林謙DNA的生物合成

第4章DNA的生物合成生物體合成DNA的方式有兩種：DNA復制(DNAreplication):以DNA為模板合成DNA。逆轉(zhuǎn)錄(reversetranscription):以RNA為模板合成DNA。DNA復制存在于所有的活細胞中，逆轉(zhuǎn)錄主要存在于逆轉(zhuǎn)錄病毒中。DNA復制的忠實性高于逆轉(zhuǎn)錄。當前1頁，總共108頁。研究核酸的復制機理有什么應用價值？一、無細胞結(jié)構(gòu)生物的核酸復制

復制機理比較清楚。病毒RNA復制與藥物開發(fā)？抗HIV病毒藥物：疊氮胸苷，雙脫氧胸苷（均屬于核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑）；沙奎那韋(屬于HIV復制酶抑制劑)；Isentress(屬于HIV整合酶鏈轉(zhuǎn)移抑制劑)；……

病毒DNA復制與藥物開發(fā)？抗乙肝藥物：拉米夫定(屬于HBV聚合酶抑制劑)；……二、原核細胞的DNA復制大腸桿菌DNA的復制機理比較清楚。當前2頁，總共108頁。二、原核細胞的DNA復制細菌DNA復制與藥物開發(fā)？殺菌劑：氧氟沙星(通過作用于細菌DNA螺旋酶，抑制DNA的合成和復制)；…….

基因工程表達量：質(zhì)粒DNA生活在大腸桿菌中，其復制如何不受宿主控制，而其拷貝數(shù)很大？三、真核細胞的DNA復制人DNA的復制機理不清楚。端粒與衰老的關(guān)系？端粒與腫瘤的關(guān)系？腫瘤細胞DNA復制與藥物開發(fā)？當前3頁，總共108頁。4.1DNA復制4.1.1DNA復制的基本特征

DNA復制發(fā)生在原核細胞的細胞質(zhì)、真核細胞的細胞核、線粒體以及葉綠體的基質(zhì)中。所有的DNA復制具有以下特征：(1)以原來的DNA母鏈為模板，以dNTP為合成原料；(2)作為模板的雙鏈DNA分子需要解鏈以暴露隱藏在雙螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)的堿基序列，然后才能作為模板；

(3)以半保留方式復制；當前4頁，總共108頁。圖4-1DNA復制可能的三種方式以及Meselson和Stahl實驗的可能結(jié)果當前5頁，總共108頁。DNA的半保留復制證明實驗

1958年，Meselson和Stahl用15N標記大腸桿菌DNA，首次證明了DNA的半保留復制。（1）將大腸桿菌長期在以15NH4Cl作唯一氮源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得15N-DNA(圖a)。

（2）用普通培養(yǎng)基(以14NH4Cl作唯一氮源)培養(yǎng)15N標記的大腸桿菌，經(jīng)過一代以后，形成了一半15N和一半14N的雜合分子(圖b)。（3）兩代后出現(xiàn)等量的14N分子和15N-14N雜合分子(圖c)。

當前6頁，總共108頁。圖4-2Meselson和Stahl實驗的實際結(jié)果

當前7頁，總共108頁。密度梯度離心(densitygradientcentrifugation)：用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細胞組分進行分層、分離。不同顆粒之間存在沉降系數(shù)差時，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法。不同分子量蛋白

當前8頁，總共108頁。

(4)需要引物與DNA轉(zhuǎn)錄和翻譯不同，DNA復制不能從頭合成(Denovosynthesis)，只能從先合成好的引物3’-OH端延伸。

DNA復制的引物一般是6~15nt的RNA，少數(shù)是蛋白質(zhì)。

(5)復制方向總是5’→3’當前9頁，總共108頁。圖4-3證明DNA復制的方向始終是5′→3′的末端終止實驗

2’,3’-ddTTP可參入DNA鏈中導致末端終止，如果復制方向是3’→5’，則無法參入。當前10頁，總共108頁。

(6)復制起始于特定的區(qū)域，終止的位置不固定

體內(nèi)的DNA復制具有相對固定的起點。作為復制起點的核苷酸序列通常被稱為復制起始區(qū)。原核生物的DNA復制起始區(qū)只有一個，而真核生物的有多個。復制起始區(qū)一般具有三個共同的特征：一，由多個短的重復序列組成；二，通常富含有利于DNA雙螺旋解鏈的AT；三，能被特定的復制起始區(qū)結(jié)合蛋白識別。一旦DNA復制從起始區(qū)啟動，該區(qū)域的DNA首先解鏈，形成叉狀結(jié)構(gòu)，稱為復制叉。當前11頁，總共108頁。

真核生物DNA的復制速度比原核生物慢：真核生物的染色體結(jié)構(gòu)比原核生物復雜，復制時需解開核小體，復制后又需重新形成核小體，其DNA復制叉的移動速度不到大腸桿菌的1／20。

