HIV梅毒檢測課件

HIV抗體、梅毒

篩查技術

2011.04.21HIV抗體篩查依據(jù)：

《全國艾滋病檢測技術規(guī)范》

（2009年修訂版）

《全國艾滋病檢測工作管理辦法》艾滋病檢測實驗室的管理國家對艾滋病檢測實驗室實行分類管理，按照實驗室的職能、開展檢測工作的性質及范圍共分三類實驗室，分別是艾滋病參比實驗室、艾滋病檢測確證實驗室、艾滋病檢測篩查實驗室（包括：艾滋病篩查中心實驗室、艾滋病篩查實驗室和艾滋病檢測點）

?；靖拍畎滩?AIDS)又稱獲得性免疫缺陷綜合征，是由人類免疫缺陷病毒(HIV)感染所引起的一種免疫缺陷性疾病。HIV在病毒分類中屬逆轉錄病毒科慢病毒屬中的人類免疫缺陷病毒組。全球流行的HIV可分為2型：HIV-1型和HIV-2型。HIV-1型是引起艾滋病流行的主要病原（90%以上）。HIV-2型主要局限于西非等國。應用免疫印跡法(WB)可以將二者明確地區(qū)別開來。HIV形態(tài)與結構HIV呈球形，直徑100-120nm內(nèi)含RNA分子及酶（逆轉錄酶、整合酶喝蛋白酶）外層有包膜，膜上為突起插入，突起由糖蛋白（gp120）和跨膜蛋白（gp41）以共價鍵連接而成。HIV基因：3個結構基因和6個調(diào)節(jié)基因3個結構基因：env、gag、pol表達的蛋白：env---gp160、gp120、gp41gag---p55、p24、p17pol---p66、p51、p31

HIV感染機理

（二）

感染HIV后，機體針對HIV基因編碼的抗原性物質產(chǎn)生相應抗體，在臨床上具有重要診斷學意義的主要是對抗結構基因編碼抗原(如gpl60，gpl20，gp41，p66，p55，p51，p31，p24，p17等)的抗體。由于個體差異、各種病毒蛋白的濃度和抗原性強弱不同及不同個體對不同抗原成分的反應性均有所不同，因此相應抗體的產(chǎn)生時間和不同個體對相同抗原成分的免疫應答強度等存在一定差別，此外，檢測方法和使用試劑的敏感性不同對HIV抗體的檢出時間產(chǎn)生一定影響。在感染HIV后，患者血清中最先出現(xiàn)p24抗原，繼之，各種HIV抗原可達到高峰；2-6周后，隨著HIV-l抗體產(chǎn)生及濃度的不斷增加，HIV抗原漸趨降低或檢測不出。臨床通用ELISA、免疫印跡法（WB）和目前開始推廣的快速診斷法檢測HIV抗體。HIV感染的主要檢測方法（一）目前檢測HIV的方法很多，總體來說可以分為抗體檢測和病毒檢測兩大類。病毒檢測包括細胞培養(yǎng)(病毒分離)、p24抗原檢測和病毒核酸檢測。早期對HIV的診斷主要是通過血清學試驗檢測抗HIV的抗體,間接地診斷HIV感染。近幾年，分子生物學方法不斷被應用到HIV的檢測中，HIV的實驗室診斷方法取得了很大的進展，核酸檢測已經(jīng)成為了HIV實驗室診斷的發(fā)展方向。HIV感染窗口期窗口期的問題？抗體通常是在感染后3～8周能夠被檢測出來。95%在三個月可以檢測出抗體。在窗口期，病毒抗體不能被檢出，但可以檢測到病毒相關抗原或分離病毒?？乖軌蛟趥€體感染后先于血清轉化2～18d被檢測到。因此，在血清轉化期通過檢測p24抗原作為早期輔助診斷HIV感染的一種方法。HIV檢測程序及流程圖篩查試驗:標本驗收合格后，用篩查試劑進行檢測，如呈陰性反應，報告HIV抗體陰性；對呈陽性反應的標本，須進行重復檢測復檢:對篩查呈陽性反應的標本用原有試劑和另外一種不同原理或不同廠家的試劑重復檢測。如兩種試劑復測均呈陰性反應，則報告HIV抗體陰性；如均呈陽性反應，或一陰一陽，需送艾滋病確認實驗室進行確認。應盡可能將重新采集的受檢者血液標本和原有標本一并送檢。樣品樣品初篩試驗篩查試劑陽性反應陰性反應復檢試驗一陰一陽均陰性反應均陽性反應陰性報告送確認實驗室確認試驗篩查試驗的流程圖

