏈激酶標(biāo)準(zhǔn)品活性相同。這說(shuō)明刪除C末端的42個(gè)氨基酸殘基或?qū)59突變成E59或者同時(shí)刪除C末端的42個(gè)氨基酸殘基并將K59突變成E59三種突變并不影響SK的活性。六、不同鏈激酶的比較天然的SK價(jià)格低廉,但是由于該酶是從病原性溶血鏈球菌發(fā)酵而得,所以有一定的抗原性,對(duì)人體具有副作用易于引起全身纖溶從而增加出血的危險(xiǎn),此外制備中殘存的細(xì)菌溶血素對(duì)心肌和肝臟都有損害?；蛑亟M的鏈激酶(recombinantstreptokinase,r-SK)的抗原性弱于天然的鏈激酶(由C型β-溶血性鏈球菌提取),因此利用基因工程技術(shù)在E.coli中表達(dá)鏈激酶(r-SK)避免了使用致病性溶血鏈球菌可能帶來(lái)的危害,而且能大大降低成本,具有安全、高產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。而?；睦w溶酶原-鏈激酶復(fù)合物(APSAC)是近年來(lái)研制而成的一種新型的高效溶栓藥物,其分子量為130,000KD,在體外沒(méi)有生物活性。具有專一性強(qiáng)、與纖維蛋白親和力高、副作用小、半衰期長(zhǎng)、高效溶栓等特點(diǎn)。能促進(jìn)體內(nèi)纖維蛋白溶解系統(tǒng)的活力,使纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘睦w維蛋白溶酶,致使血栓溶解,血管再通。該藥物對(duì)