（1）對一個生物體基因組而言，復制起點是固定的，表現(xiàn)為固定的DNA序列，并識別參與復制起始的特殊蛋白質(zhì)。（2）復制叉主要以雙向等速的方式移動。（3）真核生物DNA的復制速度比原核生物慢，但真核生物基因組可以同時含有多個復制子。當前12頁，總共108頁。圖4-4細菌和酵母DNA復制起始區(qū)的序列特征

當前13頁，總共108頁。一旦DNA復制從起始區(qū)啟動，該區(qū)域的DNA首先解鏈，形成叉狀結(jié)構(gòu)，稱為復制叉。圖4-5真核生物DNA的多個復制叉結(jié)構(gòu)

當前14頁，總共108頁。圖4-6Cairns證明E.coliDNA雙向復制的實驗

(7)一般為雙向復制幾乎所有的DNA復制在起始區(qū)啟動后，會同時向兩個方向展開，進行雙向復制，每一個復制起始區(qū)形成2個復制叉。當前15頁，總共108頁。

(8)半不連續(xù)性由于DNA復制的方向總是5’→3’，而DNA的兩條鏈方向相反，因此在一個復制叉內(nèi)進行的DNA復制很可能以半不連續(xù)的方式展開，即其中的一條子鏈的延伸方向與復制叉前進的方向相同，連續(xù)合成，另一條子鏈的延伸方向與復制叉前進的方向相反，需要先合成一些小的不連續(xù)的片段，再將這些不連續(xù)的片段連接成一條新鏈，這樣的合成為不連續(xù)合成。當前16頁，總共108頁。岡崎片段——在DNA的復制過程中，由于滯后鏈的不連續(xù)復制而產(chǎn)生的短的核苷酸片段，稱為岡崎片段（Okazakifragments）。岡崎片段長度：原核生物常為1000-2000個核苷酸，真核生物要短些，常為100-200個核苷酸。岡崎片段的證明實驗：

（1）用3H-脫氧胸苷短時間標記大腸桿菌，提取DNA，變性后用超離心方法得到了許多3H標記的短的DNA片段。延長標記時間后，岡崎片段可轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓妮^長DNA鏈，因此這些片段必然是復制過程的中間產(chǎn)物。（2）用DNA連接酶溫度敏感突變株進行實驗，在連接酶不起作用的溫度下，有大量小DNA片段累積，說明DNA復制過程中至少有一條鏈首先合成較短的片段，然后再由連接酶連成大分子DNA。

當前17頁，總共108頁。圖4-7Okazaki的脈沖標記和脈沖追蹤的實驗

當前18頁，總共108頁。圖4-8Okazaki的脈沖標記和脈沖追蹤的實驗結(jié)果：至少有一條鏈是不連續(xù)合成的。

當前19頁，總共108頁。圖4-10DNA的半不連續(xù)復制

在復制叉中不連續(xù)合成的DNA片段為岡崎片段，連續(xù)合成的DNA子鏈稱為前導鏈，不連續(xù)合成的子鏈稱為后隨鏈。當前20頁，總共108頁。

(9)具有高度的忠實性

DNA復制出錯的機會很小，其忠實性明顯高于轉(zhuǎn)錄、反轉(zhuǎn)錄、RNA復制和翻譯。

DNA復制的高度忠實性歸功于細胞內(nèi)存在一系列互為補充的糾錯機制。當前21頁，總共108頁。4.1.2DNA復制的酶學

DNA復制涉及一系列的蛋白質(zhì)和酶?？赏ㄟ^互補和重建兩種方法來研究參與DNA復制的蛋白質(zhì)?；パa的原理是利用某種野生型蛋白質(zhì)去恢復特定的DNA復制缺陷突變體的復制功能，從而確定參與復制的蛋白質(zhì)。重建的原理是在體外復制系統(tǒng)(一般是比較簡單的噬菌體或病毒復制系統(tǒng))中，先人為去掉某種成分，致使復制不能正常進行，然后在復制系統(tǒng)中逐一添加分步收集的可能參與復制的蛋白質(zhì)提取物，看是否能夠恢復復制活性，從而確定復制蛋白。當前22頁，總共108頁。4.1.2.1DNApol

DNApol的全稱為依賴于DNA的DNA聚合酶，其本意是以DNA為模板，催化DNA合成的聚合酶。

DNApol是參與DNA復制最重要的酶，催化反應式為：引物-OH+(dNTP)n---------------------→引物-O-dNMP+(dNTP)n-1+PPi

反應中形成的PPi在細胞內(nèi)焦磷酸酶的催化下迅速被水解，使聚合反應趨于完全。所有的DNApol都折疊成類似于人右手的構(gòu)象。原核生物、真核生物和病毒的聚合酶的序列與結(jié)構(gòu)具有高度的保守性，表明它們可能具有共同的祖先。DNApol,DNA模板/鎂離子當前23頁，總共108頁。4.1.2.1.1原核細胞的DNApol已發(fā)現(xiàn)大腸桿菌有五種DNA聚合酶。

