污染物的生物效應(yīng)檢測(cè)

第一節(jié)生物測(cè)試及方式一、生物測(cè)試的定義

生物測(cè)試指系統(tǒng)地利用生物的反應(yīng)測(cè)定一種或多種污染物或環(huán)境因素單獨(dú)或聯(lián)合存在時(shí)，所導(dǎo)致的影響或危害。

可利用包括分子、細(xì)胞、組織、器官、個(gè)體、種群、群落—生態(tài)系統(tǒng)各級(jí)水平上的反應(yīng)?？勺鳛榛瘜W(xué)和物理的檢測(cè)的補(bǔ)充。能全面地評(píng)定污染物對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的影響。當(dāng)前1頁(yè)，總共127頁(yè)。生物測(cè)試的意義監(jiān)測(cè)環(huán)境質(zhì)量的變化確定單一污染物的安全濃度研究多種污染物的聯(lián)合作用的生物效應(yīng)制定污染物的排放標(biāo)準(zhǔn)和環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)污染物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)水污染的生物測(cè)試——毒性試驗(yàn)對(duì)大氣污染的生物測(cè)——植物人工熏氣當(dāng)前2頁(yè)，總共127頁(yè)。(一)生物測(cè)試的分類

1.短期生物測(cè)試將被測(cè)試的生物在短時(shí)間內(nèi)暴露于高濃度的污染物下，測(cè)定污染物對(duì)生物機(jī)體的影響。包括的指標(biāo)：半數(shù)致死濃度(LC50)半數(shù)抑制濃度(IC50)半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)作用：可為中期或長(zhǎng)期試驗(yàn)時(shí)所應(yīng)使用的毒物濃度提供必要的依據(jù)。形式：靜止式，流動(dòng)式當(dāng)前3頁(yè)，總共127頁(yè)。靜止式：大多數(shù)情況下采用流動(dòng)式：在以下特殊情況下采用易揮發(fā)或不穩(wěn)定污染物因?yàn)樵谠囼?yàn)過(guò)程中污染物濃度會(huì)降低，受試生物對(duì)污染物的暴露程度會(huì)逐漸減少。代謝速率快的受試生物因?yàn)榕懦龃x廢物較多，代謝廢物的累積和分解會(huì)產(chǎn)生不適當(dāng)?shù)母邼舛榷趸己桶?，從而影響試?yàn)結(jié)果。

BOD較高的廢水因?yàn)槿芙庋醯暮谋M會(huì)對(duì)受試生物造成壓迫。當(dāng)前4頁(yè)，總共127頁(yè)。2.中期生物測(cè)試中期生物測(cè)試是介于短期和長(zhǎng)期之間的一類生物測(cè)試方法。在短期與中期或在中期與長(zhǎng)期之間，沒(méi)有嚴(yán)格的區(qū)分。一般的劃分：8d之內(nèi)算做短期

8~90d的算做中期中期的試驗(yàn)可以是靜止式，但在大多數(shù)情況下采用流動(dòng)式。當(dāng)前5頁(yè)，總共127頁(yè)。3.長(zhǎng)期生物測(cè)試指在低濃度污染物作用下，暴露時(shí)間要盡可能長(zhǎng)達(dá)受試生物的整個(gè)生活史的一類生物測(cè)試，又稱全生活史生物測(cè)試。動(dòng)物：要從一個(gè)卵期到下一代的卵期或更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)連續(xù)進(jìn)行。如浮游生物：可持續(xù)好幾代。部分生活史的生物測(cè)試：有些生物的生活史很長(zhǎng)，甚至長(zhǎng)達(dá)數(shù)年，因此，人們選用在整個(gè)生活史中的最敏感幾個(gè)階段來(lái)進(jìn)行。當(dāng)前6頁(yè)，總共127頁(yè)。(二)受試生物的選擇受試生物必須符合的條件：對(duì)試驗(yàn)毒物或因子要具有敏感性。應(yīng)具有廣泛的地理分布和足夠的數(shù)量，并在全年中在某區(qū)域范圍內(nèi)可獲得。應(yīng)是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成，具有重大的生態(tài)學(xué)價(jià)值。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)易于培養(yǎng)和繁殖。當(dāng)前7頁(yè)，總共127頁(yè)。應(yīng)具有豐富的生物學(xué)背景資料，較清楚生活史、生長(zhǎng)、發(fā)育、生理代謝等等。對(duì)試驗(yàn)毒物或因子的反應(yīng)能夠被測(cè)定，并具有一套標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定方法或技術(shù)。應(yīng)具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和旅游價(jià)值，應(yīng)考慮與人類食物鏈的聯(lián)系。當(dāng)前8頁(yè)，總共127頁(yè)。三、生物測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)化（一）影響生物測(cè)試結(jié)果的因素1.試驗(yàn)條件

試驗(yàn)的溫度、水質(zhì)和鹽分、水流速度、溶解氧、受試生物的總量、試驗(yàn)溶液的pH值和構(gòu)成試驗(yàn)裝置材料等不僅影響生物對(duì)毒物的反應(yīng)，而且影響作用于生物的毒物濃度、性質(zhì)和形態(tài)。當(dāng)前9頁(yè)，總共127頁(yè)。2.受試生物的敏感性生物對(duì)毒物的敏感性受生物的年齡、生活階段、尺寸大小、季節(jié)、脫皮階段、食物等因素影響。3.不同的實(shí)驗(yàn)室不同實(shí)驗(yàn)室的人員的操作水平、儀器設(shè)備和采用的統(tǒng)計(jì)分析方法等也使測(cè)試結(jié)果在不同實(shí)驗(yàn)空間有很大的差異。當(dāng)前10頁(yè)，總共127頁(yè)。（二）測(cè)試方法標(biāo)準(zhǔn)化的優(yōu)點(diǎn)在同一類型的不同實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行許多有用的測(cè)試并把結(jié)果選擇出來(lái)。增加數(shù)據(jù)的精確度測(cè)試可以被其他實(shí)驗(yàn)室重復(fù)各種人員容易進(jìn)行該試驗(yàn)可方便地將數(shù)據(jù)進(jìn)行比較可為環(huán)境管理、環(huán)境立法(環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)建立)提供可靠的數(shù)據(jù)或結(jié)果。當(dāng)前11頁(yè)，總共127頁(yè)。第二節(jié)一般毒性試驗(yàn)—、生物毒性的基本概念（一）毒物與中毒1.毒物在一定條件下，以較小劑量給予機(jī)體時(shí)，能與生物相互作用，引起生物體功能或器質(zhì)性損傷的化學(xué)物質(zhì)，或劑量雖微，但累積到一定的量，就能干擾或破壞機(jī)體的正常生理功能，引起暫時(shí)或持久性的病理變化，甚至危及生命的化合物，亦稱毒物。當(dāng)前12頁(yè)，總共127頁(yè)。毒物與非毒物之間并不存在絕對(duì)的界限，而只能以引起中毒的劑量大小相對(duì)地加以區(qū)別。討論一種化學(xué)物質(zhì)的毒性時(shí)，必須考慮到它進(jìn)入機(jī)體的數(shù)量(劑量)、方式(經(jīng)口食人、經(jīng)呼吸道吸入、經(jīng)皮膚或粘膜接觸)和時(shí)間分布(一次或反復(fù)多次給予)。最基本的因素是劑量。當(dāng)前13頁(yè)，總共127頁(yè)。2.中毒生物體受到毒物作用引起功能或器質(zhì)性改變后出現(xiàn)的疾病狀態(tài)稱中毒。中毒是各種毒性作用的綜合表現(xiàn)(包括局部的和全身的)。根據(jù)病變發(fā)生發(fā)展的快慢，可區(qū)分為：

