微生物學基本操作技術演示文稿

微生物學基本操作技術演示文稿當前1頁，總共97頁。內容微生物分類微生物接種和培養(yǎng)微生物的分離微生物的鑒定微生物保藏質控微生物當前2頁，總共97頁。一、微生物分類當前3頁，總共97頁。一、微生物分類-微生物的進化和多樣性普遍性系統(tǒng)發(fā)育樹,親緣關系根據rRNA序列比較來決定。G.J.OlsenandC.R.Woese,‘RibosomalRNA:AkeytoPhylogeny’intheFASEBJournal,7:113-123,1993當前4頁，總共97頁。一、微生物分類原核生物大小:0.5-3mm形狀:-球型(Sthaphylococcus)-棒狀(Escherichiacoli)-螺旋(Rhodospirillum)生長迅速，20min至幾小時可繁殖一代可利用多種碳源

真核生物細胞器：線粒體內質網高爾基體液泡當前5頁，總共97頁。一、微生物分類procaryote.jpg當前6頁，總共97頁。原核生物一、微生物分類當前7頁，總共97頁。真核生物一、微生物分類當前8頁，總共97頁。一、微生物分類-多相分類表征（表型）特征形態(tài)特征生理和代謝特征生態(tài)特征遺傳（基因型）特征蛋白質比較核酸堿基組成核酸序列多相分類PolyphasicTexonomyTechnology當前9頁，總共97頁。一、微生物分類-微生物的分類等級“種”是微生物分類中最基本的分類單元?！胺N”的定義：一個種（基因型種）是有相似G+C組成并通過DNA雜交試驗判斷由70%或更大相似性的菌株的集合。分類等級界（Domain）門（Phylum）綱（Class）目（Order）科（Family）屬（Genus）種（Species）當前10頁，總共97頁。二、微生物接種和培養(yǎng)當前11頁，總共97頁。二、微生物接種和培養(yǎng)微生物接種定義將微生物的純種或含菌材料（如水、食品、空氣、土壤、排泄物等）轉移到培養(yǎng)基上，這個操作過程叫微生物的接種。接種工具