原有試劑+另一不同原理（或廠家）試劑或另外兩種不同原理（或廠家）試劑

酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)

基本原理:是免疫反應物通過化學或免疫學的方法形成酶結合物，酶結合物能與待檢樣品中相應的抗原或抗體結合成為免疫復合物,然后加入酶底物,經(jīng)酶的催化或水解作用,無色底物產(chǎn)生顏色,用肉眼、酶標儀觀察結果。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。初篩用的HIVELISA試劑目前已經(jīng)發(fā)展到第四代檢測試劑。

第一代試劑主要以病毒裂解物或部分純化的病毒抗原包被反應板,以檢測血清中的抗體。由于包被的抗原不很純,假陽性率較高。

第二代試劑使用基因工程方法得到的重組抗原和合成肽包被反應板，由于純化抗原的使用,特異性有了很大提高。

第三代試劑使用雙抗原夾心法檢測抗體,進一步提高了敏感性。--目前國內(nèi)外主要使用第三代

第四代試劑則在第三代的基礎上進一步增加了P24抗原的檢測,把HIV抗原和抗P24的抗體同時包被反應板,可同時檢測血清中的HIV抗體和P24抗原。檢出時間提前了4-9.1d，用于血源篩查等。快速檢測（RT）（1）常用的主要有以下幾種：明膠顆粒凝集試驗（PA）：PA是HIV血清抗體檢測的一種簡便方法，是將HIV抗原致敏明膠顆粒作為載體，與待檢樣品作用，混勻后保溫（一般為室溫）。當待檢樣品含有HIV抗體時，經(jīng)抗原致敏的明膠顆粒與抗體發(fā)生抗原-抗體反應，根據(jù)明膠顆粒在孔中的凝集情況判讀結果。斑點EIA或稱斑點ELISA（dot-EIA）：以硝酸纖維膜為載體，將HIV抗原滴在膜上成點狀，即為固相抗原。加血清樣品作用，以后步驟同ELISA。陽性結果在膜上抗原部位顯示出有色斑點。反應時間在10min以內(nèi)，使用抗原量少?？焖贆z測（RT）（2）斑點免疫膠體金（或膠體硒）快速試驗

金標紙條采用雙抗原夾心法免疫測定原理，選擇經(jīng)純化的基因工程制備的gp36、gp41、p24抗原作為包被抗原和gp41、gp36基因工程抗原和p24合成肽作為膠體金結合抗原。當待檢標本中含有HIV抗體時，先和金標記抗原結合，由于層析作用反應復合物沿硝酸纖維膜向前移動，當遇到包被抗原時，形成Ag-Ab-Ag-Au復合物而富集在包被線上，形成紅色沉淀線。同時在包被膜上還有一條質控線對照，故當有兩條紅線時判為陽性，只有一條紅線時，判為陰性。該方法試劑穩(wěn)定，可室溫長期保存。試驗時不需任何設備，迅速、簡便、特異性較好，敏感性約相當于中度敏感的ELISA，適用于應急檢測、門診急診個體檢測，尤其是基層單位。樣本要求1.采集靜脈血清或血漿，并避免樣品溶血。2.如果血清或血漿樣本收集后7天內(nèi)檢測，樣品須放在2-8℃保存，如果大于7天則須冷凍（-20℃）保存。3.如果要使用血漿樣本，需使用EDTAK2或EDTAK3抗凝，使用其他抗凝劑的血漿樣本可能會得到不正確的結果。【建議最好不使用肝素鈉抗凝劑的血漿標本】。膠體金快速試驗-結果判斷

1、陽性：測試卡在檢測區(qū)（T）和對照區(qū)(C)位置各出現(xiàn)一條紫紅色條帶（共2條紅色帶），判為陽性?！咎貏e注意：測試區(qū)（T）內(nèi)的紫紅色條帶可呈現(xiàn)顏色深淺的現(xiàn)象。在規(guī)定的觀察時間內(nèi)，不論該色帶顏色深淺，即使只有非常弱的色帶也應判定為陽性結果。檢測線顏色的深淺的程度與樣品中抗體的滴度沒有一定的必然聯(lián)系。陽性標本必須使用其他方法確認?！?、陰性：測試卡只在對照區(qū)(C)位置出現(xiàn)一條紫紅色條帶。3、失效：對照區(qū)(C)未出現(xiàn)紫紅色條帶，表明不正確的操作過程或試劑盒已變質損壞或者是樣本中抗體的含量過高。在此情況下用新的測試卡重新測試。如果問題仍然存在，應立即停止使用此批號試劑。陰性反應陽性反應檢測過程中生物安全要求

