《禽流感病毒概述13000字》

1禽流感病毒的概述流感病毒是正粘病毒科的一員，其中禽流感病毒（AIV）屬于A型流感病毒。它是一種從呼吸系統(tǒng)疾病到嚴(yán)重系統(tǒng)性敗血癥等多種癥狀的傳染病。這是一種季節(jié)性流行病，每年都會(huì)發(fā)生，并可能伴隨著全球流感大流行的爆發(fā)。A型流感病毒引起的疾病以不可預(yù)測的間隔出現(xiàn)。A型流感病毒每年都會(huì)引起重大呼吸道疾病。非特異性感染的免疫反應(yīng)已被廣泛研究。A型流感病毒可以引起流行病，因?yàn)樗怯珊蝤B、豬、馬和人傳播的。因此，與季節(jié)性流感相比，發(fā)病率和死亡率都有所上升。根野生水禽A型流感病毒可分為H1-H16HA亞型和N1-N9NA亞型。A型流感病毒可以從其自然宿主傳播到許多其他物種，主要是家禽、豬和人類。根據(jù)宿主的來源，A型流感病毒可分為禽流感、豬流感或其他類型的動(dòng)物流感病毒。引起家禽小病的病毒稱為低致病性禽流感病毒。流感病毒的爆發(fā)除了對人體健康造成影響外，還將給家禽業(yè)、養(yǎng)豬業(yè)和賽馬業(yè)造成相當(dāng)大的損失。2禽流感病毒的分子生物學(xué)特性2.1禽流感病毒的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)（加結(jié)構(gòu)圖片）禽流感是一種單鏈負(fù)鏈RNA病毒，其包膜直徑為80-120nm，通常呈球形。典型的禽流感病毒在電子顯微鏡下呈球形（見圖1-1）。病毒的顆粒結(jié)構(gòu)（見圖1-2）可分為三層，最外層為雙層類脂膜。禽流感基因可分為8個(gè)片段（張?jiān)露穑?013），包括PB2基因、PBI基因、PA基因、HA基因、NP基因、NA基因、M基因、NS基因（StephensonI2003）。這8個(gè)片段編碼10種蛋白質(zhì)，分別是血凝素、神經(jīng)氨酸酶、核蛋白、非結(jié)構(gòu)蛋白、基質(zhì)蛋白和聚合酶復(fù)合物（RoizmanB2001）。聚合酶在病毒基因組復(fù)制和mRNA轉(zhuǎn)錄中起著重要作用，是病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵。目前，許多抗流感藥物已將該蛋白設(shè)計(jì)為一個(gè)重要的靶點(diǎn)，因?yàn)樗哂懈叨鹊谋Ｊ匦院筒灰淄蛔冃浴P和M的抗原性也是禽流感的分類標(biāo)準(zhǔn)之一。根據(jù)它們的不同，流感病毒可分為A型和B型，禽流感病毒屬于A型，其中A型流感病毒傳播范圍廣，傳染性強(qiáng)，造成的損失最為嚴(yán)重。禽流感病毒對熱敏感，可在100度2min或65度30min以上滅活。對乙醇、乙醚、丙酮、氯仿等有機(jī)溶劑非常敏感，但對酸不敏感。在強(qiáng)酸條件下仍有生存能力。當(dāng)暴露在紫外線下時(shí)，它很快就失去了傳染性，而且它還可以被陽光直射滅活40-4個(gè)小時(shí)（魏寶之，2013）。在自然條件下，糞便中的病毒具有很強(qiáng)的抵抗力，因?yàn)橛袡C(jī)化合物能給病毒帶來很好的保護(hù)（覃倫，2008）。已經(jīng)證明H9N2可以在不經(jīng)過中間宿主的情況下感染人。感染后，人們會(huì)有輕微的感冒癥狀，但不會(huì)致命。流感病毒一旦進(jìn)入人體，就會(huì)在人體內(nèi)大量復(fù)制，可能導(dǎo)致大規(guī)模流感病毒流行。流感病毒可能通過基因重排產(chǎn)生新的流感病毒亞型，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。如H7N9可能是近兩年流感病毒基因型重排和變異引起的，應(yīng)引起廣泛關(guān)注。因此，流感病毒基因的分析在公共衛(wèi)生領(lǐng)域具有重要意義。圖1-1流感病毒電鏡下的圖片圖1-2禽流感病毒的粒子結(jié)構(gòu)2.2禽流感病毒的理化性質(zhì)流感病毒易受環(huán)境穩(wěn)定性影響，對高溫、紫外線和消毒劑敏感。在56℃下加熱30分鐘，60℃下加熱10分鐘，65-70℃下加熱幾分鐘，在陽光直射下加熱40-48小時(shí)可使其失去活性。紫外線照射可破壞禽流感病毒的傳染性、神經(jīng)氨酸酶活性和血凝素活性。病毒顆粒具有膜結(jié)構(gòu)，對丙酮、乙醚、氯仿等有機(jī)溶劑高度敏感。普通消毒劑有效，能立即殺滅病毒。常用的消毒劑有復(fù)方止蘇、福爾馬林、季胺鹽消毒劑、其他醛和重金屬離子。當(dāng)20%乙醚在4℃下處理2小時(shí)時(shí)，病毒被分解，縮合增加而不受影響。在自然環(huán)境中，特別是在低溫潮濕的環(huán)境中，禽流感具有抵抗力，通過保護(hù)有機(jī)物可以長期存活。由于果汁具有蛋白質(zhì)的保護(hù)作用，病毒感染雞胚非常穩(wěn)定。病毒可在四周內(nèi)保存數(shù)周，但不影響病毒的傳染性以及HA和NA的活性。在-70℃或凍干條件下，可保持其長期感染性。2.3禽流感病毒的基因編碼蛋白及其功能2.3.1血凝素（HA）禽流感病毒是A型流感的一個(gè)亞型，是一種帶有包膜片段的單負(fù)鏈RNA病毒（Husain，2014）。它以同質(zhì)三聚體的形式存在于病毒表面，也是最為深入的蛋白質(zhì)。HA蛋白通過蛋白水解酶的作用形成HA1和HA2分子（Filpula,2007;Langleyetal.,2009），這兩種酶通過二硫鍵連接。在病毒感染過程中，HA蛋白被上述方法激活（Kennedyetal.,2004;Xuetal.,2004）。