細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的流式細(xì)胞儀檢測

細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的流式細(xì)胞儀檢測一、簡介（limitingdilutionLDA）和單細(xì)胞PCR，應(yīng)用原位雜交技術(shù)和免疫組化方法觀察細(xì)胞因子蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)可以識別Th1Th2細(xì)胞，此方法可獲得較強(qiáng)的細(xì)胞內(nèi)信號，但此方法工作量大、主觀性強(qiáng)，難以進(jìn)行大樣本檢測，且人肉眼識別能力有很大的局限性，而ELISPOT及單細(xì)胞PCR技術(shù)，技術(shù)性強(qiáng)T－與些研究很難外推，因?yàn)門細(xì)胞與體內(nèi)T細(xì)胞功能相關(guān)性還未被揭示。與Picker采用了monensinPMA等藥物預(yù)孵，用Brefeldin(BFA)Monensin阻斷了胞內(nèi)高爾基體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)的方法使得細(xì)胞因子聚集淋巴細(xì)胞產(chǎn)生少量的細(xì)胞因子，通常要對T淋巴細(xì)胞體外活化進(jìn)行研究。在體外淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子已釋放出來，胞內(nèi)細(xì)胞因子信號較弱，難以進(jìn)行檢測。這1型與2(TBNK)不能分泌細(xì)胞因子。胞內(nèi)流式分析法是用抗細(xì)胞因子抗體與細(xì)胞表面或胞內(nèi)特定亞群標(biāo)志組合景。具有其它方法難以比擬的優(yōu)點(diǎn)：???????快速：流式定量檢測細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子可在一天內(nèi)完成，實(shí)驗(yàn)流程需6-8小時(shí)，實(shí)際操作時(shí)間為1-2小時(shí)，快速簡便；????????簡便：無需組織培養(yǎng)，可以全血分析，無需分離PBMCs；???????靈敏度高：高度靈敏的熒光標(biāo)記與檢測系統(tǒng)；???????高效：可以在同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)同時(shí)檢測兩種或更多種細(xì)胞因子，也可根據(jù)細(xì)胞免疫表型區(qū)分分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞的亞型，進(jìn)行多參數(shù)相關(guān)分析；???????安全：減少樣本處理與生物源性污染????????接近生物體的分析條件：全血檢測保留細(xì)胞及生化微環(huán)境更準(zhǔn)確反映了體內(nèi)狀況。二、所需儀器1.流式上樣管及細(xì)胞培養(yǎng)皿或板2.25%CO2，37℃孵箱?混勻振蕩器離心機(jī)?Tips流式細(xì)胞儀三、常用的標(biāo)本類型和處理方法全血EDTAACD8小時(shí)內(nèi)分析，超過8小時(shí)會導(dǎo)致活性的損失，一般細(xì)胞因子陽性細(xì)胞會減少。如不能在8內(nèi)檢測，應(yīng)將真空采血管水平室溫放置。自身血漿中外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)：使用肝素鈉抗凝的采血后，分離PBMCs，24小時(shí)內(nèi)分析。Ficoll分離10%(FBS)的RPMI－16402×106細(xì)胞/ml。細(xì)胞系與T細(xì)胞克?。赫{(diào)節(jié)細(xì)胞濃度2×106細(xì)胞/mL于新鮮培養(yǎng)基中。PBMCs1×紅細(xì)胞裂解液處理活化的外周血或者PBMCs，用PBSBSA10%的DMSO的PBS℃凍存。溶化后細(xì)胞置于染色管中，加上2～3mL5分鐘后，用破膜劑對細(xì)胞進(jìn)行破膜和染色。