急性中毒亞急性中毒慢性中毒當(dāng)前14頁(yè)，總共127頁(yè)。3.毒性有毒物質(zhì)接觸或進(jìn)入機(jī)體后，引起生物體的易感部位產(chǎn)生有害作用的能力。(1)毒性作用或毒效應(yīng)化學(xué)物引起生物體損害的總稱為毒性作用。毒性作用可通過(guò)觀測(cè)的方法來(lái)判斷。例如：有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶有抑制作用；苯可抑制造血功能導(dǎo)致貧血；強(qiáng)酸、強(qiáng)堿可引起局部的皮膚灼傷等等當(dāng)前15頁(yè)，總共127頁(yè)。(2)無(wú)損害作用無(wú)損害作用的特點(diǎn)：

不引起機(jī)體形態(tài)、生長(zhǎng)發(fā)育和壽命的改變；不引起機(jī)體功能容量的降低和對(duì)額外應(yīng)激狀態(tài)代償能力的損害；

所引起的生物學(xué)變化一般是可逆的，當(dāng)停止接觸化學(xué)物后，不能檢出機(jī)體維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)能力的降低；

不能使機(jī)體對(duì)其他環(huán)境因素不利影響的易感性增強(qiáng)。當(dāng)前16頁(yè)，總共127頁(yè)。(3)損害作用生物體接觸外來(lái)化學(xué)物期間或停止接觸后可導(dǎo)致的損害作用包括：機(jī)體維持體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)能力產(chǎn)生不可逆的下降；對(duì)某些環(huán)境因素不利影響的易感性增高；代謝速度降低；酶系的相對(duì)活力發(fā)生異常改變。當(dāng)前17頁(yè)，總共127頁(yè)。(4)效應(yīng)與反應(yīng)效應(yīng)(Effect)表示接觸一定劑量化學(xué)物質(zhì)引起機(jī)體個(gè)體發(fā)生的生物學(xué)變化。例如：接觸某些有機(jī)磷農(nóng)藥可引起膽堿酯酶活力降低，即為有機(jī)磷農(nóng)藥引起的效應(yīng)。反應(yīng)(Response)接觸一定劑量化學(xué)物質(zhì)后，表現(xiàn)一定程度某種效應(yīng)的個(gè)體在一個(gè)群體中所占的比例。例如：由于接觸某種化學(xué)物質(zhì)引起死亡的動(dòng)物占該群動(dòng)物的50％。當(dāng)前18頁(yè)，總共127頁(yè)。(5)劑量—效應(yīng)關(guān)系和劑量—反應(yīng)關(guān)系劑量—效應(yīng)關(guān)系：表示不同劑量在個(gè)體或群體中表現(xiàn)出來(lái)的量效應(yīng)大小之間的關(guān)系，劑量—反應(yīng)關(guān)系：表示不同劑量與其效應(yīng)發(fā)生率之間的關(guān)系。劑量反應(yīng)關(guān)系是評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)的毒性和確定安全接觸水平的基本依據(jù)。測(cè)定這種關(guān)系是毒性試驗(yàn)和化學(xué)物質(zhì)安全評(píng)價(jià)的基本內(nèi)容之一。當(dāng)前19頁(yè)，總共127頁(yè)。(6)危害性有毒物質(zhì)在與機(jī)體接觸或使用過(guò)程中引起中毒的可能性。在評(píng)價(jià)毒物的毒性及危害性時(shí)，單憑絕對(duì)毒性是不夠的，應(yīng)考慮到這種物質(zhì)的揮發(fā)性和在水或血液中的溶解性。揮發(fā)性小、易溶于水或血液中并能迅速達(dá)到中毒濃度的化學(xué)物質(zhì)其危害性就大，反之則小。當(dāng)前20頁(yè)，總共127頁(yè)。危害性與毒性不同任何一種毒物不論其毒性強(qiáng)弱，其危害性大小取決于動(dòng)物是否與它接觸過(guò)以及該物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體的能力和數(shù)量。(7)危險(xiǎn)性某化學(xué)物質(zhì)在正常生產(chǎn)使用條件下，能引起機(jī)體發(fā)生中毒的可能性稱為危險(xiǎn)性。例如：脂性物質(zhì)易蓄積在脂肪中，不僅影響機(jī)體的脂肪代謝，而且具有慢性中毒的危險(xiǎn)性。當(dāng)前21頁(yè)，總共127頁(yè)。(二)表示毒性的常用參數(shù)1.毒性試驗(yàn)常用參數(shù)

(1)致死劑量或致死濃度LethalDose，LDLethalConcentration，LC表示一次染毒后引起受試動(dòng)物死亡的劑量或濃度。絕對(duì)致死劑量或濃度(LDl00；LC100)：表示一群動(dòng)物全部死亡的最低劑量或濃度。當(dāng)前22頁(yè)，總共127頁(yè)。半數(shù)致死劑量或濃度(LD50；LC50)：能引起一群動(dòng)物的50％死亡的最低劑量或濃度。最小致死劑量或濃度(MLD，MLC)：能使一群動(dòng)物中僅有個(gè)別死亡的最高劑量或濃度。最大耐受劑量或濃度(LD0，LC0)：能使一群動(dòng)物雖然發(fā)生嚴(yán)重中毒，但全部存活無(wú)一死亡的最高劑量或濃度。當(dāng)前23頁(yè)，總共127頁(yè)。(2)最大無(wú)作用劑量指化學(xué)物在一定時(shí)間內(nèi)，按一定方式與機(jī)體接觸，按一定的檢測(cè)方法或觀察指標(biāo)，不能觀察到任何損害作用的最高劑量。外來(lái)化合物對(duì)機(jī)體的損害作用或毒作用表現(xiàn)為引起機(jī)體發(fā)生某種生物學(xué)變化，此種生物學(xué)變化隨劑量的遞減而減弱。當(dāng)外來(lái)化學(xué)物的劑量減到一定量但尚未到零時(shí)，生物學(xué)變化已達(dá)到零，即不能再觀察到外來(lái)化學(xué)物所引起的生物學(xué)變化，此劑量即為最大無(wú)作用劑量。當(dāng)前24頁(yè)，總共127頁(yè)。最大無(wú)作用劑量：是評(píng)定外來(lái)化合物毒性作用的主要依據(jù)，并可以其為基礎(chǔ)，制訂人體每日容許攝入量和最高容許濃度。每日容許攝入量(ADI)：指人類終生每日攝入該外來(lái)化學(xué)物對(duì)人體不致引起任何損害作用的劑量。最高容許濃度：指某一環(huán)境污染物可以在環(huán)境中存在而不致對(duì)人體造成任何損害作用的濃度。當(dāng)前25頁(yè)，總共127頁(yè)。(3)最小有作用劑量