微生物接種技術分類斜面接種液體接種穿刺接種平板接種

當前12頁，總共97頁。二、微生物接種和培養(yǎng)斜面接種左手持菌種管和斜面管，使斜面向上，并盡量放平；右手先將棉塞（硅膠塞）擰轉松動，再拿接種環(huán)；用右手的小指、無名指和手掌拔下棉塞并夾緊，同時將管口在火焰上灼燒；接種環(huán)灼燒滅菌后插入試管內，冷卻、挑菌，轉入另一斜面底部，沿斜面劃曲線或直線。當前13頁，總共97頁。二、微生物接種和培養(yǎng)當前14頁，總共97頁。二、微生物接種和培養(yǎng)液體接種操作方法與斜面接種基本一致，只是將接種環(huán)送入液體培養(yǎng)基中時使接種環(huán)與管壁接觸的地方輕輕磨擦，使菌體分散；塞上棉塞，輕輕搖動均勻；如果菌種培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中，使用移液管或滴管接種。當前15頁，總共97頁。二、微生物接種和培養(yǎng)當前16頁，總共97頁。三、微生物接種和培養(yǎng)穿刺接種用接種針調取菌種后，插入深層固體培養(yǎng)基內（不要刺到底部），再沿原路拔出；此法用于厭氣性細菌接種，檢查細菌的運動能力。當前17頁，總共97頁。二、微生物接種和培養(yǎng)當前18頁，總共97頁。二、微生物接種和培養(yǎng)平板接種平板接種的目的是觀察菌落形態(tài)、分離純化菌種，以及活菌計數等；平板接斜面：平板分散的單菌落接于斜面；斜面接平板：點種法、劃線法。當前19頁，總共97頁。二、微生物接種和培養(yǎng)當前20頁，總共97頁。三、微生物分離當前21頁，總共97頁。微生物純培養(yǎng)分離技術純培養(yǎng)物是指來源于同一單細胞的細胞群體。獲得純培養(yǎng)物對微生物學研究至關重要。當前22頁，總共97頁。微生物純培養(yǎng)分離技術涂布平板法平板劃線法平板傾注法稀釋搖管法液體培養(yǎng)基分離法單細胞（孢子）分離法選擇培養(yǎng)基分離法當前23頁，總共97頁。涂布平板法1、少量樣品加到平板中央（0.1mL）；2、玻璃三角涂棒浸入酒精；3、沾有酒精的涂棒在火焰上灼燒后使其冷卻；4、無菌涂棒將樣品均勻涂布瓊脂培養(yǎng)基表面，適當條件下培養(yǎng)。當前24頁，總共97頁。涂布平板法樣品需適當稀釋30-300CFU/mL當前25頁，總共97頁。平板劃線法斜線法曲線法方格法放射法四格法當前26頁，總共97頁。平板劃線法斜線法：用接種環(huán)以無菌操作挑取菌懸液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線3-4條，再轉動培養(yǎng)皿70°角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同法通過第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和第四次平行劃線。曲線法：將挑取有樣品的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線。當前27頁，總共97頁。平板劃線法血瓊脂平板上的金黃色葡萄球菌（大的金黃色菌落）當前28頁，總共97頁。平板傾注法對起始樣品進行連續(xù)10倍稀釋，將高稀釋倍數的樣品與冷卻至適當溫度的溶化瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌平皿后混合均勻，培養(yǎng)后獲得單菌落。培養(yǎng)基表面菌落為圓形，而培養(yǎng)基內部菌落呈豆狀或透鏡狀。當前29頁，總共97頁。稀釋搖管法適合厭氧菌的純培養(yǎng)分離無菌瓊脂培養(yǎng)基試管加熱使瓊脂熔化后冷卻并保持在50℃左右梯度稀釋后的待分離菌株加入試管中搖勻、冷凝在瓊脂柱表面傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟的混合物培養(yǎng)后，菌落形成在瓊脂柱的中間當前30頁，總共97頁。液體培養(yǎng)基分離不能在固體培養(yǎng)基上生長的微生物仍需要用液體培養(yǎng)基分離來獲得純培養(yǎng)。稀釋法是液體培養(yǎng)基分離純化常用的方法。在同一個稀釋度的許多平行試管中，大多數（一般應超過95%）表現(xiàn)為不生長。當前31頁，總共97頁。單細胞（孢子）分離單細胞（或單孢子）分離法是采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個細胞或單個個體進行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)。較大的微生物，可采用毛細管提取單個個體。個體相對較小的微生物，需采用顯微操作儀，在顯微鏡下用毛細管或顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個微生物細胞或孢子以獲得純培養(yǎng)。單細胞分離法對操作技術有比較高的要求。當前32頁，總共97頁。選擇培養(yǎng)基分離選擇培養(yǎng)基特性促生長能力抑制能力指示（鑒別）能力當前33頁，總共97頁。選擇培養(yǎng)基分離傳統(tǒng)選擇性培養(yǎng)基血平板：適于各類細菌的生長，一般細菌檢驗標本的分離，都應接種此平板。營養(yǎng)肉湯：用于標本及各類細菌的增菌巧克力血平板：其中含有V和X因子，適于接種疑有嗜血桿菌、奈瑟菌等的標本。中國藍平板或伊紅美藍平板：可抑制G+細菌，有選擇地促進G-菌生長，是較好的弱選擇性培養(yǎng)基。麥康凱平板：具中等強度選擇性，抑菌力略強，有較少革蘭陰性菌不生長。SS瓊脂：有較強的抑菌力，用于志賀菌和沙門菌的分離。堿性瓊脂：用于從糞便中分離霍亂弧菌及其它弧菌。當前34頁，總共97頁。選擇培養(yǎng)基分離新型顯色培養(yǎng)基利用微生物自身代謝產生的酶與相應顯色底物反應顯色的原理來檢測微生物的培養(yǎng)基。OrganismEnzymeSubstrateColorColiformsβ-galactosidaseX-GALBlueEscherichiacoliβ-galactosidase