四、所需試劑1、細(xì)胞表面染色的熒光標(biāo)記的單抗試劑依據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇特殊表面標(biāo)志CD45CD3圈定T淋巴細(xì)胞CD4圈定T輔助淋巴細(xì)胞亞群CD8圈定T抑制淋巴細(xì)胞亞群CD19/CD20圈定BCD56圈定NK淋巴細(xì)胞CD14圈定單核細(xì)胞2提供FITC、PEAPC標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體3、溶血素：用外周全血檢測時(shí)需使用溶血素（R&D目錄號WL1000用于人或者WL2000用于小鼠；eBioscience目錄號00-4333）溶解紅細(xì)胞4、激活劑①?????Phorbol12-Myristate13Acetate(PMA)（Alexis，目錄號ALX-445-004-M001）DMSO0.1mg/mL分裝(20L)，－20℃儲存。勿反復(fù)凍融每次實(shí)驗(yàn)用無菌無疊氮鈉PBS1：100D.PMA25ng/mL細(xì)胞懸液②Ionomycin?（Alexis,目錄號ALX-450-006-M001）A.??????0.5mg/mLB.??????－20℃儲存C.?????每次實(shí)驗(yàn)用無菌無疊氮鈉PBS1：10稀釋儲存液D.?????Ionomycin終濃度1g/mL細(xì)胞懸液③?????StaphylococcalenterotoxinB(SEB)(Sigma,CatalogNo.S-4881)A.????無菌無疊氮鈉PBS0.5mg/mLB.????4℃儲存C.???SEB終濃度10g/mL細(xì)胞懸液④?????CD3：包被在培養(yǎng)板中，在蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑存在下活化未稀釋的血液細(xì)胞⑤?????CD28：加速不同刺激劑（包括SEB、CD3等）的活化效應(yīng)，濃度一般為10ug/ml5、阻斷劑阻斷高爾基體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)作用，使得刺激細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子聚集在胞漿內(nèi)Brefeldin-A(BFA)（eBioscience00-4506）DMSO5mg/mL分裝(20L)，-20℃儲存。勿反復(fù)凍融。每次實(shí)驗(yàn)用無菌無疊氮鈉PBS1：10稀釋儲存液4－5小時(shí)BFA10g/mL注意：BFA過度孵育會導(dǎo)致細(xì)胞活力下降②Monensin（eBioscience6、不含谷氨酰胺的RPMI-16407、固定劑：細(xì)胞在體外刺激后需要對細(xì)胞進(jìn)行固定。固定的目的在于通過蛋白的交聯(lián)和變性一方面使細(xì)胞因子固定在細(xì)胞內(nèi)，另一方面避免細(xì)胞表面抗原丟失。含4%的多聚甲醛PBS溶液（eBioscience，目錄號00-8222）8、10.0％疊氮化鈉的HanksHBB（eBioscienc將細(xì)胞膜穿孔，已利于熒光標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，于相應(yīng)的細(xì)胞因子結(jié)合9、其它試劑：無菌無疊氮鈉PBS，乙醇，含1%多聚甲醛的PBS，4℃儲存。五、細(xì)胞培養(yǎng)和刺激的基本方法劑和刺激時(shí)間，以獲得最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。下表提供了檢測一些常用細(xì)胞因子的推薦的活化方法。表1、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子流式檢測推薦的陽性對照活化方法檢測細(xì)胞因子檢測細(xì)胞因子陽性對照刺激方法IFN-g2(4-24TIMP-15TNF-?7(6小時(shí))IL-1a3(6小時(shí))人IL-2IL-4人IL-5人IL-6人IL-8/CXCL8人MCP-1/CCL2MIP-1a/CCL3MIP-1b/CCL4RANTES/CCL5IL-2IL-4IL-5IL-6IFN?