指能使機(jī)體發(fā)生某種異常變化所需的最小劑量，即能使機(jī)體開(kāi)始出現(xiàn)毒性反應(yīng)的最低劑量。因?yàn)樽钚∮凶饔脛┝恳话愣际锹愿哂谧畲鬅o(wú)作用劑量，故亦稱為中毒閾劑量(ThresholdLevel)。具有類似意義的是最小有作用濃度，表示環(huán)境中存在某些環(huán)境污染物能引起機(jī)體開(kāi)始出現(xiàn)毒性反應(yīng)所必需的最低濃度。當(dāng)前26頁(yè)，總共127頁(yè)。(4)毒作用帶一種根據(jù)毒性和毒性作用特點(diǎn)綜合評(píng)價(jià)外來(lái)化合物危險(xiǎn)性的指標(biāo)。常用的有：急性毒性作用帶比值愈大，外來(lái)化合物引起死亡的危險(xiǎn)性就愈??；比值愈小，引起死亡的危險(xiǎn)性就愈大。當(dāng)前27頁(yè)，總共127頁(yè)。

慢性毒性作用帶比值愈大，引起慢性毒性中毒的可能性愈大；比值愈小，引起慢性中毒的可能性愈小，而引起急性中毒危險(xiǎn)性則相對(duì)較大。當(dāng)前28頁(yè)，總共127頁(yè)。(5)半數(shù)效應(yīng)濃度MedianEffectConcentration，EC50指能引起50％受試生物的某種效應(yīng)變化的濃度。通常指非死亡效應(yīng)。(6)半數(shù)抑制濃度MedianInhibitionConcentration，IC50是指能引起受試生物的某種效應(yīng)50％抑制的濃度。當(dāng)前29頁(yè)，總共127頁(yè)。2.毒物單位與分級(jí)(1)毒物單位吸入毒物:以在空氣中的濃度以mg／m3、mg／L表示;哺乳動(dòng)物:以mg／kg,或ml／kg體重表示;水環(huán)境中毒物:以mg／L、ug/L表示每單位體表面給藥量(mg／m2)表示當(dāng)前30頁(yè)，總共127頁(yè)。(2)毒性分級(jí)目前使用的分級(jí)方法、標(biāo)準(zhǔn)和毒性級(jí)的名稱在毒理學(xué)文獻(xiàn)中很不統(tǒng)一，因而往往造成混亂和判斷的錯(cuò)誤;目前要統(tǒng)一也比較困難;國(guó)內(nèi)較為通用的毒性分級(jí)系統(tǒng)列于表3-1～3-6。當(dāng)前31頁(yè)，總共127頁(yè)。當(dāng)前32頁(yè)，總共127頁(yè)。當(dāng)前33頁(yè)，總共127頁(yè)。當(dāng)前34頁(yè)，總共127頁(yè)。二、急性毒性試驗(yàn)AcuteToxicityTest研究化學(xué)物質(zhì)大劑量一次染毒或24h內(nèi)多次染毒動(dòng)物所引起的毒性試驗(yàn)。目的：

在短期內(nèi)了解該物質(zhì)的毒性大小和特點(diǎn)，并為進(jìn)一步開(kāi)展其他毒性試驗(yàn)提供設(shè)計(jì)依據(jù)。當(dāng)前35頁(yè)，總共127頁(yè)。（一）哺乳動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：小鼠、大鼠、豚鼠、兔染毒方式：毒物飼喂、經(jīng)皮接觸常規(guī)方法：（1）先查閱文獻(xiàn)中與受試物類似的動(dòng)物的LD50；（2）以3倍之差的3個(gè)劑量組進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，每組3只動(dòng)物，求出動(dòng)物全活、全死劑量；當(dāng)前36頁(yè)，總共127頁(yè)。（3）在全活全死劑量之間設(shè)5～6個(gè)劑量組，各組間距按1.2-1.5等比級(jí)數(shù)設(shè)計(jì)；（4）選用適宜的染毒方式染毒，觀察2周內(nèi)的死亡情況；（5）剖檢死亡和瀕死動(dòng)物及部分存活動(dòng)物，做大體病理解剖檢查；（6）計(jì)算LD50或LC50。當(dāng)前37頁(yè)，總共127頁(yè)。(二)水生生物急性毒性試驗(yàn)1.魚(yú)類毒性試驗(yàn)(1)實(shí)驗(yàn)用魚(yú)的選擇必須具有一定區(qū)域代表性；便于在實(shí)驗(yàn)條件下飼養(yǎng)；對(duì)化學(xué)物質(zhì)較為敏感；一般體長(zhǎng)在7cm以下為宜。采用金魚(yú)時(shí)，一般在3cm以下，最長(zhǎng)體長(zhǎng)不應(yīng)超過(guò)最小體長(zhǎng)的1.5倍。選擇行動(dòng)活潑、體色光澤、魚(yú)鰭完整舒展、逆水性強(qiáng)和食欲好的健康魚(yú)，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)觀察一周后使用。當(dāng)前38頁(yè)，總共127頁(yè)。(2)實(shí)驗(yàn)條件實(shí)驗(yàn)容器采用玻璃缸或白搪瓷桶，其盛水量以每條魚(yú)2～3L水為宜，水的pH值為6.7~8.5，冷水溫度為12~18℃，溫水溫度為20～28℃，水溫變化為±2℃。水中溶解氧不能低于4mg／L，可用清潔的河水、湖水或放置3天以上的自來(lái)水。當(dāng)前39頁(yè)，總共127頁(yè)。（3）半數(shù)致死濃度(LC50)的測(cè)定預(yù)試驗(yàn)：確定100％致死濃度和不引起死亡的最大濃度。在此濃度范圍，按等對(duì)數(shù)間距確定5~7個(gè)濃度組（包括對(duì)照），10~20尾/組，染毒48~96h。染毒剛開(kāi)始8h內(nèi)經(jīng)常觀察，以后可作24h、48h、72h、96h的定期觀察，記錄中毒反應(yīng)及死亡時(shí)間。死亡魚(yú)立即取出剖檢。當(dāng)前40頁(yè)，總共127頁(yè)。試驗(yàn)期間：保持溶解氧、pH值、水溫等的穩(wěn)定；記錄24h、48h、96h各組魚(yú)的死亡數(shù)；按LC50計(jì)算方法，求出相應(yīng)時(shí)間的LC50。采用的計(jì)算方法：