◆檢測過程應將所有檢測標本視為有感染危險的標本（1）、采血和測試過程中一定要帶手套，采血取出針頭時要絕對避免針頭刺傷：不許用手直接套回針頭防護套；避免直接接觸血液；◆如遭抽過血的針頭刺傷，應立即將傷口的血擠出，先用肥皂和清水沖洗傷口，再用75%酒精等徹底洗潔，并按HIV職業(yè)暴露后預防的相關程序處理；◆衣物沾上血跡要用75%酒精濕潤的紙巾檫掉，然后用75%酒精濕透；（2）不可在檢測過程中吸煙、進食、喝飲料、美容和處理隱形眼鏡；（3）用消毒劑對濺出的樣品或試劑進行消毒。似疑陽性標本的送檢要求（一）1、全血標本必須分離出血清或血漿，裝入帶螺旋口的樣品凍存管中送檢?！緡澜獦吮舅蜋z】2、血清或血漿標本的量不能少于1ml。避免溶血標本送檢。3、標本送檢時必須全項目填寫《艾滋病檢測點HIV抗體復檢檢測單》，標本人的姓名必須與本人身份證的名字一致，不得使用同音字。特別注意標本人身份證號的準確填寫。并附標本人的身份證或者戶口薄復印件一并上送。似疑陽性標本的送檢要求（二）4、送檢標本的包裝：*標本管上必須有明確的標識(包括姓名、編號、采血日期等)；*標本管一定要旋緊螺旋蓋，先裝入放滲漏的小塑料袋中，然后放入配發(fā)的專用送樣瓶中，周圍用泡沫等軟物固定，放入冰袋，蓋緊送樣瓶蓋子。*注意嚴禁將送檢單等送檢資料放入樣品瓶中送檢，樣品必須與送檢資料分離送檢。梅毒－實驗室檢查方法一、暗視野檢查/鍍銀染色法二、非梅毒螺旋體抗原血清試驗三、梅毒螺旋體抗原血清試驗暗視野檢查/鍍銀染色法--當標本陽性時，可確診梅毒。適宜于早期梅毒(一、二期)，特別是早期一期梅毒、早期先天梅毒。暗視野顯微鏡檢查法被WHO確定為性病實驗室的必備方法當標本陰性時，不能排除梅毒診斷不適用于來至口腔的標本暗視野顯微鏡檢查法是能夠立即在獲得性或先天性梅毒的早期進行直接診斷的唯一標準非梅毒螺旋體抗原血清試驗非梅毒螺旋體抗原血清試驗：是以心磷脂、卵磷脂及膽固醇作為抗原檢查病人血清中反應素的試驗方法。一般用于初篩試驗及療效觀察。常用方法：

VDRL（性病研究試驗試驗）

RPR(快速血漿反應素卡片試驗)

TRUST(甲苯胺紅試驗)

USR(不加熱血清反應素試驗)*缺點：敏感性――一期梅毒稍低特異性――可出現(xiàn)假陽性*優(yōu)點：可觀察療效、再感染，價廉，出結果快，操作簡單。梅毒螺旋體抗原血清試驗梅毒螺旋體抗原血清試驗：本實驗是以梅毒密螺旋體或非致病的密螺旋體為抗原，檢查患者血清中抗密螺旋體的特異性抗體。常用方法：

FTA-ABS（熒光螺旋體抗體吸收試驗)TPHA（梅毒螺旋體紅細胞凝集試驗）

ELISA（酶聯(lián)吸附試驗）

TP－WB

快速免疫層析法優(yōu)點：特異性高，可作確證試驗

FTA-ABS試驗：一期梅毒敏感性高缺點：不能觀察療效、判斷再感染梅毒血清學實驗生物學假陽性的常見原因

非梅毒螺旋體抗原血清學實驗

梅毒螺旋體抗原血清學實驗感染因素 細菌性心內(nèi)膜炎 傳染性單核細胞增多癥 軟下疳 麻風 病毒性肝炎 瘧疾 傳染性單核細胞增多癥 萊姆病 結核、麻風、麻疹、瘧疾、水痘 支原體或肺炎雙球菌肺炎 非感染因素 妊娠結締組織病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡 使用毒品 甲狀腺炎 惡性腫瘤 結締組織病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡 多發(fā)性骨髓瘤 慢性肝臟損害

衰老 ★職業(yè)暴露

概念：艾滋病的職業(yè)暴露是指醫(yī)務工作者、實驗室工作人員及有關監(jiān)管人員在從事HIV/A