在血凝素裂解位點(diǎn)存在幾個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸是確定流感病毒致病性的重要分子標(biāo)記（Belseretal.,2017）。HA蛋白的糖基化也影響其致病性。此外，HA1分子有決定抗原變異的氨基酸位點(diǎn)，暴露在分子表面。HA蛋白在受體結(jié)合、融合、包裝結(jié)合和致病性方面發(fā)揮著重要作用（Bowesetal.,2004）。流感病毒表面的HA蛋白由頭和莖組成。頭部是流感病毒保護(hù)性免疫抗體的主要靶點(diǎn)，因此HA蛋白是疫苗研制的主要靶抗原（Edingeretal.,2014;Zhangetal.,2008）。HA蛋白與宿主細(xì)胞表面糖蛋白或糖脂分子末端的唾液酸受體結(jié)合，其受體結(jié)合位于HA的頭部（Samji,2009）。在酸性條件下也可以誘導(dǎo)膜融合。HA蛋白在流感病毒與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合中起重要作用。在感染的第一步，它可以識別并結(jié)合宿主細(xì)胞表面的特異性受體分子唾液酸受體分子。通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，細(xì)胞將病毒嵌入內(nèi)吞作用并進(jìn)入細(xì)胞。在細(xì)胞內(nèi)，由于ph值較低，形成酸性環(huán)境。在這種酸性環(huán)境中，ha蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆的變化，導(dǎo)致病毒膜融合并釋放vRNP進(jìn)入細(xì)胞。流感病毒感染的前提是，ha蛋白的前體分子ha0被宿主蛋白酶分解為兩個(gè)亞單位HA1和HA2（Dundonetal.,2010）。因此，流感病毒HA蛋白對宿主細(xì)胞蛋白酶裂解的敏感性將對流感病毒的毒力產(chǎn)生重要影響。例如，HPAIV對宿主具有高度致病性（Savul-Al，2000），并且容易引起全身感染，因?yàn)镠A蛋白裂解位點(diǎn)附近有多個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸，其可被宿主中廣泛存在的枯草桿菌蛋白酶樣裂解。但在HA蛋白的裂解位點(diǎn)附近只有一種堿性氨基酸，只能被胞外胰蛋白酶識別和裂解。由于蛋白酶只能由宿主腸道和呼吸道細(xì)胞分泌，病毒的復(fù)制范圍有限，只能在腸道和上呼吸道復(fù)制。HA蛋白裂解位點(diǎn)附近是否存在糖基化也會(huì)影響病毒的致病性。如果糖基化發(fā)生在HA蛋白的裂解位點(diǎn)附近，將阻止宿主蛋白酶接近裂解位點(diǎn)，降低蛋白酶對HA蛋白的裂解能力，從而影響致病性（Kawaokaetal.1984）。2.3.2神經(jīng)氨酸酶（NA）Na蛋白位于病毒顆粒表面，是另一種重要的糖蛋白分子，唾液酸酶。Na蛋白在病毒感染、病毒顆粒萌發(fā)和釋放過程中起著重要作用。在感染細(xì)胞的過程中，Na蛋白可以識別宿主細(xì)胞的唾液酸殘基，幫助病毒進(jìn)入細(xì)胞。在病毒出芽和釋放過程中，Na蛋白能切割細(xì)胞和病毒顆粒表面的唾液酸，防止病毒在細(xì)胞表面積聚，從而促進(jìn)病毒顆粒的出芽和釋放(Lambetal.,1983)。神經(jīng)氨酸酶是由莖面積、球形頭部和糖蛋白組成的四聚體（Fouchieretal.,2005）。在感染后期，Na可以切割宿主細(xì)胞表面的唾液酸和病毒顆粒，使病毒釋放并傳播感染，但病毒顆粒不會(huì)聚集。一些菌株的毒力增加也與鈉有關(guān)（Itoetal.,1998）。此外，Na的神經(jīng)氨酸酶活性參與了復(fù)制的早期階段（Kayaketal.,2004）。Na的氨基酸末端胞質(zhì)區(qū)高度保守。缺乏氨基末端細(xì)胞質(zhì)區(qū)域會(huì)影響病毒的包裝、感染和致病性（Air，1981；Kobayashietal，199）。在大多數(shù)情況下，HA和Na的長度是相似的。然而，當(dāng)Na短于HA時(shí)，病毒與受體的結(jié)合活性增加（Colmanetal.,1987）。此外，Na的長度與病毒復(fù)制和致病性密切相關(guān)（Hinshawetal.,1983）。發(fā)現(xiàn)Na蛋白是一種四聚體蛋白，其酶活性位于Na分子的頭部。Na分子頭部氨基酸的變化對病毒感染的酶活性和復(fù)制特性有重要影響。Na蛋白的莖長與致病性有關(guān)。卡斯特羅赫等人。已經(jīng)證實(shí)，Na蛋白干長度的變化可以影響細(xì)胞和雞胚中的病毒復(fù)制（castruccietal，1993）。Na基因部分位點(diǎn)氨基酸突變后，Na蛋白的唾液酸酶活性增強(qiáng)，增強(qiáng)了病毒對哺乳動(dòng)物的適應(yīng)性（maketal，2010）。此外，寡糖在Na蛋白的功能中起著重要作用。Na蛋白的糖基化可以提高Na蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和酶活性，有助于提高病毒的致病性。在功能上，HA蛋白是識別和結(jié)合宿主細(xì)胞表面的唾液酸，Na蛋白是切割唾液酸。這兩種功能是矛盾的。因此，維持HA和Na的活性平衡是十分必要的，這對病毒的致病性具有重要意義。2.3.3堿性聚合酶1（PB1）PBl基因含有2347個(gè)堿基，其中757個(gè)氨基酸由第25堿基編碼到第2298堿基。