直線內(nèi)插法對(duì)數(shù)—概率模式法當(dāng)前41頁(yè)，總共127頁(yè)。2.水蚤類急性毒性試驗(yàn)水蚤類是淡水生物，對(duì)許多毒物很敏感。水蚤類的世代周期短，實(shí)驗(yàn)室易培養(yǎng)，產(chǎn)仔量多，是一類很好的試驗(yàn)生物，且試驗(yàn)項(xiàng)目使用的參數(shù)在個(gè)體間相對(duì)恒定，為試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)處理提供方便。試驗(yàn)裝置簡(jiǎn)單，省人力，在水毒理學(xué)研究上廣泛應(yīng)用。大型水蚤是水蚤類毒性試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)生物，試驗(yàn)用水蚤一般為孤雌生殖新生蚤(<24h)。當(dāng)前42頁(yè)，總共127頁(yè)。3.藻類急性毒性試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定藻類的生物量，可評(píng)價(jià)有害物質(zhì)對(duì)藻類生長(zhǎng)的作用，反映對(duì)水體中初級(jí)生產(chǎn)營(yíng)養(yǎng)級(jí)的影響以及對(duì)整個(gè)水生生態(tài)系統(tǒng)的可能的綜合環(huán)境效應(yīng)。在藻類毒性試驗(yàn)中，應(yīng)定時(shí)取樣測(cè)定藻類的生長(zhǎng)情況，一般為24h或48h取樣一次。在72h和96h取樣測(cè)定毒物對(duì)藻類影響的IC50值，即與對(duì)照相比，生長(zhǎng)率抑制50％的毒性濃度。當(dāng)前43頁(yè)，總共127頁(yè)。(三)蚯蚓急性毒性試驗(yàn)蚯蚓急性毒性試驗(yàn)的目標(biāo)：評(píng)價(jià)環(huán)境中化學(xué)物質(zhì)，如農(nóng)藥對(duì)土壤中動(dòng)物的急性傷害。常用的蚯蚓品種：赤子愛(ài)勝蚓，其生活周期短，繁殖能力強(qiáng)，易于飼養(yǎng)。赤子愛(ài)勝蚓不是典型的土壤種類，但它存在于富含有機(jī)質(zhì)的土壤中，對(duì)化學(xué)物質(zhì)的敏感性與棲息在一般土壤中的蚯蚓類似。當(dāng)前44頁(yè)，總共127頁(yè)。方法：濾紙接觸毒性試驗(yàn)：濾紙接觸毒性試驗(yàn)簡(jiǎn)單易行，可對(duì)受試物毒性進(jìn)行初篩。將蚯蚓與濕潤(rùn)濾紙上的受試物接觸，測(cè)定土壤中受試物對(duì)蚯蚓的潛在影響。

人工土壤試驗(yàn)：將蚯蚓置于含不同濃度受試物的人工配制土壤中，飼養(yǎng)7d和14d，評(píng)價(jià)其死亡率。應(yīng)包括使生物無(wú)死亡發(fā)生和全部死亡的兩組濃度。整個(gè)試驗(yàn)期為14d，每一處理組和對(duì)照組應(yīng)有4個(gè)平行樣。當(dāng)前45頁(yè)，總共127頁(yè)。三、亞慢性和慢性毒性試驗(yàn)

（一）亞慢性毒性試驗(yàn)在相當(dāng)于動(dòng)物生命周期的1／30~1／20時(shí)間內(nèi)，使動(dòng)物每日或反復(fù)多次接觸受試物的毒性試驗(yàn)。其目的是為進(jìn)一步對(duì)受試物的主要毒作用、靶器官和最大無(wú)作用劑量或中毒閾劑量作出估計(jì)。當(dāng)前46頁(yè)，總共127頁(yè)。1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組（1）亞慢性試驗(yàn)中試驗(yàn)動(dòng)物的種屬和品系，應(yīng)當(dāng)是急性毒性試驗(yàn)證明的對(duì)受試物敏感的動(dòng)物種屬和品系，同時(shí)還應(yīng)考慮與慢性毒作用試驗(yàn)中預(yù)計(jì)使用的動(dòng)物種屬和品系相同。（2）一般要求選擇兩種試驗(yàn)動(dòng)物，嚙齒類和非嚙齒類各一種，以便于更全面地了解受試物的毒效應(yīng)。當(dāng)前47頁(yè)，總共127頁(yè)。（3）實(shí)驗(yàn)時(shí)選用健康、年幼的動(dòng)物，小鼠體重為14~17g，大鼠體重50~80g，家兔和貓?bào)w重1~2kg，狗體重5~8kg。各試驗(yàn)組動(dòng)物體重均值應(yīng)相近，各動(dòng)物體重不應(yīng)超過(guò)組平均體重的±20％。（4）大鼠各組不少于20只；家兔、貓、狗等較大動(dòng)物，每組不應(yīng)少于4~6只，雌雄各半。至少設(shè)3個(gè)劑量組和一個(gè)對(duì)照組。當(dāng)前48頁(yè)，總共127頁(yè)。2.染毒劑量及實(shí)驗(yàn)期限適宜的劑量為高劑量組能引起明顯中毒反應(yīng)，但不引起很多動(dòng)物死亡；低劑量組不引起任何中毒反應(yīng)；介于二者之間的為中間劑量組。另設(shè)一組對(duì)照組。一般用LD50(LC50)的1／80~1／50作為亞慢性試驗(yàn)劑量。試驗(yàn)期限隨目的和要求或動(dòng)物不同而異，大鼠可90d，較大的動(dòng)物可4~6月。當(dāng)前49頁(yè)，總共127頁(yè)。3.染毒途徑亞慢性毒性試驗(yàn)中接觸外來(lái)化合物的途徑，應(yīng)盡量模擬人類在環(huán)境中實(shí)際接觸的方式或途徑，此外還應(yīng)與預(yù)期進(jìn)行慢性毒作用試驗(yàn)的接觸途徑相一致。亞慢性試驗(yàn)中動(dòng)物接觸外來(lái)化合物的途徑，主要是經(jīng)胃腸道(經(jīng)口)、呼吸道及皮膚接觸。當(dāng)前50頁(yè)，總共127頁(yè)。4.觀察指標(biāo)(1)一般綜合指標(biāo)觀察動(dòng)物的一般活動(dòng)、癥狀和死亡情況，每周稱重一次，記錄飼料或飲水量，計(jì)算生長(zhǎng)率(各組每周攝入食量與體重增加量之比)，并計(jì)算臟器濕重與單位體重的比值(臟器系數(shù))。(2)血液及生化檢驗(yàn)主要指血清和肝、腎功能的檢驗(yàn)。常規(guī)項(xiàng)目包括血紅蛋白、紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)、血小板數(shù)、谷草轉(zhuǎn)氨酶、血清尿素氮等。當(dāng)前51頁(yè)，總共127頁(yè)。(3)病理組織學(xué)檢查在外來(lái)化合物的亞慢性毒作用試驗(yàn)中應(yīng)重視病理組織學(xué)檢查，必要時(shí)還可進(jìn)行組織化學(xué)和電鏡檢查。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中解剖死亡或?yàn)l死動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死所有動(dòng)物進(jìn)行尸檢。如未見(jiàn)明顯病變，可將高劑量組和對(duì)照組的主要臟器進(jìn)行病理學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)病變后再對(duì)較低劑量相應(yīng)器官組織進(jìn)行檢查。當(dāng)前52頁(yè)，總共127頁(yè)。5.試驗(yàn)評(píng)價(jià)由試驗(yàn)結(jié)果可對(duì)受試物的主要作用、靶器官和最大無(wú)作用水平及中毒閾劑量作出初步估計(jì)，并為進(jìn)一步開(kāi)展慢性毒性試驗(yàn)提供依據(jù)。當(dāng)前53頁(yè)，總共127頁(yè)。(二)慢性毒性試驗(yàn)慢性毒性試驗(yàn)是指以低劑量外來(lái)化合物，長(zhǎng)期與試驗(yàn)動(dòng)物接觸，觀察其對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)的試驗(yàn)。通過(guò)慢性毒性實(shí)驗(yàn)，可確定最大無(wú)作用劑量，為制訂人體每日允許攝人量(AllowableDailyIntake，ADI)和最高容許濃度(MaximamAllowableConcentration，MAC)提供毒理學(xué)依據(jù)。當(dāng)前54頁(yè)，總共127頁(yè)。1．哺乳動(dòng)物的慢性毒性試驗(yàn)(1)試驗(yàn)動(dòng)物及分組試驗(yàn)動(dòng)物的年齡應(yīng)低于亞慢性試驗(yàn)，選用斷乳的動(dòng)物，如小鼠出生后三周之內(nèi)，體重10—12g；大鼠出生后3--4周，體重50～70日為宜。試驗(yàn)動(dòng)物的性別一般要求雌雄各半。設(shè)置3--4劑量組和1對(duì)照組，其他要求同亞慢性實(shí)驗(yàn)。當(dāng)前55頁(yè)，總共127頁(yè)。(2)染毒劑量和實(shí)驗(yàn)期限

