動物組織與胚胎工程

動物組織與胚胎工程第1頁/共56頁修復(fù)缺損器官的方法一般有自體移植、異體移植和組織代用器三種。第2頁/共55頁第2頁/共56頁1、人體組織與器官的基本結(jié)構(gòu)第3頁/共55頁第3頁/共56頁人體組織由細胞及支撐細胞的細胞外間質(zhì)構(gòu)成extra-cellularmatrix)

細胞外間質(zhì)組成包括：collagen,glycoprotein,hyaluronicacid,proteoglycan,elastin,fibronectin,growthfactors,cytokinesetc.第4頁/共55頁第4頁/共56頁2、組織工程的三要素

細胞、支架、信號第5頁/共55頁第5頁/共56頁A、細胞必須能不斷進行細胞分裂，且必須能被調(diào)控分化成特定的組織細胞

干細胞：胚胎干細胞、成體干細胞

組織來源細胞自體或異體Growthfactorstimulation第6頁/共55頁第6頁/共56頁第7頁/共55頁第7頁/共56頁第8頁/共55頁第8頁/共56頁B、組織生長支架需求：

（1）、生物親和性

（2）、生物可降解性

（3）、三維內(nèi)部連通孔隙

（4）、具備支架強度。

第9頁/共55頁第9頁/共56頁蛋白質(zhì)支架

多糖支架

磷酸鈣基生物材料

硫酸鈣基生物材料第10頁/共55頁第10頁/共56頁C、生長因子

表皮生長因子：是對上皮細胞增殖有很強促進作用的53個氨基酸殘基的多肽。

神經(jīng)生長因子：為神經(jīng)細胞特異性分泌的營養(yǎng)蛋白。

肝細胞生長因子：為728個氨基酸殘基單鏈組成。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白：能誘導(dǎo)或刺激新骨的生成。

第11頁/共55頁第11頁/共56頁3、技術(shù)路線

（1）體外得到工程化組織、移植——目前主要的方式

（2）細胞與支架前體混合注射體內(nèi)，原位形成凝膠支架，提供新組織形成的空間

第12頁/共55頁第12頁/共56頁皮膚修復(fù)第13頁/共55頁第13頁/共56頁骨修復(fù)第14頁/共55頁第14頁/共56頁4、已取得成就

第一個組織工程產(chǎn)品人工皮膚已于1997年3月經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)上市。

這種產(chǎn)品是器官基因公司培養(yǎng)出的，被稱為"適移植"的活性皮膚，它由新生兒的包皮細胞培植而成，呈層狀結(jié)構(gòu)，與正常人的皮膚極為相似，能分泌人體皮膚膠原、生長因子和結(jié)構(gòu)性蛋白，可與病人自身的皮膚很好地融合，不存在排異作用，就連病人自身的血管和色素也會逐漸轉(zhuǎn)移到"適移植"活性皮膚中去，愈后不留瘢痕。第15頁/共55頁第15頁/共56頁2000年3月10日，AdvancedTissueSciences公司宣布成功研制出促進心肌血管形成的產(chǎn)品。該產(chǎn)品應(yīng)用后14天即開始形成新的血管。

據(jù)悉，用來修復(fù)或取代受損的人體軟骨組織的組織工程產(chǎn)品人工軟骨也即將上市。

第16頁/共55頁第16頁/共56頁第二節(jié)、胚胎工程

胚胎工程（embryoengineering）是指所有對配子和胚胎進行人為地干預(yù)，使其環(huán)境因素、發(fā)育模式或局部組織功能，發(fā)生量和質(zhì)的變化的綜合技術(shù)。