PBl蛋白主要負(fù)責(zé)與宿主的5'端帽結(jié)構(gòu)結(jié)合，促進(jìn)vRNA和mRNA的合成。PB1是流感病毒所有結(jié)構(gòu)蛋白中最保守的（Mostafa，A2016）。它有四個(gè)高度保守的基序，這是它的RNA聚合酶功能所必需的。進(jìn)一步研究表明，306個(gè)天冬氨酸、406個(gè)甘氨酸、445個(gè)天冬氨酸和481個(gè)PBl蛋白的賴氨酸是其功能所必需的，突變型流感病毒不會(huì)被保存。一些研究人員發(fā)現(xiàn)，PBl基因也有一個(gè)開放的閱讀框，在線粒體中編碼PBl-F2蛋白。體外實(shí)驗(yàn)表明，該蛋白對流感病毒無必要，但可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（Vidic，J2016）。PB1-f2的具體作用有待進(jìn)一步研究。2.3.4堿性聚合酶2（PB2）流感病毒聚合酶蛋白由PB2、PB1和PA蛋白組成，分子量分別為96KD,87KD以及85KD。這三種蛋白在細(xì)胞質(zhì)中合成，形成聚合物復(fù)合物并運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核，在核蛋白的幫助下催化病毒基因組RNA的合成。PB2基因含有2347個(gè)堿基，包括28-2307個(gè)編碼區(qū)和757個(gè)氨基酸。PB2蛋白作為病毒RNA復(fù)制的前體，具有識別和切割宿主5'端帽的功能。此外，該蛋白是流感病毒毒力和宿主特異性的重要標(biāo)志物（Zhang，Y.,Zhang,Q,2012）。例如，Mok等人發(fā)現(xiàn)H9N2株P(guān)B2蛋白D253N和Q591K突變能顯著增強(qiáng)多聚酶活性，誘導(dǎo)人巨噬細(xì)胞分泌更多腫瘤壞死因子A（TNF-A），顯著增強(qiáng)小鼠的致病性（Mok，C.K2014）。Wang等人還報(bào)道了H9N2株P(guān)B2蛋白產(chǎn)生M147L，E627K突變后病毒對小鼠的致病性增強(qiáng)（Wand，J2012）。在香港1997人感染H5N1禽流感病毒后，研究人員發(fā)現(xiàn)H5N1亞型禽流感病毒可分為兩組，具有不同的毒力。基因序列分析表明，兩組病毒PB2蛋白中含有627個(gè)氨基酸。強(qiáng)毒株627為賴氨酸，弱毒株627為谷氨酸（Hatta，M2001）。subbara等人還發(fā)現(xiàn)，人類流感病毒PB2蛋白中的627個(gè)氨基酸幾乎都是賴氨酸，而禽流感病毒的大多數(shù)氨基酸是谷氨酸（subbarao，e.k,1993）。結(jié)果表明，PB2蛋白的627個(gè)氨基酸是宿主特異性的分子標(biāo)記。2.3.5酸性聚合酶（PA）PA基因含有2233個(gè)堿基，其中716個(gè)氨基酸由第25堿基編碼到第2175堿基。該蛋白是三種聚合酶亞單位中唯一的酸性蛋白。推測其主要功能是延長MRNA鏈（nieto）。1992年）。與PB2一樣，PA蛋白中多個(gè)氨基酸位點(diǎn)的變化也會(huì)影響病毒的表型。陳華蘭等報(bào)道，H5N1流感病毒PA蛋白S224P和N383D突變將顯著增強(qiáng)病毒的毒力，PA蛋白224p位點(diǎn)增強(qiáng)H5N1病毒對鴨胚成纖維細(xì)胞的生長能力，383d位點(diǎn)增強(qiáng)其多聚酶活性（song，j,2015）。2.3.6核蛋白（NP）NP蛋白由頭部、主體和尾部組成。它與RNA具有很強(qiáng)的結(jié)合能力（Gieseetal，2017）。NP蛋白在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生磷酸化修飾，影響病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，抑制病毒的生長。NP蛋白在感染的不同階段以不同的形式存在于細(xì)胞的不同位置。在早期，NP蛋白幾乎存在于細(xì)胞核中，但在晚期，以VRNP復(fù)合物的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。NP蛋白與蛋白質(zhì)跨核膜轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。在病毒復(fù)制中，起著傳播載體的作用。病毒感染早期，病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制以VRNP復(fù)合物的形式啟動(dòng)。在復(fù)制后期，參與病毒的包裝和萌芽釋放。核蛋白NP可與VRNP復(fù)合物的重要組成部分PB2和PB1結(jié)合。它能在細(xì)胞中磷酸化并影響病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，從而抑制病毒的生長（HutchinsonE-Cetal，2012）。它在病毒復(fù)制過程中起著載體的作用。病毒感染早期，以VRNP復(fù)合物的形式進(jìn)入核起始基因組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。在后期，病毒被輸出到細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行進(jìn)一步的包裝和出芽釋放。2.3.7基質(zhì)蛋白（M）基質(zhì)蛋白M是最豐富的病毒蛋白，含有252個(gè)氨基酸。