(1)DNApolI

也稱為Kornberg酶。具有5’→3’聚合酶、5’-外切酶、3’-外切酶活性。

5’→3’聚合酶負責DNA鏈的延伸，3’-外切酶則發(fā)揮校對功能，切除錯配的核苷酸。

5’→3’聚合酶、5’-外切酶活性相配合，可導致一條鏈帶有切口的DNA分子發(fā)生切口平移。當前24頁，總共108頁。圖4-14DNApolI催化的缺口平移

5’3’5’3’5’當前25頁，總共108頁。DNApolI被枯草桿菌蛋白酶Subtilisin切割后，分成兩個片段：大片段(Klwnow酶)含有大、小兩個結(jié)構(gòu)域，大結(jié)構(gòu)域具有5’→3’聚合酶活性，小結(jié)構(gòu)域保留3’-外切酶活性；小片段具有5’-外切酶活性。

Klenow酶有“校對”和“聚合酶”兩種活性狀態(tài)。在DNA復制過程中，首先合成RNA引物。RNA引物合成好后，與模板鏈一起誘導酶的構(gòu)象發(fā)生變化，致使在外切酶活性中心附近形成一個新的裂縫。隨后，RNA引物和模板鏈通過這個新的裂縫進入聚合酶活性中心，DNA子鏈的合成由此在引物的3’-OH端展開。當前26頁，總共108頁。圖4-12DNApol的聚合和校對

當前27頁，總共108頁。圖4-13Klenow酶的晶體結(jié)構(gòu)模型

當前28頁，總共108頁。(2)大腸桿菌的DNA聚合酶Ⅱ

（1）.DNA聚合酶Ⅱ具有5ˊ→3ˊ方向聚合酶活性，但酶活性很低，只有DNA聚合酶I的5％，不是復制中主要的酶；（2）.無5ˊ→3ˊ外切核酸酶活性；（3）.其3ˊ→5ˊ外切核酸酶活性可起校正作用。

結(jié)論：DNA聚合酶Ⅱ的生理功能主要是起修復DNA的作用。

(3)大腸桿菌DNA聚合酶IIIDNA聚合酶Ⅲ包含有多個亞基。（1）.它有5ˊ→3ˊ方向聚合酶活性，聚合活力最強，為DNA聚合酶I的15倍，DNA聚合酶Ⅱ的300倍（它能在引物的3ˊ-OH上以每分鐘約5萬個核苷酸的速率延長新生的DNA鏈）；（2）.有3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性，具有校正功能；（3）.無5ˊ→3ˊ外切核酸酶活性。結(jié)論：DNA聚合酶Ⅲ是大腸桿菌DNA復制中鏈延長反應的主要聚合酶。當前29頁，總共108頁。圖4-14E.coliDNApolIII全酶的結(jié)構(gòu)模型

當前30頁，總共108頁。圖4-15β滑動鉗的三維結(jié)構(gòu)

當前31頁，總共108頁。

(3)DNApolIV,VDNApolIV和V都屬于易錯的聚合酶，參與DNA的修復合成。

DNApolIV與DNApolII在細菌生長的穩(wěn)定期被誘導表達，一起修復這個階段的DNA損傷。

DNApolV在細胞進行SOS反應時被誘導合成。能在DNA模板有切口的地方催化DNA復制，無校對活性從而導致復制易錯，且進行性極低。

SOS反應指當細菌受到高劑量的輻射或突變劑的作用下，染色體DNA受到嚴重的損傷時細胞所作出的各種保護性應激反應。當前32頁，總共108頁。4.1.2.1.2真核細胞的DNA聚合酶

已發(fā)現(xiàn)真核細胞有15種以上的DNApol，最重要的是五種：真核細胞的DNA聚合酶和細菌DNA聚合酶的基本性質(zhì)相同，但一般都不具有核酸外切酶活性。DNA聚合酶α的功能主要是引物合成。DNA聚合酶β主要在DNA損傷的修復中起作用。DNA聚合酶δ是DNA復制的主要合成酶。DNA聚合酶ε的功能是在去掉RNA引物后把缺口補全。

DNA聚合酶位于線粒體基質(zhì)，負責線粒體DNA的復制和損傷修復。當前33頁，總共108頁。

(1)DNApol

具有聚合酶和引發(fā)酶的活性，負責RNA引物的合成。在DNA復制過程中，聚合酶

與復制起始區(qū)結(jié)合，先合成短的10ntRNA引物，再合成20~30nt的DNA，然后由聚合酶和取代。該酶無校對能力，但復制蛋白A與其結(jié)合后可降低出錯率。當前34頁，總共108頁。(2)DNApol和

聚合酶和具有3’-外切酶活性，即校對能力。喪失3’-外切酶活性將導致體內(nèi)突變率的增加。

(3)DNApol

DNApol是真核細胞中最小的DNA聚合酶，參與DNA損傷的修復，能夠填補DNA鏈上短的空隙。(4)DNApol

DNApol位于線粒體基質(zhì)，具有聚合酶活性、3’-外切酶活性和5’-脫氧核糖磷酸酶活性。DNApol負責線粒體DNA的復制和損傷修復。當前35頁，總共108頁。圖4-16真核細胞DNApolδ由PCNA三個亞基構(gòu)成的滑動鉗結(jié)構(gòu)（被包被的是DNA模板）