β-Glucuronidase

MUGfluorescenceEscherichiacoliO157β-galactosidaseX-GALBlue當前35頁，總共97頁。選擇培養(yǎng)基分離當前36頁，總共97頁。基于酶與底物反應的顯色培養(yǎng)基技術CHROMagar當前37頁，總共97頁。Petrifilm3MAerobicCountPlateColiformCountPlateRapidColiformCountPlateE.coli/ColiformCountPlateEnterbacteriaceaeCountPlateYeastandMoldCountPlateStaph.aureusExpressCountPlateEnvironmentalListeriaPlate基于酶與底物反應的顯色培養(yǎng)基技術當前38頁，總共97頁。四、微生物鑒定當前39頁，總共97頁。四、微生物鑒定多相鑒定（分類)（polyphasictaxonomy）是利用微生物從分子特性到生態(tài)特征的多種不同信息，綜合表型和基因型特征進行微生物分類鑒定的方法。當前40頁，總共97頁。四、微生物鑒定-形態(tài)學觀察細菌酵母絲狀真菌宏觀形態(tài)（培養(yǎng)特征）將培養(yǎng)物劃線或稀釋涂布，30℃培養(yǎng)16~24小時，選取劃線或稀釋涂布分離得到單菌落，觀察和記錄菌落的形狀、大小、質地、邊緣、顏色、光澤、透明度、隆起等。將培養(yǎng)物劃線接種于葡萄糖-酵母提取物-蛋白胨固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)2～3d后，進行菌落形態(tài)觀察，菌落質地、菌落顏色、菌落表面是否為反光或暗淡、菌落是平伏還是隆起、菌落邊緣等。標準培養(yǎng)基（CA、CYA、WA）平板倒轉，向上接種三點，每個菌株接種兩個平板，倒置于

25℃溫箱中進行培養(yǎng)7天。觀察菌落直徑、顏色、質地、滲出液、菌落反面顏色等特征。微觀形態(tài)（細胞特征）將培養(yǎng)物在30℃條件下培養(yǎng)16~24小時，挑取對數期的單菌落，涂布于事先滴加少量無菌水的載玻片上，自然干燥，加熱固定，進行革蘭氏染色，將制好的染色涂片在100X40倍的顯微鏡下觀察革蘭氏染色情況、菌體形狀、排列行狀、菌體大小等細胞特征。培養(yǎng)物劃線接種于葡萄糖-酵母提取物-蛋白胨固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)2～3d后，取酵母菌制作成水浸片，在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和無性繁殖方式等。用無菌接種針挑取少量培養(yǎng)物，浸入滴有一滴乳酸石炭酸棉藍染色液的載玻片上，用接種針將菌絲團分散開，蓋上蓋玻片（勿使產生氣泡），制成水浸片，顯微鏡下觀察菌體形態(tài)特征，包括分生孢子梗、分生孢梗莖、頂囊、梗基、瓶梗、產孢結構、分生孢子頭、分生孢子等。當前41頁，總共97頁。四、微生物鑒定-形態(tài)學觀察當前42頁，總共97頁。四、微生物鑒定-生理生化碳源和氮源運動性細胞壁組成滲透耐性能源氧關系發(fā)酵產物最適pH和生長范圍一般營養(yǎng)類型光合作用色素最適生長溫度和范圍鹽需求及耐性發(fā)光次級代謝產物形成能量轉換機制對代謝抑制劑和抗生素的敏感性貯藏內含物當前43頁，總共97頁。四、微生物鑒定-生理生化Divisionbasedonmembranecomposition:a)gram-negative–haveouterandinnermembranesand athincellwall(Escherichiacoli)b)gram-positive–havenooutermembrane,buthavea thickercellwall(Bacillussubtilis)c)neithergram-norgram+-nocellwalls(mycoplasm):85/fox/gram-st.jpg:85/fox/bact-mem.jpg當前44頁，總共97頁。四、微生物鑒定-生理生化API(bioMerieux)(biochemical)當前45頁，總共97頁。四、微生物鑒定-生理生化BBLCrystal(BectonDickinson)將傳統(tǒng)的生化反應、酶—底物呈色反應與熒光增強顯色技術結合，設計鑒定反應最佳組合。六類鑒定試驗板，可鑒定500種細菌當前46頁，總共97頁。四、微生物鑒定-化學成分分析當前47頁，總共97頁。四、微生物鑒定-基因型分析G+Cmol%16SrDNA,26SrDNAD1/D2,5.8SrDNAITSregion,β-tubulingene,calmodulingene,gyrAgene,pheSgene,recNgene,rpoBgeneandotherhousekeepinggenes.DNABarcodinggenesequenceanalysis,MultiLocusSequenceAnalysis(MLSA)DNA-DNA