它位于膠囊的下面，有一個(gè)桿狀的結(jié)構(gòu)。它主要參與VRNP復(fù)合物的核輸出過程，在病毒復(fù)制中起重要作用。其次，它在病毒的形態(tài)發(fā)生和包裝過程中起著重要的作用，是連接病毒核心蛋白和外殼蛋白的橋梁。通過與補(bǔ)體分子C1qA結(jié)合抑制補(bǔ)體信號途徑的激活，病毒更容易從宿主免疫系統(tǒng)逃逸（董方元等，2015；劉波等，2013）。M1和M2是甲型流感病毒的兩種基質(zhì)蛋白。M1位于病毒顆粒包膜的下層，是病毒中最高的蛋白質(zhì)（Kayaketal，2009）。M1在細(xì)胞內(nèi)翻譯合成后在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)間穿梭，對流感病毒的復(fù)制有重要影響。M1蛋白作為一種重要的基質(zhì)蛋白，與病毒的HA蛋白、NA蛋白、M2蛋白胞質(zhì)區(qū)和vRNP復(fù)合物有直接的相互作用。利用M1蛋白橋，病毒的內(nèi)部核心成分與外部包膜蛋白成分相連（Rossmanetal，2011）。M2蛋白是一種多功能蛋白分子，在病毒復(fù)制周期的許多方面發(fā)揮著重要作用。M2蛋白具有質(zhì)子通道活性。病毒感染早期，在細(xì)胞內(nèi)吞酸性環(huán)境中，質(zhì)子通道活性被激活，質(zhì)子進(jìn)入病毒顆粒，pH值降低，促進(jìn)了脫殼的發(fā)生。抗流感藥物設(shè)計(jì)用于M2蛋白質(zhì)子通道的功能，如金剛烷類藥物，通過抑制M2蛋白質(zhì)子通道的活性，阻斷病毒脫殼的發(fā)生，抑制病毒的復(fù)制。M1蛋白含有252aa，是病毒蛋白中含量最高的。M1蛋白具有縮聚作用，因此在聚合物的兩側(cè)有正負(fù)氨基酸殘基。M1蛋白與病毒復(fù)制、包裝和形態(tài)發(fā)生密切相關(guān)（Liuetal，2018）。M1蛋白可在胞質(zhì)和細(xì)胞核間穿梭，參與vRNP復(fù)合物的輸出。M1蛋白與HA、NA、M2蛋白胞質(zhì)區(qū)及vRNP復(fù)合物直接相互作用，在病毒核心組分與外膜蛋白的連接中起著不可或缺的作用。M1蛋白具有RNA結(jié)合活性，能與單鏈RNA結(jié)合。此外，它還可以與補(bǔ)體分子c1qa結(jié)合，使病毒逃離宿主免疫系統(tǒng)，具有抑制作用。M2蛋白為97AA，無信號皮膚，以同源四聚體形式存在（TakedaM.，2002）。在低pH條件下，M2蛋白的構(gòu)象結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化，以保證質(zhì)子的傳導(dǎo)。M2蛋白只有97個(gè)氨基酸，但有的是質(zhì)子通道，有的是質(zhì)子選擇性濾光片，有的是“門”。M2蛋白在病毒的有效復(fù)制中起著重要作用。盡管病毒可以在體外生長而不具有這種活性，但如果抑制質(zhì)子通道的活性，就不會(huì)出現(xiàn)M1蛋白和vRNP復(fù)合物的分離和脫殼。同時(shí)，這種活性會(huì)增加反式高爾基體的pH值，使細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的HA蛋白構(gòu)象正常。M2蛋白參與包裝和芽接，乙酞化和膽固醇結(jié)合。2.3.8非結(jié)構(gòu)蛋白（NS）NS蛋白又稱干擾素拮抗劑，與病毒的致病性密切相關(guān)。它能通過不同的機(jī)制抑制干擾素的產(chǎn)生，并能結(jié)合自然免疫信號途徑的一些關(guān)鍵因素對抗宿主的自然免疫。由于NS蛋白具有核輸出信號和核定位信號，它可以在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間運(yùn)輸（吳向偉，2018；黃榮，2014）。NS1蛋白長217-37AA，存在于細(xì)胞核中，但在感染后期進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)（CookChampagne，2015）。NS1蛋白具有RNA結(jié)合域和效應(yīng)器結(jié)合域，它們之間有一段連接皮膚（Adamsetal，2013）。突變會(huì)對細(xì)胞內(nèi)定位和干擾素的產(chǎn)生產(chǎn)生一定的影響。不同亞型NS1蛋白的核信號不同。NS1蛋白最重要的功能是對抗宿主的自然免疫應(yīng)答。此外，NS1蛋白對細(xì)胞凋亡有顯著影響，與致病性密切相關(guān)（Fanetal，2013；Jianetal，2008）。在最早的階段，人們對NS2蛋白的存在有錯(cuò)誤的認(rèn)識，認(rèn)為成熟病毒粒子中沒有NS2蛋白。但隨著研究的深入，在成熟病毒顆粒中發(fā)現(xiàn)了NS2蛋白，但含量較少。在復(fù)制后期，可與M1蛋白配合，實(shí)現(xiàn)VRNP復(fù)合物的輸出。NS2有兩個(gè)核輸出信號，其突變可抑制病毒生長，延緩VRNP復(fù)合物的輸出。NS2蛋白影響病毒復(fù)制并調(diào)節(jié)感染期間mRNA、CRNA和VRNA的積累（Bullidoetal，2001）。NS1和NS2蛋白是流感病毒NS基因編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白。NS1蛋白是流感病毒的非必需毒力因子，但在流感病毒感染過程中具有多種協(xié)同作用。