當前36頁，總共108頁。4.1.2.2DNA解鏈酶(helicase)DNA解鏈酶是一類催化DNA雙螺旋解鏈的酶。原核細胞和真核細胞都有多種DNA解鏈酶。解鏈酶通過水解ATP獲取能量，解開DNA雙鏈成單鏈。同時具有ATP酶活性，結(jié)合于起始點解旋的短DNA鏈后，借助ATP供給的能量，循環(huán)地改變構(gòu)象而解開DNA雙鏈，即斷開堿基對之間的氫鍵，形成兩條單鏈DNA。解鏈酶具有移位酶活性，能夠沿著被結(jié)合的DNA鏈單向移動，不斷解開DNA雙鏈。單向移動的特性被稱為解鏈的極性，據(jù)此可將解鏈酶分為3’→5’解鏈酶、5’→3’解鏈酶和同時從兩個方向移位的雙極性酶。當前37頁，總共108頁。圖4-17DNA解鏈酶的作用模型

當前38頁，總共108頁。4.1.2.3單鏈結(jié)合蛋白(SSB)SSB是一種專門與DNA單鏈區(qū)域結(jié)合的蛋白質(zhì)，本身沒有酶活性，通過與DNA單鏈區(qū)段的結(jié)合，在DNA復制、修復和重組中發(fā)揮以下作用：暫時維持DNA的單鏈狀態(tài)；防止DNA的單鏈區(qū)域自發(fā)形成鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)；包被DNA的單鏈區(qū)域；刺激某些酶的活性。原核生物的SSB與DNA單鏈的結(jié)合具有正協(xié)同效應，而真核生物的沒有。當前39頁，總共108頁。圖4-18E.coli-SSB與單鏈DNA結(jié)合的協(xié)同效應

當前40頁，總共108頁。4.1.2.4DNA拓撲異構(gòu)酶

拓撲異構(gòu)酶是一類通過催化DNA鏈的斷裂、旋轉(zhuǎn)和再連接而直接改變DNA拓撲學性質(zhì)的酶。不僅可以清除在染色質(zhì)重塑、DNA復制和轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生的正超螺旋，而且能夠細調(diào)細胞內(nèi)DNA的超螺旋程度，以促進DNA與蛋白質(zhì)的相互作用，同時防止胞內(nèi)DNA形成有害的過度超螺旋。當前41頁，總共108頁。I型拓撲異構(gòu)酶

(1)拓撲異構(gòu)酶I的共同特點：①對超螺旋DNA底物，僅切開雙鏈DNA中一條鏈，進行瞬間的切斷和連接，連環(huán)數(shù)L(1inkingnumber)改變一個；②不需提供反應的能量，因而不能催化需能量的超螺旋化反應。

(2)原核生物：E．coli的TopoI型酶不能除去正超螺旋，在E．coliDNA的復制叉行進中不能起作用，主要在DNA損傷的修復中起作用。

(3)真核生物：TopoI型對正超螺旋和負超螺旋的DNA都可以作用，能夠消除正、負超螺旋，有助于復制叉的行進。（但真核生物TopoⅡ型酶也能起這種作用。I型酶在真核DNA復制中的功能了解不多。在酵母中，拓撲異構(gòu)酶I可能是復制時主要的拓撲異構(gòu)酶，但它的功能可能被拓撲異構(gòu)酶Ⅱ取代。）當前42頁，總共108頁。II型拓撲弄構(gòu)酶(1).TopoⅡ的共同特點①能同時打斷底物雙鏈DNA的兩條鏈，并重新連接，因而每一次反應能改變兩個連環(huán)數(shù)；②需要能量。

(2).原核生物在大腸桿菌DNA復制中，拓撲異構(gòu)酶II起主要作用(又稱為DNA旋轉(zhuǎn)酶，DNAgyrase)。大腸桿菌DNA旋轉(zhuǎn)酶能使正超螺旋松弛，或者松弛的雙螺旋成為負超螺旋。在E．coli復制時，復制叉移動前方產(chǎn)生的正超螺旋將阻止DNA復制，DNA旋轉(zhuǎn)酶能產(chǎn)生負超螺旋以抵消正超螺旋，使DNA復制繼續(xù)前進。

(3).真核生物

TopoⅡ型酶能夠消除正、負超螺旋。

TopoⅡ廣泛存在于各種生物中，是完成復制必需的一種酶，在分開復制完成的兩個子代環(huán)狀雙鏈DNA的過程中必需的。

當前43頁，總共108頁。圖4-19DNA拓撲異構(gòu)酶的催化的轉(zhuǎn)酯反應

當前44頁，總共108頁。4.1.2.5DNA引發(fā)酶DNA引發(fā)酶是一類特殊的催化RNA引物合成的RNA聚合酶。由于DNA復制的半不連續(xù)性，引發(fā)酶在每一個復制叉的前導鏈上只需要引發(fā)一次，而在后隨鏈上則需要引發(fā)多次(一個岡崎片段需要引發(fā)一次)。大腸桿菌的引發(fā)酶是由dnaG基因編碼的一條肽鏈，在胞內(nèi)催化合成約11nt長的RNA引物。真核生物的引發(fā)酶活性由DNApol的兩個小亞基承擔。圖4-22E.coli引發(fā)酶的結(jié)構(gòu)模型