高劑量組應(yīng)引起明顯的毒性反應(yīng)，低劑量組應(yīng)不引起毒性作用，在此兩組中間再設(shè)1-2個(gè)劑量組，可根據(jù)亞慢性實(shí)驗(yàn)資料，取其最低中毒劑量的1／10、1／20、及1／50(或LD50的1／100~1／20中取3~4個(gè)劑量)作為慢性試驗(yàn)劑量。試驗(yàn)期限為1~12個(gè)月，如包括致痛實(shí)驗(yàn)應(yīng)18~24個(gè)月。當(dāng)前56頁(yè)，總共127頁(yè)。(3)染毒途徑同亞慢性毒性試驗(yàn)。(4)觀察指標(biāo)

基本同亞慢性實(shí)驗(yàn)，另作如下要求：①在試驗(yàn)的第一個(gè)月，每周稱體重一次；4~6個(gè)月期間，每?jī)芍芊Q體重一次；以后每4周稱重一次。②每?jī)蓚€(gè)月進(jìn)行一次血液學(xué)及其他生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定。一般可從各組每種性別中任取6~10只進(jìn)行測(cè)定。③對(duì)病理檢查作半定量的評(píng)定，即除對(duì)剖檢及組織學(xué)檢查加以詳細(xì)描述外，還需根據(jù)病變程度加以分級(jí)評(píng)分(表3-7)。當(dāng)前57頁(yè)，總共127頁(yè)。(5)試驗(yàn)評(píng)價(jià)通過(guò)慢性毒性試驗(yàn)所獲得的結(jié)果，對(duì)受試物在低劑量長(zhǎng)時(shí)間接觸機(jī)體時(shí)所引起的毒性作用有更深入了解，可依據(jù)敏感觀察指標(biāo)出現(xiàn)異常的最小閾劑量，找出該受試物慢性毒作用的最大無(wú)作用劑量，為受試物能否應(yīng)用或?yàn)橹朴喥湓诃h(huán)境中衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，提供重要的參考依據(jù)。當(dāng)前58頁(yè)，總共127頁(yè)。當(dāng)前59頁(yè)，總共127頁(yè)。2.水生生物的慢性毒性試驗(yàn)將試驗(yàn)種群連續(xù)暴露在不同濃度的化學(xué)物質(zhì)中（足夠長(zhǎng)的時(shí)間），每個(gè)種群在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)觀察其死亡率、產(chǎn)卵率、孵化率、幼體成活率、體長(zhǎng)及體重的變化，與對(duì)照進(jìn)行比較。當(dāng)前60頁(yè)，總共127頁(yè)。四、蓄積毒性試驗(yàn)(一)基本概念

低于中毒閥劑量的外來(lái)化合物，反復(fù)多次地與機(jī)體持續(xù)接觸，經(jīng)一定時(shí)間后使機(jī)體出現(xiàn)明顯的中毒表現(xiàn)，即為蓄積毒性作用。蓄積毒性作用是由于外來(lái)化合物進(jìn)入機(jī)體的速度大于有機(jī)體消除的速度，而使外來(lái)化合物在體內(nèi)的量不斷累積，達(dá)到了使機(jī)體引起毒性作用的閾劑量所致。當(dāng)前61頁(yè)，總共127頁(yè)。1.物質(zhì)蓄積