hybridizationRAPD,RFLP,AFLP,SSCP,Eric-PCR,BOX-PCR,Rep-PCR,LAMP.當前48頁，總共97頁。四、微生物鑒定-基因型分析DNA指紋圖譜分析1234Eric-PCRBOX-PCRRep-PCRSSCPERIC－PCR以細菌DNA中串聯(lián)重復序列為引物，通過擴增細菌基因組中廣泛分布的短重復序列，在不同種屬個體間表現(xiàn)為在染色體上存在的位置和拷貝數不同，以電泳條帶比較分析，揭示基因組間的差異，應用于菌株分型。BOX-PCR根據BOX插入因子(大小為154bp,由保守性不同的boxA(57bp)、boxB(43bp)和boxC(50bp)等亞單位組成)設計引物,擴增微生物基因組DNA的重復性片段,最后經瓊脂糖凝膠電泳檢測其多態(tài)性。REP-PCR擴增細菌基因的重復DNA片段來獲得菌株特異性遺傳圖譜,其中重復DNA片段包含了一個高度保守的回文序列(REP)為38bp的片段,由1個保守回文段以及兩端分別有6個降解位點和1個5bp的可變框構成。PCR-SSCP是聚合酶鏈式反應與單鏈DNA非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術結合，利用不同構象單鏈DNA在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中泳動速率的差異,檢測出DNA短片段中存在的單核苷酸突變,現(xiàn)已廣泛應用于各種基因多態(tài)性的研究。。假絲酵母PCR-SSCP副溶血弧菌ERIC－PCR沙門氏菌REP-PCR當前49頁，總共97頁。四、微生物鑒定-鑒定實例116SrDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹infB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹當前50頁，總共97頁。2007年Aspergillusbrasiliensissp.nov.新種發(fā)表2008年ATCC16404鑒定為

Aspergillusbrasiliensis

sp.nov.

2010年USP將ATCC16404更名

2010年WDCM將ATCC16404更名

圖：ATCC16888和ATCC16404的培養(yǎng)特征和顯微形態(tài)a′nosVarga,Sa′ndorKocsube′,Bea′taTo′th,etal.Aspergillusbrasiliensissp.nov.,abiseriateblackAspergillusspecieswithworld-widedistribution.InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology,2007,57:1925–1932圖:Rep-PCR條碼系統(tǒng)發(fā)育樹(DiversiLab平臺)Figure2:DendrogramofRep-PCRBarcoding(DiversiLabPlatform).注：圖片來源于ReclassificationofATCC?16404TMandATCC?9642TMasAspergillusbrasiliensis.PharmaceuticalMicrobiologyForumNewsletter,2008,Vol.14(10):2-14表

ITS序列特殊位點堿基差異TableDifferenceofbasepositioninITSsequence四、微生物鑒定-鑒定實例2當前51頁，總共97頁。2007年Aspergillusbrasiliensissp.nov.新種發(fā)表2008年ATCC16404鑒定為

Aspergillusbrasiliensis

sp.nov.

2010年USP將ATCC16404更名

2010年WDCM將ATCC16404更名

圖:基于曲霉黑色組β-微管蛋白基因序列的N-J樹Figure:Neighbour–joiningtreebasedonβ-tubulinsequencedataofAspergillussectionNigri..注：圖片來源于Aspergillusbrasiliensissp.nov.,abiseriateblackAspergillusspecieswithworld-widedistributionInternational.JournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology,2007,57:1925–1932圖1:基于ITSDNA序列的黑色曲霉N-J樹Figure1:ANeighborJoiningTreeofBlackAspergillibasedonTheirITSDNASequences.注：圖片來源于ReclassificationofATCC?16404TMandATCC?9642TMasAspergillusbrasiliensis.PharmaceuticalMicrobiologyForumNewsletter,2008,Vol.14(10):2-14四、微生物鑒定-鑒定實例2當前52頁，總共97頁。各種標準中仍將繼續(xù)采用ATCC16404作為質控菌株。各類標準中，其它被指定為參考菌株的黑曲霉菌株(CMCC(F)98003)

,需要重新復核鑒定。黑曲霉？四、微生物鑒定-鑒定實例2當前53頁，總共97頁。形態(tài)學鑒定CYA培養(yǎng)基,25°C培養(yǎng)7dBiolog鑒定生長濁度試驗ITSrDNA區(qū)序列分析ITS4:5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3ITS5:5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3β-微管蛋白基因序列分析Bt2a:5-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3Bt2b:5-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3反應體系：100μL,10×擴增緩沖液10μL;DNA模板1μL;dNTP(每種2.5mmol/L)8μL;引物(10μL/L)各2.5μL;TaqDNA聚合酶(2.5U/μL)1.3μL;無菌超純水補足總體積100μL。反應程序：94°C5min;94°C1min,55°C1min,72°C1min,30個循環(huán);72°C10min,4°C保存。四、微生物鑒定-鑒定實例2當前54頁，總共97頁。形態(tài)學鑒定圖