有報(bào)道稱，NS1蛋白在感染病毒時(shí)，通過NS1蛋白缺失或NS1蛋白截短，可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量干擾素，從而加速病毒清除（Egorovetal，1998）。結(jié)果表明，NS1蛋白通過抑制干擾素和干擾素誘導(dǎo)的蛋清而抑制宿主的免疫應(yīng)答。近年來，NS1蛋白作為流感病毒毒力的分子決定因子被廣泛研究。用NS片段置換法研究了可能導(dǎo)致小鼠死亡的WSN菌株。在1918的西班牙流感病毒NS片段替換后，在組織培養(yǎng)中生長良好，但其毒性在小鼠中減弱（Basteretal，2001），表明NS1蛋白在病毒的致病性中起重要作用。NS2蛋白在流感病毒中少量存在，有助于VRNP在病毒復(fù)制周期中從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，因此又稱為核輸出蛋白（Patersonetal，2012）。NS2蛋白含有核輸出信號。它與CRM1相互作用，介導(dǎo)新一代病毒的VRNP過程。當(dāng)NS2蛋白核輸出信號突變時(shí)，會(huì)引起功能異常，抑制病毒的生長。此外，在病毒復(fù)制過程中，NS2可以調(diào)節(jié)聚合酶蛋白的酶活性，在禽流感病毒感染后哺乳動(dòng)物的適應(yīng)中發(fā)揮重要作用。2.4禽流感病毒的復(fù)制與遺傳變異流感病毒在復(fù)制和傳播過程中，主要依靠自身的功能蛋白，利用宿主細(xì)胞內(nèi)的原材料合成自身的核酸和蛋白質(zhì)，從而產(chǎn)生新的子代病毒。病毒是一種嚴(yán)格意義上的細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，其生命周期需要在細(xì)胞內(nèi)完成。一般來說，RNA病毒的復(fù)制可以在細(xì)胞質(zhì)中完成。流感病毒雖然是RNA病毒，但其特點(diǎn)是其復(fù)制過程需要在宿主細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行。需要5’CAP寡核苷酸來指導(dǎo)流感病毒MRNA的轉(zhuǎn)錄。該引物來自細(xì)胞核中宿主MRNA前體的5'帽狀結(jié)構(gòu)（Fechteretal，2003）。流感病毒基因組為單鏈負(fù)鏈RNA。PB2蛋白能在宿主核內(nèi)捕獲宿主MRNA前體的5’CAP結(jié)構(gòu)，并作為自身轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過程。轉(zhuǎn)錄的MRNA被輸出到細(xì)胞質(zhì)中，其自身的蛋白質(zhì)在宿主翻譯元件的幫助下被翻譯。作為復(fù)制模板，病毒VRNA需要轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生CRNA。在這個(gè)過程中，轉(zhuǎn)錄可以在沒有引物的情況下開始，然后使用這個(gè)模板合成病毒后代的VRNA（hayetal，1982）。在轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中，MRNA和新的VRNA主要在早期合成，然后與新合成的PB2、PB1、PA和NP蛋白結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞核，形成新的VRNP復(fù)合物（譚偉等，2015）。同時(shí)，nucleus被導(dǎo)出，并完成了復(fù)制的早期階段。然后，在病毒蛋白的幫助下，它接近細(xì)胞膜并開始發(fā)芽（Elton，2001；Oneill，1995；Whittakeetal，1996）。在流感病毒的發(fā)生和釋放過程中，還需要宿主蛋白。一些研究表明RAB11與流感病毒的產(chǎn)生和釋放有關(guān)。當(dāng)Rablll的表達(dá)減少時(shí)，病毒的萌發(fā)和釋放過程減少（bruceetal，2010）。禽流感病毒的遺傳變異是其遺傳多樣性的主要機(jī)制。禽流感病毒的遺傳變異包括病原體突變和抗原突變等毒力突變，包括冷適應(yīng)突變、宿主適應(yīng)突變和條件毒力突變（李艷兵，2008）?？乖蛔兪乔萘鞲胁《咀畛Ｒ姷淖匀蛔兓??？乖剖怯刹《净蚪M中的點(diǎn)突變引起的。當(dāng)HA和NA點(diǎn)突變累積時(shí)，病毒的氨基酸序列發(fā)生變化，只有突變的氨基酸改變抗原決定簇，從而導(dǎo)致抗原突變（MontoA.S，2005）。抗原性的變化可以避免自然感染或疫苗接種引起的免疫防御，也降低了疫苗應(yīng)用的保護(hù)作用，這也是禽流感病毒疫苗需要定期更新的原因。抗原轉(zhuǎn)化是由基因重組引起的。當(dāng)兩種不同的禽流感病毒同時(shí)感染宿主細(xì)胞時(shí)，兩種病毒的基因片段可能相互交叉，導(dǎo)致新一代病毒顆粒基因重組，導(dǎo)致病毒抗原性發(fā)生很大變化。例如，自1996年發(fā)現(xiàn)HSN1的第一個(gè)AIV亞型以來，該亞型的NA基因重組產(chǎn)生了HSN2、HSN3、HSN6和HSN8亞型的新組合，導(dǎo)致新亞型的流行（Claesetal，2016）。病毒的毒力往往通過廣泛的重組和突變顯著增加（Marshalletal，2013年）。同時(shí)，將產(chǎn)生多種重組子和基因型，這將促進(jìn)新病毒株的出現(xiàn)。