環(huán)境污染物不斷進(jìn)入機(jī)體內(nèi)，其吸收量大于排出量，使其在體內(nèi)的量逐漸積累增多。2.功能蓄積

不斷進(jìn)入機(jī)體內(nèi)的環(huán)境污染物，引起機(jī)體一定結(jié)構(gòu)或功能的變化，并逐漸累積加重，最后導(dǎo)致出現(xiàn)損害作用。3.相互關(guān)系在物質(zhì)蓄積的情況下，肯定存在機(jī)體一定結(jié)構(gòu)和功能的改變，而功能改變的累積也必須以物質(zhì)累積為基礎(chǔ)，兩者同時(shí)存在，互為基礎(chǔ)，無(wú)法嚴(yán)格加以區(qū)別。當(dāng)前62頁(yè)，總共127頁(yè)。(二)蓄積試驗(yàn)的研究方法1.蓄積系數(shù)法蓄積系數(shù)(K)：分次給受試物后，引起50％受試動(dòng)物出現(xiàn)某種毒效應(yīng)的總劑量(∑LD50(n))與一次給受試物后引起50％受試動(dòng)物出現(xiàn)同一毒效應(yīng)的劑量(LD50(1))的比值。當(dāng)前63頁(yè)，總共127頁(yè)。（1）蓄積系數(shù)的強(qiáng)度級(jí)當(dāng)前64頁(yè)，總共127頁(yè)。（2）測(cè)定蓄積系數(shù)的實(shí)驗(yàn)方法固定劑量每天連續(xù)染毒法對(duì)受試動(dòng)物以1/10~1/20LD50的固定劑量，每天染毒一次，觀察記錄動(dòng)物死亡情況。當(dāng)染毒劑量累計(jì)達(dá)到5個(gè)LD50（1）以上時(shí)，若受試動(dòng)物死亡數(shù)未超過(guò)半數(shù)，此時(shí)的蓄積系數(shù)已大于5，表明該受試物的蓄積作用不明顯。如果染毒過(guò)程動(dòng)物相繼陸續(xù)死亡，記下受試物出現(xiàn)50％死亡時(shí)累計(jì)的染毒總劑量，按上述算式計(jì)算蓄積系數(shù)。當(dāng)前65頁(yè)，總共127頁(yè)。劑量定期遞增染毒法取一組受試動(dòng)物，每天染毒一次，以4天為一期，開(kāi)始的第一期每天染毒的劑量為1/10LD50(1)，隨后染毒的劑量每隔4天按1．5倍遞增一次，計(jì)算得定期給予的劑量數(shù)(表3-9)。當(dāng)前66頁(yè)，總共127頁(yè)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，逐日記錄動(dòng)物的死亡情況，若連續(xù)染毒已達(dá)20天，此時(shí)每天的染毒劑量達(dá)0.5LD50，累計(jì)總劑量達(dá)5.30LD50，如果受試動(dòng)物死亡未達(dá)50%，則表示該受試物的蓄積作用不明顯，試驗(yàn)可終止。如果受試動(dòng)物出現(xiàn)死亡達(dá)50%時(shí)，此時(shí)的累計(jì)染毒總劑量就是所求的蓄積系數(shù)。當(dāng)前67頁(yè)，總共127頁(yè)。2.20天蓄積試驗(yàn)法按LD50的1/20、1/10、1/5、1/2及對(duì)照隨機(jī)分成5組，每天對(duì)動(dòng)物進(jìn)行染毒，連續(xù)20d。各組總劑量分別為1、2、4、10LD50。觀察停藥后7d內(nèi)的死亡情況。如1/2LD50組有死亡，且各劑量組呈劑量—反應(yīng)關(guān)系，則可認(rèn)為受試物有較強(qiáng)的蓄積作用；若1/20LD50組有死亡但以上各劑量組有劑量—反應(yīng)關(guān)系，則認(rèn)為有中等蓄積作用；如1/20LD50組無(wú)死亡，而以上各劑量組又無(wú)劑量應(yīng)關(guān)系，則認(rèn)為無(wú)明顯的蓄積作用。當(dāng)前68頁(yè)，總共127頁(yè)。3.受試物生物半減期測(cè)定法生物半減期(T1/2)是指外來(lái)化合物在體內(nèi)消除到原有濃度(量)的一半所需要的時(shí)間。生物半減期越長(zhǎng)的物質(zhì)，越不易由體內(nèi)消除，其蓄積作用的可能性就越大。因測(cè)定外來(lái)化合物在體內(nèi)的生物半減期過(guò)程較為復(fù)雜，所以在實(shí)際觀測(cè)中常常僅以間接測(cè)定其在血液、尿液或器官組織中原有濃度(或量)降低一半所需的時(shí)間，以代表該物質(zhì)的生物半減期。當(dāng)前69頁(yè)，總共127頁(yè)。式中：Yl和Y2分別為給受試物后于t1和t2時(shí)間測(cè)得該物質(zhì)的濃度或量。根據(jù)測(cè)得的生物半減期的長(zhǎng)短，可以判定受試物的蓄積作用。生物半減期越長(zhǎng)蓄積作用越大，反之則越小。當(dāng)前70頁(yè)，總共127頁(yè)。第三節(jié)生物的分子和細(xì)胞水平檢測(cè)一、加和物測(cè)定（一）DNA加合物的測(cè)定■化學(xué)物質(zhì)經(jīng)生物轉(zhuǎn)化，與DNA鏈的特異位點(diǎn)結(jié)合，形成共價(jià)結(jié)合物?！鲎饔梦稽c(diǎn)：鳥(niǎo)嘌呤的N-7位，O-6位；腺嘌呤的N-1位或N-3位■測(cè)定方法：免疫法、熒光法和32P-后標(biāo)記法當(dāng)前71頁(yè)，總共127頁(yè)。1.免疫法（1）基本原理■用熒光素、酶、放射性同位素等對(duì)抗體或抗原進(jìn)行標(biāo)記?！鰳?biāo)記過(guò)程即保持抗原或抗體的免疫活性，又不影響標(biāo)記物本身的特性（如酶活性）?！鰧⑺鳛橐环N檢測(cè)試劑，與相應(yīng)的抗原或抗體作用?！鐾ㄟ^(guò)檢測(cè)標(biāo)記物來(lái)觀察抗原抗體反應(yīng)。當(dāng)前72頁(yè)，總共127頁(yè)。（2）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）步驟■包被：將已知抗原或抗體通過(guò)物理吸附結(jié)合到固體載體表面，使抗原或抗體固相化；■抗原抗體反應(yīng)：先后加入被檢標(biāo)本和酶結(jié)合物，使之與固相抗原或抗體發(fā)生免疫反應(yīng)而被結(jié)合固定，經(jīng)洗滌除去游離的酶結(jié)合物?！雒复俜磻?yīng)：在反應(yīng)體系中，加入酶作用的底物，使發(fā)生酶促反應(yīng)而顯色。當(dāng)前73頁(yè)，總共127頁(yè)。酶促反應(yīng)二抗一抗抗原當(dāng)前74頁(yè)，總共127頁(yè)。（3）放射免疫分析（RIA）radioimmunoassay■原理以放射性同位素標(biāo)記抗原（Ag），采用飽和分析法檢測(cè)抗原。將求抗體（Ab）的化學(xué)量轉(zhuǎn)為求其放射性強(qiáng)度。靈敏度大為提高，可測(cè)至ng至pg水平。當(dāng)前75頁(yè)，總共127頁(yè)。放射免疫測(cè)定原理示意圖當(dāng)前76頁(yè)，總共127頁(yè)。2.熒光法■原理通過(guò)某些化合物的DNA-加合物具熒光特性而進(jìn)行定量?！黾夹g(shù)同步熒光法、低溫激光法、激光-發(fā)射熒光法?！鰞?yōu)點(diǎn)不破壞DNA鏈，并可區(qū)分出加合物的不同立體異構(gòu)體及DNA鏈不同位點(diǎn)上的加合物。當(dāng)前77頁(yè)，總共127頁(yè)。熒光抗體技術(shù)當(dāng)前78頁(yè)，總共127頁(yè)。3.32P-后標(biāo)記法■32P-后標(biāo)記法原理將分離出的DNA用一定的酶水解成正常的單核苷酸和形成了加合物的單核苷酸，將二者分離，再用32P標(biāo)記的ATP將帶有加合物的單核苷酸標(biāo)記，然后用雙相層析、放射自顯影、液閃計(jì)數(shù)等方法定量?！鰞?yōu)點(diǎn)檢測(cè)能力強(qiáng)，應(yīng)用范圍廣，可檢測(cè)任何化學(xué)物與DNA的連接，高靈敏性。當(dāng)前79頁(yè)，總共127頁(yè)。（二）蛋白加合物的測(cè)定■各種蛋白質(zhì)亦可作為大分子形成化學(xué)物質(zhì)加合物?！鲅t蛋白（Hb）可與50多種化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)?！鲅t蛋白的生存期120d，Hb-加合物可作為中長(zhǎng)期暴露的指標(biāo)。當(dāng)前80頁(yè)，總共127頁(yè)。二、一般代謝酶的活性測(cè)定生物受到亞致死劑量毒物的暴露時(shí)，不僅可借助于酶指標(biāo)來(lái)對(duì)毒物進(jìn)行生化水平上的評(píng)價(jià)，還可用來(lái)探討毒物的作用機(jī)制。1.乙酰膽堿酯酶(Ache)活性測(cè)定■Ache活性作為有機(jī)磷農(nóng)藥污染的指標(biāo)■測(cè)定方法Ellman比色法（p.113）放射測(cè)量法等當(dāng)前81頁(yè)，總共127頁(yè)。2.ATPase活性測(cè)定■腺苷三磷酸酶（ATPase）可水解ATP，釋放出供生命活動(dòng)所用的能量。■測(cè)定方法Matsumura等的方法，用鉬藍(lán)法測(cè)定經(jīng)酶水解的無(wú)機(jī)磷。當(dāng)前82頁(yè)，總共127頁(yè)。三、解毒系統(tǒng)酶類誘導(dǎo)作用的檢測(cè)混合功能氧化酶的誘導(dǎo)作用■直接法直接測(cè)定MFO的各組成成分如：細(xì)胞色素P450含量■代謝法測(cè)定MFO催化反應(yīng)中的底物消耗量或產(chǎn)物生成量■使用單一方法進(jìn)行MFO的評(píng)價(jià)不夠全面和可靠，在毒理學(xué)中常采用多種檢測(cè)分析方法，從不同角度進(jìn)行MFO作用的評(píng)定。當(dāng)前83頁(yè)，總共127頁(yè)。四、抗氧化防御系統(tǒng)檢測(cè)1.過(guò)氧化氫酶(CAT)活性測(cè)定■CAT能催化分解細(xì)胞代謝產(chǎn)生的H2O2，在調(diào)節(jié)細(xì)胞免于死亡的過(guò)程中起著重要作用?！鯟AT測(cè)定測(cè)量由H2O2分解所釋放出的氧，在240nm波長(zhǎng)測(cè)定H2O2的吸光度變化、電化學(xué)測(cè)定H2O2或容量法滴定剩余的H2O2等方法。當(dāng)前84頁(yè)，總共127頁(yè)。2.谷胱甘肽過(guò)氧化酶(GPx)活性測(cè)定■生物學(xué)作用：清除脂類過(guò)氧化物和H2O2■測(cè)定方法直接法：直接測(cè)定GSH減少量，GSH在255nm處呈最大吸收，故從255nm吸光值減少量可計(jì)算GSH的消耗量。間接法：利用H2O2或有機(jī)過(guò)氧化物氧化GSH，同時(shí)加入NADPH及谷胱甘肽還原酶，使氧化的GSH重新轉(zhuǎn)變?yōu)镚SH，而NADPH轉(zhuǎn)變?yōu)镹ADP+，測(cè)定NADP+在340nm的吸光值可確定酶活性。當(dāng)前85頁(yè)，總共127頁(yè)。第四節(jié)致突變、致畸和致癌效應(yīng)檢測(cè)一、致突變效應(yīng)(一)基本概念狹義的突變僅指基因突變，而廣義的突變包括染色體畸變和基因突變。致突變作用:某些物質(zhì)引起生物體的遺傳物質(zhì)發(fā)生基因結(jié)構(gòu)改變的作用。致突變物:具有引起生物體基因突變的物質(zhì)。致突變物作用于生殖細(xì)胞可導(dǎo)致2種結(jié)果：