方法3(24小時(shí))方法2(4-24小時(shí))41單核細(xì)胞：方法3(6-12小時(shí))T細(xì)胞：方法618313(243(243(243(2419101011方法9or方法12方法94-6(monensin，10mg/ml的BFA)方法1:?只使用轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測2:人的PBMCs使用PMA(10ng/ml)Ionomycin(1uM)4-24小時(shí).3:人的PBMC使用LPS(0.5-1ug/ml)24小時(shí).方法4:人的PBMCs或者純化的CD細(xì)胞在包被人CD3IL-2（10202-IL-010）和IL-4（10204-IL-005）胞洗滌后在含有重組人IL-2IL-42PMA(10ng/ml)Ionomycin(16小時(shí)5:CD4T細(xì)胞使用PHA(10ng/ml)4days6:T細(xì)胞使用抗CD3的單抗、抗CD28的單抗和重組人的IL-1b(Lorre,et1994,ClinImmunoImmunopath70:1)7:使用PMA(50ng/ml)Ionomycin(500刺激8:PBMCs細(xì)胞使用重組人IFN(10285-IF-100)2IFN(10ng/ml)+LPS(1ug/ml)22小時(shí)或者使用相同的方法刺激THP-1.9:EL4在包被抗小鼠CD3(25ug/ml)的培養(yǎng)板中，使用抗CD28抗體(2ug/ml)PMA(5ng/ml)+Ionomycin(500ng/ml)6小時(shí)方法10:CDT細(xì)胞在包被小鼠CD3(25ug/mlCD28(2ug/ml)404-ML-005）的培養(yǎng)基培養(yǎng)兩天；然后在含有重組小鼠IL-2IL-43天；最后收獲細(xì)胞，使用PMA(5ng/ml)、Ionomycin(500和monensin6小時(shí)。11:ip巨噬細(xì)胞使用Mouseip1ug/mlLPS24小時(shí)方法12:小鼠脾細(xì)胞使用PMA(5ng/ml)和Ionomycin(500ng/ml)刺激6小時(shí)六、流式檢測細(xì)胞染色基本過程（以全血為例）1、收獲細(xì)胞：肝素鈉抗凝的靜脈血，按1：1與培養(yǎng)基混勻，加刺激劑，同時(shí)加蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑（參照說明書），4-62、阻斷Fc受體：用于消除非特異性的結(jié)合染色①?在小鼠，可使用純化的FcII/III受體的抗體（CD16/32），按照1ug/106細(xì)胞的用量，在染色緩沖液中4℃孵育15分鐘，PBS清洗后，直接進(jìn)行下一步染色。②對于人和大鼠，可直接使用過量的與熒光抗體相同來源和亞型不相關(guān)的純化Ig斷3、細(xì)胞表面染色①?20L于Falcon100L(15分鐘；②?加入溶血素，室溫暗處孵育10分鐘。（注意：PMA激活的全血可能會溶血不完全。）③離心500g5分鐘，棄上清4、固定和破膜①?加固定劑，室溫暗處孵育15分鐘，離心500g5分鐘，棄上清；②?加破膜劑溫暗處孵育10分鐘。（劑量參照說明書）③?23mLPBS500g55、細(xì)胞內(nèi)染色①?加入熒光標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體，混勻，室溫暗處孵育30分鐘。②?23mL500g5分鐘，棄上清，加入500LPBS500L1%PFA固定后再上機(jī)七、注意事項(xiàng)?標(biāo)本處理：避免使用絡(luò)合鈣的抗凝劑，如ACDEDTA，因?yàn)樗鼈儠拗柒}依賴性激活過程，推薦用肝素鈉。此外LPS8小時(shí)內(nèi)分析，超過8小時(shí)會導(dǎo)致活性的損失，一般細(xì)胞因子陽性細(xì)胞會減少。如不能8小時(shí)之內(nèi)檢測，應(yīng)將真空采血管水平室溫放置。效果。比如，要檢測PMAIonomycin同時(shí)刺激；如果用CD4做表面標(biāo)記，由于多數(shù)病人的CD4抗原會因PMA小時(shí)為宜，否則CD4下調(diào)影響分析選擇合適的對照：為保證結(jié)合的真是和可靠性，至少熒光設(shè)置以下對照：①未刺激對照：激活時(shí)由于BFA的存在抑制了胞內(nèi)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，因此在激活過程中產(chǎn)生?的抗原與細(xì)胞因子會滯留胞內(nèi)，未刺激對照也應(yīng)包含BFA。②?CD69CD69期望的水平，驗(yàn)。由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面而產(chǎn)生的背景染色。?Fc受體阻斷：使用試劑阻斷Fc受體可以有效減少非特異熒光染色，在小鼠可以用純化的抗小鼠的CD16/32（eBioscience,14-0161-81），在大鼠可以用純化的抗大鼠的CD32可以用過量的同種無關(guān)純化Ig或血清。??熒光素的選擇：檢測相對低表達(dá)細(xì)胞因子如IL-4時(shí)，應(yīng)選用PE或APC胞因子時(shí)最好也選用PEAPC標(biāo)記；同時(shí)檢測多種細(xì)胞因子時(shí)，弱表達(dá)的應(yīng)選用PEAPC，F(xiàn)ITC標(biāo)記最好用于高表達(dá)細(xì)胞因子如IFN-γ八、問題與解答問題 原因 解決細(xì)胞未激活制備儲存一節(jié)。