當前45頁，總共108頁。4.1.2.6切除引物的酶RNA引物只用于DNA復制的起始，細胞有專門切除RNA引物的酶。大腸桿菌切除RNA引物的酶是DNApolI或RNaseH。DNApolI具有5’-外切酶活性，RNaseH是一種專門水解與DNA雜交的RNA的核酸內(nèi)切酶。真核生物切除RNA引物的酶是核糖核酸酶H1、FEN1、FEN1/Dna2。當前46頁，總共108頁。4.1.2.7DNA連接酶DNA連接酶催化DNA中相鄰核苷酸的3’-OH和5’-P之間形成磷酸二脂鍵。

DNA連接酶在DNA復制過程中連接后隨鏈上相鄰的岡崎片段，使后隨鏈成為一條連續(xù)的鏈，而在DNA修復和重組中的作用則是“縫合”修復或重組過程中在DNA鏈上產(chǎn)生的切口。當前47頁，總共108頁。被連接的DNA鏈必須是雙螺旋的一部分，雙鏈DNA的某一條鏈上兩個相鄰核苷酸之間失去一個磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈斷裂。當前48頁，總共108頁。

參與大腸桿菌DNA復制的酶1.在DNA復制中，拓撲異構(gòu)酶打開超螺旋成雙鏈DNA，雙鏈DNA被DNA解鏈酶打開成單鏈DNA，單鏈DNA與單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合以保持穩(wěn)定，便于DNA復制的順利進行。

2.DNA聚合酶I在除去RNA引物和損傷修復中起重要作用；

DNA聚合酶Ⅱ的生理功能主要是起修復DNA的作用；

DNA聚合酶Ⅲ是大腸桿菌DNA復制中鏈延長反應的主要聚合酶；

DNA連接酶在DNA的復制和修復中起連接作用。

3.大腸桿菌的引發(fā)酶(primase)

在DNA復制中，引發(fā)酶(primase，DnaGprotein)催化RNA引物合成。當前49頁，總共108頁。4.1.2.8尿嘧啶-DNA糖苷酶

此酶是一種專門用來切除出現(xiàn)在DNA鏈上的非正常U的水解酶。

U出現(xiàn)在DNA鏈上通常有兩種原因：一是在DNA復制過程中，細胞中存在的dUTP“假冒”dTTP直接進入新合成的DNA鏈；二是DNA分子中的C發(fā)生自發(fā)脫氨基作用。當前50頁，總共108頁。4.1.2.9端粒酶

端粒酶的作用是維持染色體端粒結(jié)構(gòu)的完整性。端粒是位于染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)，由蛋白質(zhì)和DNA組成，其中的DNA稱為端粒DNA。端粒的主要功能是保護染色體，防止染色體降解和相互間發(fā)生不正常的融合或重組。端粒酶是一種反轉(zhuǎn)錄酶，能以自身RNA為模板，不斷合成新的端粒DNA序列添加到染色體末端，彌補端粒丟失阻止端粒縮短，并可能使得細胞最終逃脫程序性死亡，獲得無限增殖能力，即永生化。當前51頁，總共108頁。端粒在染色體末端形成帽子結(jié)構(gòu)，端粒含有特定的DNA重復序列，不同物種間這段DNA重復序列有所不同，圖中序列是四膜蟲的端粒DNA當前52頁，總共108頁。1978年首次發(fā)現(xiàn)四膜蟲端粒的分子組成：端粒染色體DNA端粒(CCCCAA)n(GGGGTT)n3’5’(TTGGGG)n(AACCCC)n(CCCTAA)n(GGGATT)n3’5’(TTAGGG)n(AATCCC)n人端粒的分子組成：當前53頁，總共108頁。染色體保護染色體結(jié)構(gòu)和功能的完整性對外:抵御核酸酶等外界因素的破壞對內(nèi):染色體DNA的末端復制問題當前54頁，總共108頁。線性DNA的兩端有可能被細胞內(nèi)的修復機構(gòu)當作損傷而進行非正常的“修復”,導致末端DNA的丟失或與其他雙鏈DNA融合，因此真核細胞要防止染色體末端被修復酶進行非正常修復的機制。哺乳動物端粒DNA突出的3’-端能與內(nèi)部的重復序列互補配對，形成精巧的D-環(huán)和t環(huán)結(jié)構(gòu)，在此基礎(chǔ)上，還有額外的蛋白質(zhì)結(jié)合的保護。端粒DNA上的蛋白質(zhì)可將DNA與修復機構(gòu)隔離，還可將端粒酶招募到端粒上來。當前55頁，總共108頁。圖4-25端粒DNA的防“修復”機制當前56頁，總共108頁。端粒的丟失與保護左側(cè)：在沒有端粒酶的保護下，隨著細胞的分裂，端粒的丟失導致染色體損傷；右側(cè)：端粒酶保護端粒，使整個染色體在每一輪細胞分裂中都得到完整的復制。當前57頁，總共108頁。圖4-26端粒酶的結(jié)構(gòu)模型