25°C培養(yǎng)7d菌種的宏觀形態(tài)和顯微形態(tài)FigMacromorphologyandmicromorphologyon25°C,7d注:A菌落形態(tài);B:分生孢子梗形態(tài)(×100);C:分生孢子形態(tài)(×400).Note:A:Colonymorphology,B:Conidiophoremorphology(×100);C:Conidialmorphology(×400).該菌株的形態(tài)學特征符合黑曲霉A.niger的形態(tài)特征四、微生物鑒定-鑒定實例2當前55頁，總共97頁。Biolog鑒定注:?:沒有生長;+:生長旺盛;w:微弱(邊界)生長;v:可變.Note:?:Nogrowth;+:Stronggrowth;w:Weakgrowth;v:Variedgrowth.表

碳源利用情況TableCarbonSourceUtilization碳源CarbonsourceATCC16888AspergillusnigerATCC16404AspergillusbrasiliensisCMCC(F)98003麥芽糖Maltose+?+β-甲基-D-葡萄糖苷β-Methyl-D-Glucoside+?+D-海藻糖D-Trehalose+?+L-蘋果酸L-MalicAcidv+?α-酮戊二酸α-Ketoglutaricacid?w?苦杏仁苷Amygdalin+?+D-果糖D-Fructose+v+四、微生物鑒定-鑒定實例2當前56頁，總共97頁。ITSrDNA區(qū)序列分析圖

CMCC(F)98003的ITSrDNA區(qū)序列和β-微管蛋白基因序列PCR擴增結果FigITSrDNAandβ-tubulingenePCRamplificationresultsofCMCC(F)98003注:M:DL2000marker;1:ITSrDNA區(qū)PCR擴增結果;2:β-微管蛋白基因PCR擴增結果.Note:M:DL2000marker;1:ITSrDNAPCRamplificationresult;2:β-tubulingenePCRamplificationresult.表

ITS序列特殊位點堿基差異TableDifferenceofbasepositioninITSsequence堿基位點Baseposition140166172173AspergillusbrasiliensisIMI381727CCTCAspergillusnigerATCC16888ATAACMCC(F)98003ATAA注:以18S和ITS1區(qū)之間的TTACCG序列中的第一個“C”為1位點.Note:ThefirstCinthebordersequence(TTACCG)of18SandITS1isheredefinedasposition1.四、微生物鑒定-鑒定實例2當前57頁，總共97頁。ITSrDNA區(qū)序列分析以18S和ITS1區(qū)之間的TTACCG序列中的第一個“C”為1位點。140166172、173四、微生物鑒定-鑒定實例2當前58頁，總共97頁。ITSrDNA區(qū)序列分析圖

基于ITS區(qū)rDNA序列的黑色組曲霉的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹FigANeighborJoiningTreeofAspergillussectionNigri.basedonTheirITSDNASequences注:圖中發(fā)育樹節(jié)點只顯示Bootstrap值大于50%數值,圖例為遺傳距離.Note:Numbersabovebranchesarebootstrapvalues.Onlyvaluesabove50%areindicated.Bar,geneticdistance.CMCC(F)98003與與A.nigerATCC16888聚類在分類距離最近的一個分支上,序列相似性達100%。CMCC(F)98003與黑色組的其他種序列同源性也具有很高的相似性,序列同源性均在98.6%?100%之間。四、微生物鑒定-鑒定實例2當前59頁，總共97頁。β-微管蛋白基因序列分析圖

基于β-微管蛋白基因序列的黑色組曲霉的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹FigNeighbour-joiningtreebasedonβ-tubulinsequencedataofAspergillussectionNigri注:圖中發(fā)育樹節(jié)點只顯示Bootstrap值大于50%數值,圖例為遺傳距離.Note:Numbersabovebranchesarebootstrapvalues.Onlyvaluesabove50%areindicated.Bar,geneticdistance.CMCC(F)98003與黑曲霉A.nigerCBS554.65T序列同源性為100%。CMCC(F)98003與黑色組的其他種序列同源性均在94.7%以下。結合形態(tài)學、碳源利用情況和ITSrDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析等多相鑒定的結果,將CMCC(F)98003鑒定為黑曲霉（Aspergillusniger