病毒在不同宿主中的持續(xù)傳播可能獲得跨越物種屏障的能力，從而擴(kuò)大病毒的宿主范圍和物種（Dongetal，2011）。3H9N2亞型禽流感病毒的流行病學(xué)3.1H9N2亞型禽流感病毒的宿主范圍以及致病性中間宿主在禽流感病毒的傳播中起著重要作用。這些中間宿主包括候鳥和鴨子。其中，鴨是貴州省多年來禽流感暴發(fā)的主要中間宿主。它們攜帶流感病毒但不攻擊，對禽流感的防控造成嚴(yán)重危害。低致病性禽流感的跨宿主傳播一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。研究表明，H9N2禽流感病毒可在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中增殖（王偉，2015）。事實(shí)證明，鴨H9N2禽流感病毒能在SPF小鼠的肺和氣管內(nèi)自由復(fù)制，并能導(dǎo)致部分小鼠死亡（朱光建，2012）。結(jié)果表明，H9N2禽流感病毒在氣管內(nèi)的復(fù)制和致病性強(qiáng)于在肺內(nèi)。（許丹文，2016）。從野生水禽中可以分離出大量的病毒血清型。H9N2可能是人禽流感病毒的孵化器。此外，HA和NA基因也有一些變異，可能會(huì)感染豬和人（趙東民等人，2016；韓慶功，2006）。孔興田等，也有研究表明，雞H9禽流感可直接感染小鼠而無需適應(yīng)（孔興田等，2017）。低致病性禽流感病毒正在突破物種之間的屏障，并在鳥類以外的動(dòng)物中傳播。隨著H9N2禽流感病毒感染譜的擴(kuò)大，該病毒不僅感染哺乳動(dòng)物，也感染人類。禽流感病毒不同株系間基因重組和突變頻率很高?？乖坪娃D(zhuǎn)化可引起抗原變異。病毒表面抗原蛋白的結(jié)構(gòu)易在單一位點(diǎn)發(fā)生突變，不僅改變了病毒的免疫特性，而且產(chǎn)生了新的抗原變異。H7N9是我國長江三角洲地區(qū)的一種新型重組病毒。2個(gè)基因片段來自禽H7N9病毒，6個(gè)基因片段來自禽H9N2病毒（劉穎，2016）。當(dāng)不同的病毒感染同一宿主時(shí)，它們之間發(fā)生基因重排、互補(bǔ)和表型混合。如果形成這種變異，其傳染性和致病性也會(huì)發(fā)生變化。然而，這種變化往往導(dǎo)致病毒株的出現(xiàn)，從而導(dǎo)致禽流感的爆發(fā)。一般來說，禽流感只在鳥類之間傳播，不會(huì)直接感染哺乳動(dòng)物和人類。當(dāng)病毒基因重組或突變后，將獲得感染哺乳動(dòng)物和人類的能力（蔣輝等，2017）。受體結(jié)合特性和蛋白質(zhì)關(guān)鍵位點(diǎn)變異是禽流感最常見的變異模式。2013年以來，我國H7N9禽流感疫情呈現(xiàn)明顯的季節(jié)性高發(fā)態(tài)勢。發(fā)現(xiàn)H9N2禽流感病毒為H10N8和H7N9禽流感病毒感染人類提供了一些內(nèi)部基因（曾志麗等，2017）。黃平等。利用分子鐘和MCMC模型估計(jì)H7N9基因結(jié)構(gòu)區(qū)的進(jìn)化速度，我們發(fā)現(xiàn)H7N9禽流感病毒進(jìn)化迅速（TakahashiH，2017）。來自不同宿主源的H9N2禽流感病毒可感染番鴨，對番鴨造成免疫抑制和不同程度的肺病理損傷（張凱，2016）。流感病毒H9N2亞型受體結(jié)合特征的關(guān)鍵氨基酸是N158糖基化缺失和Q226L突變（王敏，2016）。禽流感病毒結(jié)合受體的變化趨勢決定了感染宿主的范圍和致病性。一般認(rèn)為，低致病性禽流感病毒對SAa2,6Ga1受體具有親和力，表明其感染宿主范圍廣，毒力強(qiáng)。近年來，研究表明，H9N2亞型禽流感病毒也有這種變異，盡管它不如高致病性HS禽流感病毒明顯（TanLiugang，2016）。禽流感病毒與細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，這只是第一步。它還需要克服核膜屏障，向細(xì)胞核輸送病毒核酸，并利用宿主細(xì)胞進(jìn)行高效轉(zhuǎn)錄和復(fù)制（LiuSulietal，2017）。H9N2禽流感病毒通過HA受體結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸適應(yīng)性進(jìn)化，逐漸轉(zhuǎn)移到a-2,6唾液酸受體，使其感染更多的動(dòng)物。研究發(fā)現(xiàn)，不同糖鏈的有效結(jié)合也會(huì)使禽流感H9N2株更容易與哺乳動(dòng)物體內(nèi)普遍存在的α，2，6-唾液酸受體結(jié)合（鐘磊，2014）。大多數(shù)H9N2亞型禽流感病毒具有改變結(jié)合方式的趨勢，表明H9N2亞型禽流感病毒已獲得人受體的結(jié)合能力（王敏，2016）。這一趨勢仍在增加（Meietal，2018年，這意味著H9N2禽流感增加了感染哺乳動(dòng)物或人類的能力，并可能通過基因突變或重新排列引起新的流感大流行。3.2H9N2亞型禽流感病毒在我國的流行情況1999例H9N2感染病例在香港首次報(bào)道。1999）近年來，長沙市（劉曉磊，2016），四川?。ㄍ趺鬟B，2016），云南?。_春瑞，2017）等地區(qū)報(bào)告了首例H9N2感染病例。這些報(bào)告中的主要癥狀是發(fā)燒、咳嗽、喉嚨痛、扁桃體炎等，大多數(shù)伴有繼發(fā)性或混合性肺部感染。這些感染者一般都有與禽類接觸史，這也說明低致病性H9N2禽流感可以直接感染人。