端粒酶由蛋白質(zhì)和RNA兩部分組成。每一個酶的RNA部分含有一段與端粒重復序列互補的序列。當前58頁，總共108頁。圖4-27端粒酶的作用機理

當前59頁，總共108頁。染色體DNA的末端復制問題：3’5’5’3’RNA引物3’3’RNA引物水解

DNA復制過程不能“自始至終”完整地復制整個線性染色體，而是每次都在其5‘末端留下一個空缺未能填補(即RNA引物降解)，如果細胞沒有辦法填補這些空隙，染色體DNA將隨著每一次的細胞分裂而不斷縮短，直至縮短到染色體的結(jié)構(gòu)基因而使細胞消亡。當前60頁，總共108頁。真核細胞染色體末端會隨著細胞分裂而縮短，這個縮短的端粒再傳給子細胞后，隨細胞的再次分裂進一步縮短。隨著每次細胞分裂，染色體末端逐漸縮短，直至細胞衰老。人類及其它脊椎動物染色體端粒的結(jié)構(gòu)是5′TTAGGG3′的重復序列,長約15kb。體細胞的端粒限制性片段(telomererestrictionfragmentsTRFS)大多數(shù)明顯短于生殖細胞，青年人的TRFs又顯著長于年長者，提示TRFs隨著細胞分裂或衰老，在不斷變短，主要是由于DNA聚合酶不能完成線性DNA末端復制所致。當前61頁，總共108頁。細胞分裂細胞分裂端粒長短與細胞生命歷程密切相關(guān)染色體端粒端粒細胞將停止分裂而趨于老化當前62頁，總共108頁。由于體細胞缺乏端粒酶活性，因此每分裂一次，端粒就縮短一點，到一定程度后細胞必然死亡。若將端粒酶基因轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的人細胞，被轉(zhuǎn)染的細胞重新獲得無限增殖能力。染色體末端的端粒DNA進行性的縮短是限制人細胞壽命的先決條件。相對地,端粒酶的激活,合成端粒的DNA被認為是細胞永生化和癌癥發(fā)展必需的一步。目前的資料證實,端粒酶對長期成活的組織和長期進行有絲分裂的細胞是必需的。當前63頁，總共108頁。人體細胞中端粒酶合成和延長端粒的作用是在胚系細胞中完成的，當胚胎發(fā)育完成以后，端粒酶活性就被抑制。即在胚胎發(fā)育時期獲得的端粒，應已足夠維系人體的整個生命過程中因細胞分裂所致的端粒縮短。所以，當人體出生以后，染色體端粒就象是一個伴隨著細胞分裂繁殖的“生命之鐘”，它歷數(shù)著細胞可分裂的次數(shù)同時也見證了細胞由旺盛地生長繁殖到走向衰老死亡的整個生命歷程?！碑斍?4頁，總共108頁。4.1.3DNA復制的詳細機制

DNA復制的基本單位是復制子(replicon)。任何一個復制子都含有一個復制起始區(qū)，有些復制子還可能含有特定的終止區(qū)。當前65頁，總共108頁。圖4-28E.coli的OriC結(jié)構(gòu)4.1.3.1大腸桿菌染色體DNA的復制大腸桿菌基因組DNA就是一個復制子，分為起始、延伸、終止和分離三個階段。當前66頁，總共108頁。

復制起點（oric，在遺傳圖的84min附近）由245個bp構(gòu)成，其序列和控制元件在復制起點中十分保守。有兩組短的重復序列，即三個13bp和四個9bp的重復序列(見圖)。

當前67頁，總共108頁。復制的起始過程

（a）DnaA蛋白與DNA纏繞結(jié)合：四個9bp重復序列為DnaA蛋白的結(jié)合位點，大約20個DnaA蛋白各帶一個ATP聚集結(jié)合在此位點上，DNA纏繞其上，形成起始復合物。

(b)打開一小段雙鏈DNA：HU蛋白是類組蛋白，可與DNA結(jié)合，促使雙鏈DNA彎曲。受其影響，鄰近三個成串富含AT的13bp序列被解鏈而成為開鏈復合物，能量由ATP供給。

(c)形成前引發(fā)復合物：解鏈酶DnaB六聚體隨即在DnaC幫助下結(jié)合于解鏈區(qū)。借助水解ATP的能量，雙鏈沿5ˊ→3ˊ方向移動解鏈，形成前引發(fā)復合物(preprimingcomplex)（見圖）。