包括：胚胎移植、胚胎融合、胚胎分割、胚胎冷凍、胚胎性別鑒定、胚胎細胞核移植、轉(zhuǎn)基因操作等

第17頁/共55頁第17頁/共56頁一、胚胎移植

（embryotransfer)第18頁/共55頁第18頁/共56頁（一）、概念及應(yīng)用胚胎移植（embryotransfer)也稱受精卵移植，是指一頭母畜（稱為“供體”）發(fā)情排卵并經(jīng)過配種后，在一定時間內(nèi)從其生殖道（輸卵管或子宮角）取出受精卵或胚胎，然后把它們移植到另外一頭與供體同時發(fā)情排卵、但未經(jīng)配種的母畜（稱為“受體”）的輸卵管或子宮角。這個來自供體的胚胎能夠在受體的子宮著床，并繼續(xù)生長和發(fā)育，最后產(chǎn)下供體的后代。“借劣質(zhì)動物之腹懷優(yōu)秀個體之胎”第19頁/共55頁第19頁/共56頁胚胎移植成功的羊第20頁/共55頁第20頁/共56頁第21頁/共55頁第21頁/共56頁2.胚胎移植的應(yīng)用范圍在家畜改良方面的應(yīng)用在特定品種擴繁上的應(yīng)用在動物生物多樣性上的應(yīng)用其它方面應(yīng)用：轉(zhuǎn)基因動物、性別控制、體外受精第22頁/共55頁第22頁/共56頁2.1在家畜改良方面的應(yīng)用人工授精技術(shù)可成幾十到幾百倍地提高了優(yōu)秀種公畜的配種效能。但對優(yōu)秀母畜來說，受其產(chǎn)仔數(shù)和世代間隔的限制，尤其是牛羊等繁殖力較低的畜種更是如此。通過超數(shù)排卵和胚胎移植技術(shù)（multipleovulationandembryotransfer:MOET)牛羊的生長性狀年遺傳進展可比正常繁殖提高80%和70%；產(chǎn)奶性狀提高33%。第23頁/共55頁第23頁/共56頁2.2在特定品種擴繁上的應(yīng)用牛羊等低繁殖力家畜，從引進到形成一個純種群體需要7-8個世代，15-20年。而采用MEOT法，一次就可獲得一個純種群體。80年代初，美、澳、新從歐洲引進的大型肉牛品種均采用胚胎移植技術(shù)擴繁。2000年前后，我國的波爾山羊也是采用胚胎移植進行擴繁的。第24頁/共55頁第24頁/共56頁2.3在動物生物多樣性上的應(yīng)用在保護動物遺傳資源，提高家畜生產(chǎn)性能，挽救瀕臨滅絕的野生動物方面，胚胎移植技術(shù)越越來發(fā)揮出重要作用。冷凍能夠很好地保存瀕臨滅絕動物的胚胎或生殖細胞，但該種動物雌性個體的減少，也是這種動物的胚胎或生殖細胞無法得到移植，科學(xué)家開始研究在該種動物的亞種或親緣種中試驗，并取得一些成功。如斑馬胚胎移植給馬，蒙古馬胚胎移植給驢，白肢野牛移植給荷斯坦牛。第25頁/共55頁第25頁/共56頁2.4其它方面應(yīng)用胚胎移植是克隆技術(shù)的必須過程體外受精必須借助胚胎移植實現(xiàn)“試管嬰兒的繼續(xù)發(fā)育轉(zhuǎn)基因及動物生物反應(yīng)器的研究也必須借助胚胎移植第26頁/共55頁第26頁/共56頁（二）胚胎移植的生理基礎(chǔ)及原則1.胚胎移植的生理學(xué)基礎(chǔ)2.胚胎移植的基本原則第27頁/共55頁第27頁/共56頁1.胚胎移植的生理學(xué)基礎(chǔ)成年母畜卵巢上存在數(shù)千到上萬個卵泡，在外源激素作用下，每個發(fā)情期的卵泡發(fā)育和排卵數(shù)可達十?dāng)?shù)個每個發(fā)情周期生殖器官都有一個孕向發(fā)育早期胚胎處于游離狀態(tài)胚胎發(fā)育不存在免疫問題胚胎發(fā)育到一定階段會與子宮發(fā)生生理和組聯(lián)系胚胎的遺傳性不受受體的影響第28頁/共55頁第28頁/共56頁2.胚胎移植的基本原則胚胎移植前后所處的環(huán)境的同一性供體和受體在分類學(xué)上的相同屬性動物生理上的一致性：受體和供體在發(fā)情時間上的同期性動物解剖位置上的一致性：空間環(huán)境的一致性胚胎的發(fā)育期限：必須處于周期黃體期內(nèi)胚胎的質(zhì)量：胚胎必須是正常的，并在處理過程中不受不良因素的影響第29頁/共55頁第29頁/共56頁（三）、胚胎移植的技術(shù)程序1.供體和受體的選擇2.超數(shù)排卵處理3.供體母畜的配種4.胚胎的收集5.胚胎的檢查6.胚胎的保存與培養(yǎng)7.胚胎的移植8.供體和受體的術(shù)后觀察第30頁/共55頁第30頁/共56頁第31頁/共55頁第31頁/共56頁1.供體和受體的選擇供體應(yīng)具有相當(dāng)高的育種價值供體生殖機能應(yīng)處于較高的狀態(tài)：產(chǎn)后60天以上，無生殖系統(tǒng)疾病，體質(zhì)強健受體應(yīng)容易購買，繁殖性能好，對地方適應(yīng)性強，體型中上等，非優(yōu)良品種受體健康狀況良好，已進入發(fā)情季節(jié)供受體發(fā)情時間應(yīng)接近或一致第32頁/共55頁第32頁/共56頁2.超數(shù)排卵處理利用促性腺激素處理，使得卵巢中有更多的卵泡發(fā)育，更多的卵被排出，這個過程就稱為超數(shù)排卵（superovulation）意義：讓每個供體提供更多的胚胎處理時間：牛：預(yù)計自然發(fā)情時間的前4天，或發(fā)情周期的第16-17天羊：發(fā)情周期的第12-15天，促性腺激素處理的第二天或第三天，注射PG第33頁/共55頁第33頁/共56頁3.供體母畜的配種必須用優(yōu)秀的種公畜進行多次配種，一般隔8-12小時進行一次配種，直到發(fā)情結(jié)束。配種前應(yīng)對種公畜的精液進行質(zhì)量檢查。可優(yōu)秀種公畜不足時，可考慮首次采用本交，以后采用人工授精，也可以全部采用人工授精。第34頁/共55頁第34頁/共56頁4.胚胎的收集胚胎沖洗液的配制：杜氏磷酸緩沖液PBS，布林斯特液SOF合成輸卵管液手術(shù)法收集胚胎輸卵管沖胚：順向沖胚、逆向沖胚子宮角沖胚非手術(shù)法收集胚胎二路法三路法第35頁/共55頁第35頁/共56頁收集到的沖洗液靜置，沖洗液分離。揀胚：將胚胎移至培養(yǎng)液或保存液中。胚胎鑒定：根據(jù)透明帶、胚胎細胞、發(fā)育階段及細胞在透明帶中的比例確定胚胎級別。5.胚胎的檢查第36頁/共55頁第36頁/共56頁第37頁/共55頁第37頁/共56頁6天收集的胚胎（未揀）第38頁/共55頁第38頁/共56頁二細胞至四細胞胚胎