注釋PMA+Ionomycin4CD3+TCD69應(yīng)>90%Ca無CD69胞內(nèi)染色

使用了錯(cuò)誤的抗凝劑 素鋰避免使用ACD與等絡(luò)合鈣的抗凝劑。在使用通透液前先使用溶細(xì)胞未通透血素BFABFA-20℃

抗凝劑會影響激活。溶血素輔助細(xì)胞通透BFA失活或制備不當(dāng) 詳見BFA制備儲存胞內(nèi)染色陽性但很弱

抗細(xì)胞因子抗體濃度不對 按R&D推薦量使用熒光抗按操作程序通透后洗細(xì)胞通透后細(xì)胞在胞內(nèi)染色前未洗再胞內(nèi)染色

正常的激活T淋巴細(xì)胞IL-4表達(dá)通常<2%，應(yīng)使用PE或APC標(biāo)記背景染色熒光單抗不純或熒光與抗體太高 合不牢導(dǎo)致解析出的熒光染

R&D

使用試劑阻斷Fc受體可以有效減少非特異熒光染色，詳見Fc段受非特異結(jié)合非特異結(jié)合體阻斷節(jié)抗體與固定后的胞內(nèi)抗原親和使用R&D力低，需提高抗體濃度。IgR&DR&D過高的同型對照試劑胞損失洗滌離心步驟丟失細(xì)胞固定后細(xì)胞密度低于活細(xì)胞，需固定通透的細(xì)胞離心500g用高轉(zhuǎn)速離心。加樣步驟丟失細(xì)胞 棄上清帶走細(xì)胞 小心吸樣按操作步驟用FL3PMAPMA+I溶血不完全PMA+Ionomycin除碎片和未溶細(xì)胞全血較難溶溶血未在室溫進(jìn)行 在室溫進(jìn)行溶血Th1/Th2細(xì)胞研究方法Th1/Th2Th1和Th2細(xì)胞仍然是目前最有效的手段，特別是細(xì)胞內(nèi)因子標(biāo)記的流式細(xì)胞技術(shù)。近來由于細(xì)胞因子ELISA試劑盒的不斷涌現(xiàn)，為研究Th1/Th2細(xì)胞因子譜的變化提供了準(zhǔn)確、可靠、快速的測定方法。但研究CD4+淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子譜變化時(shí)需要將T除CD4細(xì)胞也存在Th1和Th2樣細(xì)胞因子譜的變化，甚至酸性粒細(xì)胞也具有產(chǎn)生多種細(xì)胞因子的能力，如酸性粒細(xì)胞可分泌IL-4IL-5IL-1αIL-6IL-8TNFαTGF等。因此單純通過細(xì)胞因子譜的變化難以有效識別Th1Th2細(xì)胞。根據(jù)T(CD4)(cytokineprofiles),將CD4細(xì)胞分為Th1和Th2Th1細(xì)胞主要分泌(IFN-γ)-2(IL-2)-β(TNF-β),介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答；而Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10IL-13等因子，促進(jìn)抗體的產(chǎn)生，介導(dǎo)體液輔助淋巴細(xì)胞并不產(chǎn)生典型的Th1或Th2細(xì)胞和相應(yīng)的細(xì)胞因子，而主要是由Th0細(xì)胞受特異抗原的刺激時(shí)，一方面向Th1方向發(fā)展，另一方面可能向Th2方向發(fā)展。如在結(jié)核感染轉(zhuǎn)狀態(tài)下可產(chǎn)生Th1和Th2雙向免疫反應(yīng)，在I型超敏反應(yīng)疾病時(shí)主要產(chǎn)生以Th2為主的免疫反應(yīng)。近幾年來研胞儀進(jìn)行Th1/Th2的檢測克服了傳統(tǒng)方