）。四、微生物鑒定-鑒定實例2當前60頁，總共97頁。五、微生物保藏當前61頁，總共97頁。菌種是進行微生物學研究和應用的基本材料，是發(fā)展生物工程的重要基礎條件之一，是國家的重要生物資源。菌種保藏管理要求各保藏中心必須具有保藏菌種的詳細歷史及有關實驗資料。并對其所負責保藏的菌種均應采取妥善、可靠的方法保藏，避免菌種的污染或死亡。

《中國微生物菌種保藏管理條例》五、微生物保藏當前62頁，總共97頁。制訂專門菌種保藏管理制度；同一株菌種采用兩種以上保藏方法保存；對只能采用一種保藏方法的菌株備份存放于兩個以上的保藏設備中；對菌種的入庫和出庫記錄入檔，實行雙人負責制管理；設專人負責管理菌種保藏設施正常運行，定期檢修維護。五、微生物保藏當前63頁，總共97頁。微生物菌種保藏方法基本原理是在挑選優(yōu)良純培養(yǎng)物并使其處于休眠狀態(tài)基礎上，人為地創(chuàng)造一個有利于休眠的環(huán)境，使其長期保存后仍能保持菌種原有的優(yōu)良特性?；敬胧┦堑蜏?、真空、干燥。五、微生物保藏當前64頁，總共97頁。常用菌種保藏方法定期移植法液體石蠟法真空冷凍干燥法-80℃低溫凍結法液氮超低溫凍結法當前65頁，總共97頁。定期移植法亦稱傳代培養(yǎng)保藏法，指將菌種接種于適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)，完成培養(yǎng)于4～6℃進行保存并間隔一定時間（3-6個月）進行移植培養(yǎng)的一種短期菌種保藏方法。操作步驟：斜面制備接種培養(yǎng)保藏當前66頁，總共97頁。

斜面制備培養(yǎng)基配制分裝滅菌擺放斜面當前67頁，總共97頁。

接種當前68頁，總共97頁。培養(yǎng)細菌37℃，1-2d酵母28~30℃，2~3d絲狀真菌26℃，5~7d保藏4~6℃保藏3~6個月

培養(yǎng)和保藏當前69頁，總共97頁。定期移植法操作簡單，使用方便；對設備和人員要求不高；可隨時使用，便于觀察菌種；工作勞動強度大，屬短期保藏，保藏成本高；菌種傳代頻繁，易退化、污染。當前70頁，總共97頁。液體石蠟法指將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)好后注入滅菌的液體石蠟，使其覆蓋整個斜面，再直立放置于低溫（4～6℃）干燥處進行保存的一種菌種保藏方法。當前71頁，總共97頁。

操作步驟：液體石蠟預處理斜面培養(yǎng)物制備灌注石蠟保藏優(yōu)質化學純液體石蠟滅菌：

—121℃濕熱滅菌30min，蒸發(fā)水分；

—160℃干熱滅菌2h；冷卻至室溫。液面高出斜面頂部1cm4～6℃，干燥處；直立放置；保藏時間1～2年。當前72頁，總共97頁。液體石蠟法操作簡單，使用比較方便；對設備要求不高，對人員操作水平有一定要求；·菌種易退化、污染。當前73頁，總共97頁。真空冷凍干燥法指將保藏的菌種細胞或孢子懸浮于保護劑中，經預凍后在真空條件下使水分升華，再經真空封存后保存的一種長期菌種保存方法。當前74頁，總共97頁。安瓿管的準備清洗選用中性玻璃材質的安瓿管；2%鹽酸浸泡8～10h，自來水沖洗至中性，蒸餾水沖洗2～3次；置于烘箱中烘干。棉塞打棉塞，160℃定型2h；標簽激光打印標簽，標明菌株編號和保藏日期，大小約10×20mm。噴碼于安瓿管外，160℃固定20min。滅菌

121℃，30min.當前75頁，總共97頁。保護劑的準備保護劑：12%脫脂牛奶蒸餾水溶液，2～5ml/管；滅菌鍋加熱至沸騰，將牛奶管放入鍋中，113℃滅菌20min；打開放氣閥緩慢排出蒸汽，取出滅菌后脫脂牛奶試管，迅速放入涼水中冷卻；30℃培養(yǎng)2天，無菌檢查合格后備用。