第39頁/共55頁第39頁/共56頁胚胎的降溫：使胚胎停止發(fā)育，延長其體外生存時間體外培養(yǎng)：將胚胎置于體溫條件下，在培養(yǎng)液中，使其繼續(xù)發(fā)育胚胎冷凍：通過一定的處理程序，將胚胎降溫冷凍后，保存于液氮中6.胚胎的保存第40頁/共55頁第40頁/共56頁冷藏保存法低于室溫，但還達不到冷凍階段的溫度對胚胎進行保存即為冷藏保存法，一般在0－10℃左右保存。由于低溫，可以抑制物質(zhì)代謝的速度和細胞分裂的速度，因之可以延長保存時間。第41頁/共55頁第41頁/共56頁冷凍法冷凍法是指－196℃保存胚胎，在進行超低溫冷凍前，必須進行冷凍保護劑處理。一般說來，在－80℃以上時，細胞則逐漸失去活力，到－130℃以下，細胞內(nèi)的水分呈微細冰晶樣或玻璃樣結(jié)構(gòu)，細胞內(nèi)所有需要能量的反應(yīng)停止，細胞的活動也幾乎停止。最早，小鼠中獲得成功。第42頁/共55頁第42頁/共56頁手術(shù)法移植非手術(shù)法移植7.胚胎移植第43頁/共55頁第43頁/共56頁供體和受體的抗炎處理健康狀況檢查返情狀況檢查妊娠檢查及妊娠確定8.供體和受體的術(shù)后觀察及處理第44頁/共55頁第44頁/共56頁胚胎移植產(chǎn)出的犢牛第45頁/共55頁第45頁/共56頁一次移入三枚胚全部成活第46頁/共55頁第46頁/共56頁受體母羊與所生羔羊第47頁/共55頁第47頁/共56頁二、胚胎嵌合

嵌合體（chimera）是指在同一個體中，由于基因型不同的細胞或組織互相接觸，且各自獨自并存的狀態(tài)

發(fā)育早期，如卵裂球甚至受精卵所形成的嵌合體稱為原發(fā)性嵌合體，而把在發(fā)育的較晚期，如胚層已經(jīng)分化，或器官開始形成后，通過組織移植或嫁接等方法所形成的部分組織或器官的嵌合，稱為次生性嵌合體

第48頁/共55頁第48頁/共56頁胚胎嵌合方法

聚合法

第一種可以利用胚胎與胚胎聚合，即使用發(fā)生致密化后的胚胎，用酸性臺氏液（pH2.5）或0.5％鏈霉蛋白酶除去透明帶，充分洗滌后，放入含有5μg/ml植物凝集素A（PHA）的聚合液滴中。讓一個胚胎垂直位于另一胚胎之上，借機械壓力和PHA的作用，更易聚合。若放到37℃時，效果更佳，聚合完畢后，洗除PHA，繼續(xù)培養(yǎng)，或進行胚胎移植。

第49頁/共55頁第49頁/共56頁有色鼠與白色鼠胚胎融合第50頁/共55頁第50頁/共56頁胚胎嵌合的鑒定

兩種：色素分析法和遺傳分析法

色素分析法簡單、直觀，比較實用。一般選用膚色、毛色差異明顯的