復制前進過程還需要DNA旋轉(zhuǎn)酶（DNAgyrase，屬于拓撲異構(gòu)酶II，它能使正超螺旋松弛，或者松弛的雙螺旋成為負超螺旋）打開超螺旋。復制起始要求DNA呈負超螺旋。因為DnaA只能與負超螺旋的DNA相結(jié)合。當前68頁，總共108頁。圖4-30E.coliDNA復制過程中復制體的形成

當前69頁，總共108頁。圖4-31E.coliDNA復制的延伸

當前70頁，總共108頁。圖4-32E.coliDNA復制終止區(qū)的結(jié)構(gòu)

當前71頁，總共108頁。圖4-33子代DNA的分離

復制完成的兩個子代DNA分子以連環(huán)體的形式鎖在一起，在分配給兩個子細胞前必須去連環(huán)化。大腸桿菌的XerCD蛋白作為位點特異性重組酶，識別終止區(qū)內(nèi)的dif位點，切開DNA的兩條鏈，在交換后再連接。

當前72頁，總共108頁。圖4-34滾環(huán)復制4.1.3.2滾環(huán)復制某些噬菌體(如X174和M13)和一些質(zhì)粒在宿主細胞內(nèi)進行滾環(huán)復制。當前73頁，總共108頁。圖4-35D環(huán)復制

4.1.3.3D-環(huán)復制線粒體和葉綠體DNA進行D-環(huán)復制。當前74頁，總共108頁。

D-環(huán)型(D-loop)復制過程：（1）復制開始時，DNA在ori位點出現(xiàn)一個復制泡(replicativebubble)，雙鏈解鏈。（2）復制泡的親代分子中以(-)鏈作為模板，合成一條新鏈，并且將親代分子的(+)鏈置換出來。（3）隨著被置換的(+)鏈的增長，另一起始點被置換出單鏈形式，開始以(+)鏈為模板，合成另一條新鏈。當前75頁，總共108頁。4.1.3.4真核細胞細胞核DNA的復制真核細胞細胞核DNA的復制在很多方面與原核細胞極相似，主要差別為：

(1)需要解決染色質(zhì)和核小體結(jié)構(gòu)對DNA復制構(gòu)成的障礙；

(2)復制叉移動的速度遠遠低于原核細胞；

(3)具有多個復制起始區(qū)，以彌補復制叉移動慢的缺陷；

(4)岡崎片段的長度短于原核細胞；

(5)復制被嚴格限制在細胞周期的S期；

(6)在第一輪復制完成前不能開始第二輪復制；

(7)需要端粒酶解決端粒DNA末端復制的問題。當前76頁，總共108頁。圖4-36真核細胞DNA復制叉的結(jié)構(gòu)模型

當前77頁，總共108頁。圖4-37T7噬菌體DNA末端DNA的復制

4.1.3.5線狀DNA末端復制的問題凡是線狀DNA都有末端不好復制的難題，真核細胞細胞核DNA利用端粒酶來解決。其他類型的線狀DNA則有其他的解決方法。當前78頁，總共108頁。4.1.4DNA復制的高度忠實性

DNA復制具有高度的忠實性，有幾種機制保證了DNA復制的穩(wěn)定。4.1.4.1四種脫氧核苷三磷酸濃度的平衡細胞內(nèi)作為DNA合成前體的四種核苷三磷酸濃度的平衡對DNA復制的忠實性有很大的影響，負責合成脫氧核苷酸的核苷酸還原酶具有非常精細的調(diào)節(jié)機制以維持四種脫氧核苷三磷酸濃度的平衡。當前79頁，總共108頁。4.1.4.2DNA聚合酶的高度忠實性

DNA聚合酶根據(jù)模板鏈的核苷酸序列，按照Waston-Crick方式選擇正確的核苷酸，其機制為幾何選擇和構(gòu)象變化。錯誤的dNTP不能形成正確的幾何形狀，不適合進入酶的活性中心；而正確的dNTP很容易進入酶的活性中心。而且，一旦進入酶活性中心，正確的dNTP與模板鏈上的相應的核苷酸配對，酶的構(gòu)象被誘導迅速發(fā)生變化，使酶更好地包被堿基對，并采取合適的取向。如果錯誤的dNTP進入活性中心，酶構(gòu)象發(fā)生變化要慢10000倍。當前80頁，總共108頁。4.1.4.3DNA聚合酶的校對4.1.4.4錯配修復4.1.4.5使用RNA作為引物由于在DNA合成一開始核苷酸難與模板鏈形成穩(wěn)定的雙螺旋，所以很容易發(fā)生錯配。使用RNA作為引物，即使發(fā)生錯配也沒有關(guān)系，因為RNA最后要被降解。當前81頁，總共108頁。4.1.5DNA復制的調(diào)控4.1.5.1原核細胞DNA復制起始的調(diào)控大腸桿菌DNA的復制起始由Dam甲基化酶和復制起始蛋白DnaA控制。親代DNA分子兩條鏈均被甲基化，剛形成的子代DNA在OriC的GATC序列上是半甲基化的，與細胞膜結(jié)合的一種抑制蛋白與OriC結(jié)合，使DnaA蛋白無法識別、結(jié)合OriC。只有當Dam甲基化酶將子代DNA分子上的GATC序列全部甲基化后，抑制蛋白才與OriC脫離，DnaA蛋白才能與OriC結(jié)合，啟動下一輪復制。當前82頁，總共108頁。圖4-38甲基化對原核細胞DNA復制的調(diào)節(jié)