有研究者報(bào)道，我國職業(yè)接觸人群H9N2禽流感病毒血清陽性率為0.41（Xinlietal，2015），但H9N2報(bào)告陽性率普遍較高，特別是在一些沿海地區(qū)，H9N2的陽性率高達(dá)30%（張梅英等，2009；梁青等，2003），表明H9N2亞型禽流感已在一些地方流行。2013年3月底，中國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)宣布在上海和安徽發(fā)現(xiàn)一種新型H7N9流感病毒。該病毒在家禽中無癥狀且致病性較低（TakedaM，2002）。它開始敲響警鐘（Chen，2013）。2017年初，通過監(jiān)測發(fā)現(xiàn)H7N9流感病毒有新變化。在HA裂解位點(diǎn)插入多種堿性氨基酸，病毒的致病性也發(fā)生變化，成為高致病性H7N9流感病毒（TongS.,ZhuX，2013）。在湖南、河北、河南、天津、陜西、內(nèi)蒙古等中國地區(qū)，高致病性H7N9禽流感暴發(fā)給中國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失（高達(dá)，2013）。H7N9流感病毒引起了5波人類感染，第5波報(bào)告的人類感染人數(shù)幾乎占人類病例總數(shù)的一半。令人擔(dān)憂的是，第六波中可能會(huì)出現(xiàn)更多的人類感染。與H7低致病性禽流感病毒相比，H7高致病性禽流感病毒可導(dǎo)致家禽100%死亡（Cuietal，2016）。短時(shí)間內(nèi)病例的迅速增加令人擔(dān)憂，并引發(fā)了對大流行可能性的擔(dān)憂（VallirsG.E.，2018）。然而，影響流感病毒流行潛力的主要因素有三個(gè)：引起鳥類疾病的能力：鳥類對病毒的免疫力；以及病毒的傳播潛力（ZhengW.，2013）。流感的發(fā)生與流感病毒的活動(dòng)周期密切相關(guān)。大多數(shù)季節(jié)性流感發(fā)生在一年的冬季和春季。這個(gè)季節(jié)的氣候大多寒冷干燥，有利于病毒的生存和傳播。因此，在H7N9流感病毒發(fā)生后的幾年里，每年都有人報(bào)告H7N9禽流感病毒感染人并導(dǎo)致死亡。2016年底至2017年初，是由H7N9引起的第五個(gè)流感流行階段。與前4次流感爆發(fā)相比，流感爆發(fā)導(dǎo)致更多的感染和死亡，情況更為嚴(yán)重（林丹等，2017）。H7N9流感病毒對哺乳動(dòng)物有很高的易感性，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)復(fù)制和產(chǎn)生變化。每年流感都會(huì)感染H7N9流感病毒。禽流感病毒可能導(dǎo)致下一次流感大流行。首次分離到的H7N9流感病毒在HA裂解位點(diǎn)附近只有一個(gè)堿性氨基酸，但在2017年被分離到H7N9流感病毒（Shi，2017），在HA裂解位點(diǎn)附近有多個(gè)堿性氨基酸。這是HPAIV的一個(gè)分子特征，表明該病毒隨著時(shí)間的推移對宿主表現(xiàn)出較高的致病性。3.3H9N2亞型禽流感病毒的公共衛(wèi)生學(xué)意義H7N9繼續(xù)感染人類，在中國經(jīng)歷了五次大流行，構(gòu)成大流行威脅。H7N9的存活、繁殖、傳播甚至變異與LPM密切相關(guān)。目前，我國對H7N9病毒的防控主要是通過加強(qiáng)低分子量病毒的規(guī)范化管理，定期封市、清洗消毒，限制活禽或跨地區(qū)貿(mào)易，殺滅活禽，努力阻斷H7N9病毒在我國的傳播。來源。鐘良寧、楊澤峰、呂華坤、錢來曼等研究人員發(fā)現(xiàn)，定期關(guān)閉市場，清除LPM，可以有效降低人類感染H7N9病毒的風(fēng)險(xiǎn)，適當(dāng)延長關(guān)閉市場的效果更好。疫苗接種和抗流感藥物是預(yù)防禽流感的快速有效的方法。在我國第一波H7N9流行后，研制了H7N9疫苗，并獲得了H7N9滅活疫苗。但其免疫原性和安全性有待進(jìn)一步鑒定。由于H7N9疫苗抗原性差，需要強(qiáng)免疫或聯(lián)合佐劑發(fā)揮免疫保護(hù)作用。然而，目前還沒有預(yù)防H7N9感染的商用疫苗。支持藥物和神經(jīng)氨酸酶抑制劑仍然是AIV的主要治療策略。由于低致病性H7N9向高致病性H7N9的進(jìn)化以及NA中E115V和R289K的突變，人群對NAIs具有抗性。流感病毒抗原同一亞型或多亞型與廣譜反應(yīng)性抗體的反應(yīng)是目前研究的熱點(diǎn)。目前抗H7N9的單克隆抗體主要集中在膠體金試紙和免疫組織化學(xué)方面，而具有阻斷治療作用的單克隆抗體相對較少，主要針對HA，關(guān)于NA抗體的報(bào)道較少。MemoliMJ.等人指出抗NA抗體對降低流感的臨床癥狀和病毒復(fù)制時(shí)間有顯著作用。NA抗體被認(rèn)為是最有潛力的抗流感單克隆抗體。目前，國內(nèi)研究者如陳思、尹穎、余岳陽等主要集中在H7N9-NA抗體的診斷上，但國內(nèi)尚無治療性NA抗體的報(bào)道。JasonR.Wilson等人發(fā)現(xiàn)抗H7N9-NA單克隆抗體3C10-3。國外可保護(hù)小鼠免受H7N9病毒的致命攻擊，降低感染小鼠的發(fā)病率和死亡率。3c10-3也是第一株具有治療活性的N9單克隆抗體(Monoclonalantibody,MAb。隨后MarynaC.Eichelberger等人也發(fā)現(xiàn)了1E8,2F6,10F4、和11B2四株預(yù)防H7N9感染的NA單抗，具有一定的治療潛能。