顯性致死突變、非致死性突變當(dāng)前86頁(yè)，總共127頁(yè)。(二)試驗(yàn)方法1.體外基因突變?cè)囼?yàn)(1)Ames試驗(yàn)Ames試驗(yàn)也稱鼠傷寒沙門(mén)氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)法。利用一種突變型微生物菌株與被檢化學(xué)物質(zhì)接觸，如該化學(xué)物具有致突變性，則可使突變性微生物發(fā)生回復(fù)突變，重新成為野生型微生物。正向突變野生型微生物突變型微生物（營(yíng)養(yǎng)缺陷型微生物）回復(fù)突變當(dāng)前87頁(yè)，總共127頁(yè)。(2)哺乳動(dòng)物體細(xì)胞株突變?cè)囼?yàn)■利用哺乳動(dòng)物突變細(xì)胞株發(fā)生回復(fù)突變，確定受試物是否具有致突變性?！龀Ｓ玫募?xì)胞株：V79、CHO、L5178YV79和CHO特點(diǎn)：■缺乏利用嘌呤堿的酶HGPRT(次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶)?！鋈绻谂囵B(yǎng)基中加入具有毒性的嘌呤類似物6-硫代鳥(niǎo)嘌呤TG或8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤AG等，由于細(xì)胞缺乏利用嘌呤的酶，在這種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。當(dāng)前88頁(yè)，總共127頁(yè)?！鰧?duì)于正常細(xì)胞，由于存在HGPRT，在上述培養(yǎng)基上，可利用TG或AG，致使細(xì)胞得不到所需的真正嘌呤堿，以致不能生長(zhǎng)?！鋈绻蛔冃图?xì)胞接觸了致突變物，即可發(fā)生回復(fù)突變成為正常細(xì)胞，此時(shí)又具有了利用嘌呤堿的酶，因此像正常細(xì)胞一樣具有利用毒性的嘌呤堿類似物，以致中毒細(xì)胞不能在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。借此可能確定突變細(xì)胞株是否發(fā)生了回復(fù)突變，可確定受試物是否具有致突變性。當(dāng)前89頁(yè)，總共127頁(yè)。2.染色體畸變?cè)囼?yàn)

利用光學(xué)顯微鏡直接觀察生物體細(xì)胞在受到致突變物作用后，染色體發(fā)生數(shù)目和結(jié)構(gòu)改變的情況?！鰴z測(cè)細(xì)胞CHO細(xì)胞外周血淋巴細(xì)胞當(dāng)前90頁(yè)，總共127頁(yè)。細(xì)胞周期當(dāng)前91頁(yè)，總共127頁(yè)。核小體和染色質(zhì)當(dāng)前92頁(yè)，總共127頁(yè)。染色體當(dāng)前93頁(yè)，總共127頁(yè)。有絲分裂當(dāng)前94頁(yè)，總共127頁(yè)。人的體細(xì)胞染色體當(dāng)前95頁(yè)，總共127頁(yè)?！鲈囼?yàn)方法將CHO細(xì)胞或人類外周血淋巴細(xì)胞于37度培養(yǎng)24或72h，同時(shí)加入受試物。收獲細(xì)胞前2h，加入秋水仙堿，使大量分裂細(xì)胞同步于分裂中期。經(jīng)離心得到細(xì)胞沉淀，經(jīng)固定、制片和染色，鏡檢有無(wú)染色體畸變。觀察計(jì)數(shù)各種類型畸變，如斷裂、缺失、易位及多處斷裂等。當(dāng)前96頁(yè)，總共127頁(yè)。3.細(xì)胞遺傳學(xué)試驗(yàn)——微核試驗(yàn)■微核:是染色單體或染色體的無(wú)著絲點(diǎn)斷片或因紡錘體受傷而失去的整個(gè)染色體，在分裂后期，仍留在細(xì)胞質(zhì)中，或因核膜受損后，核物質(zhì)向外突出延伸形成的一個(gè)或幾個(gè)有規(guī)則的圓形或橢圓形小體，其嗜染性與細(xì)胞核相似，比主核小，故稱微核?！鲆磺邪l(fā)生分裂的細(xì)胞，在染色體斷裂劑作用下，均能產(chǎn)生微核，因此可用微核率的變化來(lái)檢測(cè)誘變物。當(dāng)前97頁(yè)，總共127頁(yè)。4.體內(nèi)基因突變?cè)囼?yàn)(1)顯性致死突變?cè)囼?yàn)

