基因工程技術(shù)簡要介紹

基因工程技術(shù)簡要介紹第一頁，共二十二頁，2022年，8月28日基因工程的操作流程第二頁，共二十二頁，2022年，8月28日

將外源基因（又稱目的基因，是一段

DNA片斷）組合到載體DNA

分子中去，再把它轉(zhuǎn)到受體細(xì)胞（亦稱寄主細(xì)胞）中去，使外源基因在寄主細(xì)胞中增值和表達(dá)，從而得到期望的由這個外源基因所編碼的蛋白質(zhì)。第三頁，共二十二頁，2022年，8月28日所以，基因工程的操作包含以下步驟：

獲得目的基因

構(gòu)造重組DNA分子

轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染

表達(dá)

蛋白質(zhì)產(chǎn)物的分離純化第四頁，共二十二頁，2022年，8月28日

到哪里去找目的基因？

從組織細(xì)胞中可以分離得到人/小鼠的全套基因，稱為基因文庫。文庫中基因總數(shù)就人來說約有3萬個基因。如何從中把需要的基因找出來？采取“釣”的辦法。這個辦法通常稱為印跡法。（1）獲得目的基因第五頁，共二十二頁，2022年，8月28日印跡法內(nèi)切酶切開DNA電泳印跡轉(zhuǎn)移放射性探針雜交膠片顯影第六頁，共二十二頁，2022年，8月28日印跡法的主要步驟：

（1）基因文庫－DNA用限制性內(nèi)切

酶處理。

（2）DNA片斷混合物通過電泳分離。

（3）電泳后，通過印跡技術(shù)轉(zhuǎn)到酯酰

纖維薄膜上，以便操作。

（4）用已知小片斷DNA作為探針，

互補(bǔ)結(jié)合需要找的基因片斷。

（5）探針DNA片斷已用放射性元素

標(biāo)記，使膠片感光后可看出。第七頁，共二十二頁，2022年，8月28日印跡法的關(guān)鍵是“分子雜交”，利用堿基配對的原則，用一段小的已知的DNA片斷去尋找（“釣”）大的未知的基因片斷。

探針DNA片斷從何而來？

根據(jù)目的蛋白的氨基酸序列，只要其中N－端15-20個氨基酸序列，按三聯(lián)密碼轉(zhuǎn)為40-60核苷酸序列，人工合成，即為探針DNA片斷。第八頁，共二十二頁，2022年，8月28日（2）目的基因的擴(kuò)增用上面的方法“釣”出的目的基因，數(shù)量極少，所以，接下來必須經(jīng)過擴(kuò)增，亦稱為基因克隆。獲得相當(dāng)數(shù)量的目的基因后，才能繼續(xù)下一步操作。第九頁，共二十二頁，2022年，8月28日（3）PCR——把尋找目的基因和擴(kuò)增目的基因兩步操作并成一步。

PCR法，又稱多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是近年來開發(fā)出來的基因工程新技術(shù)，它的最大優(yōu)點(diǎn)是把目的基因的尋找和擴(kuò)增，放在一個步驟里完成。第十頁，共二十二頁，2022年，8月28日PCR操作流程90

0C500C700C返回第十一頁，共二十二頁，2022年，8月28日PCR反應(yīng)分三步完成：

第一步——90

0C高溫下，使混合物的DNA片斷因變性而成單鏈。

第二步——500C溫度下，引物DNA結(jié)合在適于配對的DNA片斷上。

第三步——700C溫度下，由合成酶（DNA高溫聚合酶）催化，從引物開始合成目的基因DNA。第十二頁，共二十二頁，2022年，8月28日

PCR的三個步驟為一次循環(huán)，約需5－10分鐘。每經(jīng)一次循環(huán)，所找到的目的基因擴(kuò)充一倍。經(jīng)過20次循環(huán)，即可擴(kuò)增

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倍，總共只需幾個小時。第十三頁，共二十二頁，2022年，8月28日（4）構(gòu)造重組DNA分子首先要有載體。

載體有好幾種，常用的有：

質(zhì)粒－－環(huán)狀雙鏈小分子DNA，適于做小片斷基因的載體。

噬菌體DNA－－線狀雙鏈DNA，適于做大片斷基因的載體。第十四頁，共二十二頁，2022年，8月28日返回用質(zhì)粒構(gòu)建重組DNA分子第十五頁，共二十二頁，2022年，8月28日返回用噬菌體DNA構(gòu)建重組DNA分子第十六頁，共二十二頁，2022年，8月28日

其次要把目的基因“裝”到載體中去?！鞍惭b”的過程，需要好幾種工具酶，其中關(guān)鍵的酶叫限制性內(nèi)切酶。

此酶識別一定堿基序列，有的還可切出“粘性”末端，使得目的基因和載體的連接非常容易。圖一圖二第十七頁，共二十二頁，2022年，8月28日下圖限制性內(nèi)切酶識別特定的堿基序列第十八頁，共二十二頁，2022年，8月28日返回限制性內(nèi)切酶造成粘性末端有利于重組DNA分子的構(gòu)建第十九頁，共二十二頁，2022年，8月28日（5）轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染—表達(dá)—蛋白質(zhì)分離

把構(gòu)造好的重組DNA分子送進(jìn)寄主細(xì)胞，亦需要適當(dāng)?shù)募夹g(shù)方法。若受體細(xì)胞是細(xì)菌，通常稱轉(zhuǎn)化；若受體細(xì)胞是動/植物細(xì)胞，通常稱轉(zhuǎn)染。第二十頁，共二十二頁，2022年，8月28日

重組DNA分子進(jìn)入寄主細(xì)胞后，其中的目的基因能否表達(dá)，表達(dá)效率高低，還有很大差別。表達(dá)通常是指