4H9N2亞型禽流感病毒的研究現(xiàn)狀禽流感病毒有多種亞型，其致病性有很大差異。為了解流感病毒株的致病性，通過對8周齡新感染雞的ICPI,ELDSO,MDT,IVPI的測定，介紹了NDV致病性的檢測方法。H9N2亞型禽流感病毒被鑒定為低致病性禽流感病毒（WilsonJR，2000）。H9N2禽流感病毒感染不會(huì)造成家禽大規(guī)模死亡，但具有發(fā)病突然、感染率高、分布廣泛等特點(diǎn)。在繼發(fā)性細(xì)菌中，H9N2亞型AIV感染引起嚴(yán)重的呼吸道癥狀，死亡率為20%～60%。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，H9N2亞型禽流感病毒感染可導(dǎo)致肉雞死亡。免疫抑制對我國養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展造成了嚴(yán)重的危害。H9N2亞型禽流感病毒感染降低了產(chǎn)蛋率、受精率和孵化率。如果細(xì)菌或其他病毒的第二次感染發(fā)生在病毒感染過程中，就會(huì)造成一定程度的死亡。應(yīng)用反向遺傳技術(shù)對H9N2亞型AIV的HA裂解位點(diǎn)進(jìn)行突變，經(jīng)氣囊傳代10代。結(jié)果表明，KSoda的毒力增強(qiáng)，75%的雞死亡?？梢酝茢?，如果H9N2流感病毒在自然條件下分解，可能成為高致病性AIV（wu，etal.2015）。此外，據(jù)報(bào)道，在實(shí)驗(yàn)室條件下，H9N2亞型禽流感病毒對鴨的致病性較低，不會(huì)導(dǎo)致鴨死亡（DoyleTM，2017）。盡管雞細(xì)胞中缺乏rig-i，但雞MAD-5受體也參與了IFN-p的產(chǎn)生，這可以彌補(bǔ)RIG-I在IFN-p產(chǎn)生中的作用（linetal，2012）。結(jié)果表明，感染H9N2亞型禽流感病毒的雞和鴨的細(xì)胞免疫功能存在差異（Uddin,S，2017)。低致病性禽流感病毒的死亡率相對較低，但禽流感病例每年都在家禽中發(fā)生，并帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失（Grochel，1999）。H9N2亞型禽流感病毒感染率高，死亡率低。但由于該病傳播范圍廣，傳播速度快，因此加強(qiáng)對該病的監(jiān)測十分重要。自1966年以來，在威斯康星州的土耳其發(fā)現(xiàn)并報(bào)告了一種H9N2亞型禽流感病毒。1994年，廣東省首次分為H9N2亞型禽流感病毒。H9N2亞型禽流感病毒在我國其他省份發(fā)現(xiàn)（Tarendeau,F，2002）。H9N2亞型禽流感病毒遍布世界各地，其宿主包括多種家禽、野生鳥類和鳥類。第一株H9N2亞型禽流感病毒在美國的土耳其被發(fā)現(xiàn)，隨后，卡沃卡等研究人員發(fā)現(xiàn)H9N2亞型禽流感病毒可以從海鳥中分離出來。它也從加拿大阿爾伯塔省的H9N2亞型禽流感病毒中分離出來。此外，一些研究人員從各種鳥類中分離出H9N2亞型禽流感病毒。例如，熊、麻雀、燕子和白鷺（BullidoR，2001）。據(jù)報(bào)道，發(fā)現(xiàn)有毒鳥類超過90只。其中，火雞、雞、鴨是自然條件下最易感染的鳥類。2013年，太陽從狗身上分離出H9N2亞型禽流感病毒，進(jìn)一步補(bǔ)充了H9N2亞型禽流感病毒的宿主范圍。在禽流感病毒的生態(tài)系統(tǒng)中，豬被認(rèn)為是“基因混合容器”。全球流感大流行病毒株是禽流感病毒和豬流感病毒基因重組的結(jié)果。1998，從香港豬中分離到兩株禽流感病毒，并被證明為H9N2亞型。這是第一次。從哺乳動(dòng)物中分離出H9N2亞型AIV，并將其分為H9N2亞型AIV。隨后，李開彥從福建省豬群中分離出一組H9N2亞型禽流感病毒（李開彥，2004）。這些研究表明H9N2亞型禽流感病毒感染豬。豬與其他亞型禽流感病毒適應(yīng)或重組后，會(huì)發(fā)生基因突變，新的禽流感病毒在人體內(nèi)有效復(fù)制，可能引起人類流感。H9N2亞型禽流感病毒廣泛存在于水禽中。臨床研究表明，H9N2亞型禽流感病毒可從大多數(shù)水禽中分離，但部分水禽是無癥狀隱性感染，但其糞便中所含病毒會(huì)污染水體和污染部位。錢仲明等。感染H9N2亞型禽流感病毒。中國東部禽流感爆發(fā)地區(qū)的家鴨。根據(jù)流行病學(xué)研究，從1603年的外套膜中分離到126株致病性禽流感病毒（錢仲明，2004），水禽與H9N2亞型AIV之間存在相對穩(wěn)定的寄生關(guān)系。H9N2亞型禽流感病毒可感染多種水禽，在10-15天內(nèi)很容易發(fā)生。鴨、鵝和雞都可能感染。如果你在病毒感染后繼發(fā)呼吸道感染，發(fā)病率和死亡率會(huì)增加。一般來說，治療慢性呼吸系統(tǒng)疾病的藥物對緩解氣道沒有明顯的作用。病程可維持2-4周左右，一般為輕度，死亡高峰，死亡率2%-0%。H9N2亞型禽流感病毒感染水禽或野生禽類后，感染的禽類成為長期攜帶和滅活病毒的有毒宿主（路易·艾爾，2003年）。H9N2亞型禽流感病毒預(yù)計(jì)在中國大陸的商品雞和水禽之間雙向傳播（BowesV.A，2004）。也就是說，禽流感病毒的宿主譜增加，對人類的威脅也在增加。禽流感病毒的流行病學(xué)監(jiān)測可以追蹤禽流感病毒的來源，有助于為禽流感病毒和人類感染的防治提供指導(dǎo)。

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