（DominantLethalMutationTest）■檢測(cè)外來(lái)化合物對(duì)動(dòng)物生殖細(xì)胞染色體的致突變作用。■系統(tǒng)觀察胎鼠的成活情況因?yàn)椴溉閯?dòng)物生殖細(xì)胞染色體發(fā)生突變時(shí)（染色體斷裂或重組），往往不能與異性生殖細(xì)胞結(jié)合，或使受精卵在著床前死亡和胚胎早期死亡。當(dāng)前98頁(yè)，總共127頁(yè)。(2)果蠅伴性隱性致死試驗(yàn)■遺傳學(xué)原理致突變物可能在雄性果蠅配子X(jué)染色體上誘導(dǎo)隱性致死突變?！鰧⒔?jīng)處理的雄蠅與未處理的雌蠅交配，F(xiàn)1代雌蠅帶有來(lái)自父本的具致死突變的X染色體。由于致死突變?yōu)殡[性，所以F1蠅仍能夠正常生長(zhǎng)、發(fā)育和生殖?！鰧1雌蠅與子一代雄蠅交配，則將有半數(shù)雄合子是含有經(jīng)受試物處理的雄蠅的X染色體，此時(shí)X染色體上隱性致死基因得以表現(xiàn)，引起此雄蠅死亡。當(dāng)前99頁(yè)，總共127頁(yè)。(3)姐妹染色單體交換試驗(yàn)（SisterChromatideExchangeTest，SCE）■SCE可能與DNA的斷裂和重聯(lián)相關(guān)?！龊芏嗷瘜W(xué)致突變物或致癌物可以大幅度地增加SCE頻率?！鰧?shí)驗(yàn)方法以5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu）代替胸腺嘧啶核苷，DNA復(fù)制后，用熒光染料染色，可觀察到SCE。當(dāng)前100頁(yè)，總共127頁(yè)。5.染色體損傷試驗(yàn)—DNA修復(fù)合成試驗(yàn)（UnscheduledDNASynthesis，UDS）■細(xì)胞對(duì)其損傷DNA具有修復(fù)能力?！黾?xì)胞與化學(xué)物質(zhì)接觸后，若能誘導(dǎo)DNA修復(fù)合成，即可據(jù)此推斷該化學(xué)物質(zhì)具有損傷DNA的潛力?！鰧?shí)驗(yàn)方法用羥基脲抑制細(xì)胞周期中S期的DNA半保留復(fù)制，用標(biāo)記的脫氧胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)摻入法測(cè)定非S期DNA合成的3H-TdR量。當(dāng)前101頁(yè)，總共127頁(yè)。二、致畸效應(yīng)1.基本概念致畸作用（Teratogenesis）■胚胎在發(fā)育過(guò)程中，由于受到某種因素的影響，使胚胎的細(xì)胞分化和器官形成不能正常進(jìn)行，而造成器官組織上的缺陷，并出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的形態(tài)結(jié)構(gòu)異常者成為畸形?！龇材芤鹋咛グl(fā)育障礙而導(dǎo)致胎兒發(fā)生畸形的物質(zhì)稱為致畸物或致畸原（Teratogen）?！?000多種環(huán)境因素可引起動(dòng)物和人的畸胎。當(dāng)前102頁(yè)，總共127頁(yè)。致畸作用的毒理學(xué)特點(diǎn)■胚胎與致畸物接觸時(shí)，可因胚胎所處的發(fā)育階段不同而呈現(xiàn)不同的敏感性。如器官形成期?！霾煌N屬在致畸作用中呈現(xiàn)不同的敏感性。當(dāng)前103頁(yè)，總共127頁(yè)?；瘜W(xué)致畸作用機(jī)理■突變引起胚胎發(fā)育異常?！鰧?duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化較為重要的酶類受到抑制?！瞿阁w正常代謝過(guò)程被破壞?！黾?xì)胞分裂過(guò)程的障礙：引起生殖細(xì)胞減數(shù)分裂中的不分離或細(xì)胞有絲分裂過(guò)程的障礙等，均可使某些細(xì)胞死亡。當(dāng)前104頁(yè)，總共127頁(yè)。2.試驗(yàn)方法■動(dòng)物選擇動(dòng)物對(duì)受試物的代謝過(guò)程應(yīng)基本上與人類相似（大鼠、小鼠和家兔）?！鰟┝糠纸M采用鼠類為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，每組不少于15-20只，一般劑量為L(zhǎng)D50的1/3-1/2為高劑量組，LD50的1/30-1/100為低劑量組。■受試動(dòng)物處理：受孕，灌胃方法染毒■受試動(dòng)物解剖：胎仔外部檢查、骨骼檢查內(nèi)臟檢查等。當(dāng)前105頁(yè)，總共127頁(yè)。三、致癌效應(yīng)1.基本概念■化學(xué)致癌作用化學(xué)物質(zhì)引起腫瘤的過(guò)程■化學(xué)致癌物能誘發(fā)腫瘤的化學(xué)物質(zhì)當(dāng)前106頁(yè)，總共127頁(yè)。細(xì)胞癌變學(xué)說(shuō)（1）體細(xì)胞突變學(xué)說(shuō)認(rèn)為致癌因素包括化學(xué)、物理、生物因素等，作用于體細(xì)胞的遺傳物質(zhì)DNA，使其發(fā)生了突變，其結(jié)果使細(xì)胞的功能發(fā)生異常改變而致癌，即癌變形成的基礎(chǔ)是體細(xì)胞發(fā)生了突變。當(dāng)前107頁(yè)，總共127頁(yè)。（2）分化障礙學(xué)說(shuō)認(rèn)為細(xì)胞癌變不一定需要體細(xì)胞遺傳物質(zhì)發(fā)生突變，而只是分化過(guò)程中有關(guān)基因調(diào)控過(guò)程受到致癌因素的干擾，使細(xì)胞分化和增殖發(fā)生紊亂而出現(xiàn)癌變。當(dāng)前108頁(yè)，總共127頁(yè)。（3）癌基因?qū)W說(shuō)認(rèn)為所有細(xì)胞DNA分子中都存在有癌基因的遺傳信息，正常情況下它們處于阻遏狀態(tài)，只有細(xì)胞內(nèi)有關(guān)的調(diào)節(jié)機(jī)制遭到破壞后，癌基因才能表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生癌變，形成腫瘤。當(dāng)前109頁(yè)，總共127頁(yè)。癌變過(guò)程及其機(jī)理——癌的形成3階段■引發(fā)階段通過(guò)致癌物的作用，使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞的過(guò)程?！龃匍L(zhǎng)階段經(jīng)過(guò)引發(fā)的癌細(xì)胞不斷增殖直至形成一個(gè)臨床上可被檢出之腫塊的過(guò)程?！鼋?rùn)和轉(zhuǎn)移階段已形成的腫塊不斷發(fā)展，逐漸侵害周圍的正常組織，并擴(kuò)散到較遠(yuǎn)的部位。當(dāng)前110頁(yè)，總共127頁(yè)。2.試驗(yàn)方法■致癌試驗(yàn)是檢驗(yàn)受試物及其代謝產(chǎn)物是否具有致癌作用或誘發(fā)腫瘤作用的慢性毒性試驗(yàn)方法。■方法短期篩選方法長(zhǎng)期動(dòng)物誘癌試驗(yàn)當(dāng)前111頁(yè)，總共127頁(yè)。（1）短期篩選方法利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外轉(zhuǎn)化，觀察培養(yǎng)細(xì)胞與各種化學(xué)或物理致癌劑接觸后發(fā)生一系列表型改變，在通過(guò)增殖，這些表型變異的細(xì)胞形成與正常細(xì)胞不同的集落，即轉(zhuǎn)化集落。通過(guò)轉(zhuǎn)化集落的存在和轉(zhuǎn)化集落形成率以及轉(zhuǎn)化細(xì)胞接種裸鼠中發(fā)生腫瘤來(lái)評(píng)價(jià)化學(xué)物的致癌活性。當(dāng)前112頁(yè)，總共127頁(yè)。（2）長(zhǎng)期動(dòng)物誘癌試驗(yàn)■試驗(yàn)動(dòng)物及飼料要求選用抗病力強(qiáng)、容易飼養(yǎng)、腫瘤自發(fā)率低、對(duì)受試物敏感的動(dòng)物?！鰟┝糠纸M及染毒途徑和期限設(shè)對(duì)照組、最大耐受劑量組和2個(gè)中間劑量組?！鲇^察指標(biāo)一般檢查、腫瘤發(fā)生、病理學(xué)檢查、潛伏期、平均腫瘤數(shù)等■結(jié)果判斷當(dāng)前113頁(yè)，總共127頁(yè)。第五節(jié)微宇宙法一、微宇宙法簡(jiǎn)介