當前76頁，總共97頁。凍干樣品制備制備斜面培養(yǎng)物；將保護劑用無菌吸管注入到斜面培養(yǎng)物上，用吸管刮取斜面上的菌體，使菌體均勻地懸浮在保護劑內。用長毛細滴管將菌懸液分裝到安瓿管內，0.1～0.2ml/管，操作時要把帶有菌懸液的長毛細滴管直接插入安瓿管的底部，勿使菌液沾在管壁上。當前77頁，總共97頁。真空干燥

在開動真空泵后應使真空度在15min內達到66.5Pa，隨后逐漸達到26.6～13.3Pa，在此條件下，樣品將保持凍結狀態(tài)，其中水分則不斷升華，干燥才能順利地進行。終止干燥時間應根據下列情況判斷：安瓿管內凍干物呈酥塊狀或松散片狀真空度接近空載時的最高值樣品溫度與管外溫度接近選用1～2支對照管，其水份與菌懸液同量，當其水分完全蒸發(fā)時視為干燥完結當前78頁，總共97頁。預凍制備菌懸液、經分裝到進行預凍之間的時間不宜超過1h；分裝完成后將安瓿管立刻放入－35～－40℃冰箱預凍1h，使菌液完全凍結；可采用分段式預凍，先將分裝好的安瓿管置－20℃凍30分鐘，再放入－80℃冰箱凍30min；采用離心式凍干裝置時勿需預凍。當前79頁，總共97頁。熔封

將安瓿管的中上部用火焰燒軟，拉成細頸；將安瓿管裝到多歧管上，用火焰在細頸處熔封；拉管時注意火焰不要離菌體太近。當前80頁，總共97頁。真空度檢測

用高頻電火花檢查各安瓿管的真空情況，如管內呈現(xiàn)灰藍光，說明真空度符合要求。

當前81頁，總共97頁。保藏

4～6℃下避光保藏，一般可保藏8～10年。

當前82頁，總共97頁。真空冷凍干燥法保藏、運輸方便；保藏時間長(5～10年)；對設備要求高(真空冷凍干燥機、多歧管)，對人員操作水平要求高；冷凍干燥過程對菌體有損傷，需恢復培養(yǎng)。當前83頁，總共97頁。-80℃冰箱凍結法將菌種懸浮于保護劑中，在－80℃冰箱中凍結保存的一種長期菌種保藏方法。準備冷凍管準備保護劑（10%-15%甘油）準備菌懸液（細胞、孢子或芽孢懸液）制備冷凍管（取菌懸液和保護劑至冷凍管）保藏（-80℃，2～5年）當前84頁，總共97頁。Microbank當前85頁，總共97頁。-80℃冰箱凍結法使用方便；保藏時間較長；對設備要求高(-80℃冰箱)；運輸不方便。當前86頁，總共97頁。液氮超低溫凍結法指懸浮于保護劑中的菌種經程控降溫后，移置于－196℃的液氮或－150℃左右的液氮氣相中保存的一種長期菌種保藏方法。當前87頁，總共97頁。操作步驟冷凍管準備保護劑制備保藏培養(yǎng)物準備預凍

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將程序降溫系統(tǒng)預冷到4℃，將制備好的冷凍管放入其中，以1℃/min降溫速率降至-35℃；

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使用程序降溫盒。保藏

將預凍后的冷凍管轉移至液氮氣相(-150℃)或液相(-196℃)。同“－80℃冰箱凍結法”

當前88頁，總共97頁。液氮超低溫凍結法保藏時間長；保藏效果好，菌種不易退化；對設備要求高(程控降溫儀、液氮罐)，對人員操作水平要求高；保藏成本高。當前89頁，總共97頁。不同保藏方法的比較當前90頁，總共97頁。六、質控微生物當前91頁，總共97頁。保藏菌株要求藥品微生物檢驗用的試驗菌應來自認可的國內或國外菌種收藏機構的標準菌株，或使用與標準菌株所有相關特性等效的商業(yè)派生菌株。922010版中國藥典《藥品微生物實驗室規(guī)范指導原則》當前92頁，總共97頁。國內認可的菌種收藏機構1979年7月，全國第一屆菌種