當前83頁，總共108頁。4.1.5.2質(zhì)粒ColE1的復制調(diào)控

ColE1質(zhì)粒DNA編碼兩個負調(diào)控因子：反義RNA(RNA1)和Rop蛋白，它們控制了ColE1質(zhì)粒DNA復制起始所必需的引物合成。1.大腸桿菌細胞內(nèi)RNA1的濃度決定了ColE1質(zhì)粒的復制起始頻率。(1)ColE1質(zhì)粒DNA復制所需的引物：RNA引物前體(RNA2)是以ColE1質(zhì)粒作為模板的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，轉(zhuǎn)錄起始于復制起點上游555個核苷酸處，經(jīng)RNaseH加工后成有活性的ColE1質(zhì)粒復制的引物。(2)RNA1的編碼區(qū)在RNA2編碼區(qū)的5ˊ末端，轉(zhuǎn)錄方向與RNA2相反，因此與RNA2的5ˊ末端互補。RNA1通過氫鍵配對與RNA2相互作用，改變了加工RNA2的二級結(jié)構(gòu)，從而阻止了RNaseH加工RNA2，使其不能轉(zhuǎn)化為有活性的引物。RNaseH特點：只識別DNA-RNA雜合雙鏈，不識別RNA-RNA雜合雙鏈。

(3)RNA1與引物RNA分子的作用是可逆的，其強弱與RNA1

濃度有關(guān)。當前84頁，總共108頁。結(jié)論：細胞內(nèi)RNA1的濃度決定了有活性的DNA復制所需的引物的生成。

2.Rop蛋白能提高RNA1與引物前體的相互作用，從而加強RNA1的負調(diào)控作用。

RNA1控制質(zhì)粒的拷貝數(shù)。

ColE1質(zhì)粒DNA復制所需的DNA聚合酶是宿主的DNA聚合酶I，轉(zhuǎn)錄反應依賴宿主的RNA聚合酶。補充：反義RNA(antisenseRNA)反義RNA—能與其他RNA(常為mRNA)堿基互補的RNA。當前85頁，總共108頁。4.1.5.3真核細胞DNA復制起始的調(diào)控真核細胞含有多個復制子，各復制子的復制都被限制在細胞周期的S期，但各復制子的啟動并不同步。真核細胞DNA復制起始受兩種機制調(diào)控。4.1.5.3.1由執(zhí)照因子控制的正調(diào)控酵母細胞DNA復制的啟動需要在各復制區(qū)起始區(qū)上形成起始區(qū)識別蛋白復合體(ORC)，這種復合體存在于DNA復制的全過程；隨后，一類在細胞周期G1期就積累在細胞核的執(zhí)照因子被招募到ORC上促進DNA復制的啟動。執(zhí)照因子包括Cdc-6蛋白、Cdt-1蛋白和MCM蛋白。當前86頁，總共108頁。圖4-39酵母細胞DNA復制的正調(diào)控

當前87頁，總共108頁。4.1.5.3.2由增殖蛋白控制的負調(diào)控增殖蛋白存在于細胞周期的G2期，阻止MCM蛋白裝配到新合成的DNA分子上，從而有效地防止在同一個細胞周期內(nèi)重復發(fā)生DNA復制的啟動。隨著有絲分裂的結(jié)束，增殖蛋白被降解稀釋，于是兩個子細胞在下一個細胞周期的S期能夠?qū)?zhí)照因子做出反應，啟動新一輪DNA復制。當前88頁，總共108頁。4.2逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄不僅存在于逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活史中，也存在于原核生物和真核生物中。4.2.1逆轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒包括外被、衣殼、基因組RNA。當前89頁，總共108頁。圖4-40（1）逆轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)當前90頁，總共108頁。圖4-40（2）逆轉(zhuǎn)錄病毒的詳細結(jié)構(gòu)

SU:表面糖蛋白TM：跨膜蛋白CA:衣殼蛋白MA:基質(zhì)蛋白NC：核衣殼蛋白RT：逆轉(zhuǎn)錄酶IN：整合酶PR：蛋白酶當前91頁，總共108頁。圖4-41逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的結(jié)構(gòu)

當前92頁，總共108頁。4.2.2逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活史常見的逆轉(zhuǎn)錄病毒包括勞氏肉瘤病毒、貓白血病病毒、小鼠乳腺腫瘤病毒、人類免疫缺陷病毒HIV。4.2.2.1附著與融合受體是CD4蛋白，存在于胸腺細胞、巨噬細胞、成熟T-淋巴細胞、朗格罕氏細胞、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞和精子的表面。輔助受體是趨化因子受體CCR5或CXCR4。配體是病毒外被上的表面糖蛋白gp120和gp41。

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