代謝組學(xué)數(shù)據(jù)挖掘及分析操作SOP

1)2)3)4)5)File:wll-NKdQC-N-1-N-1□.醉口imicn[m/z|:1K1)2)3)4)5)File:wll-NKdQC-N-1-N-1□.醉口imicn[m/z|:1KFunction-|}7DFM5jlD4.：1200|E5- v]OE-artsperirilicti?Ah?^rdow[□pidoc町Mas：ChicmnaiograrnWindow-N-1代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析操作SOP應(yīng)用Masslynx的離線軟件進(jìn)行色譜峰自動識別，峰匹配（峰對齊）和歸一化處理，生成biomarkers；（需較長時間撮好在臺式電腦上操作比較快）將生成的biomarkers導(dǎo)入simca-p12.0進(jìn)行PCA分析，如果分的好采用此種方式，如果分的不好可進(jìn)行剔除圈外點后進(jìn)行PLS-DA分析，且進(jìn)一步剔除圈外點（注：不是所有在圈外的點都應(yīng)該剔除，選擇性剔除較遠(yuǎn)點后，有的較近的點會自然落在圈內(nèi)）；Simca-p比較適合兩組間的比較，所以組數(shù)不要太多，且分的組數(shù)比每組的樣本數(shù)還多是絕對不允許的；在PCA或者PLS-DA生成的scores圖中可以看到各組間聚集效果，可以設(shè)置相應(yīng)參數(shù)。在loading圖中可以生成vip值列表，挑選VIP>1的化合物進(jìn)行下一步分析，如果太多可以選擇峰面積比值在2以上的標(biāo)志物為主要標(biāo)志進(jìn)行下一步分析；對simca-p進(jìn)行的兩兩比較的組，同樣進(jìn)行t-test檢驗，P<0.05表示有顯著性差異；同時滿足以上兩點的化合物可作為第1輪的標(biāo)志物；在masslynx軟件中，選擇QC樣本的色譜峰，對以上標(biāo)志物進(jìn)行峰提取，點擊該圖標(biāo)輸入分子量，按住鼠標(biāo)右鍵，拖拉出平均分子量（我們會發(fā)現(xiàn)平均分子量對應(yīng)的出峰時間與masslynx處理數(shù)據(jù)后的出峰時間不一樣，后者是所有樣品在該點出峰的平均出峰時間，而前者是輸入該分子量后提出來的平均時間，因此不同，但一般在0.05的范圍內(nèi)偏差是可以接受的。）7）找出提取的峰為該時間點上最強峰的離子峰（如果有二倍體峰[2（M+1）-1],更有說服力）,定為標(biāo)志物，否則直接舍棄，可能是碎片峰或者基線波動。所有的分子量都應(yīng)該提取平均的分子量,不能直接點擊否則會有挺大誤差.通過此步后會篩除一部分化合物，得到第2輪的標(biāo)志物。注：一般1min以前的很可能是溶劑峰,可以先提取平均分子量,看下與質(zhì)譜出來的分子量是否一致,一般即便去鑒別,鑒別出來的化合物也不對.不是極性不可能,就是這個化合物不可能出現(xiàn)在這里.首先看該峰的信噪比，定性的峰高必須是基線的3倍以上，否則直接剔除掉；如果為母粒子，一般有二倍體峰M=[2（M+1）-1]，如果沒有，該峰前面還有更大分子量的峰，可以進(jìn)行比較，看是否為常見碎片，一般相差1,18等，雖然TOF不能較徹底打碎化合物,但由于質(zhì)譜的軟電離,也會有簡單的打碎.如果可能是碎片的就排除,如果不是碎片的可以保留,很有可能是標(biāo)志物（一般標(biāo)志物有多少就看QC樣本的峰有多少,一般不會超過30個，即使血清有1000+個化合物,但能在UPLC-TOF中保留的并不多，而且即使有峰也不一定就是標(biāo)志物）.如果遇到同分異構(gòu)體無法確定的,可以去google學(xué)術(shù)中看同樣是尿或者血清樣本的代謝組學(xué)研究，無論研究的是什么藥，只要有過某一同分異構(gòu)體的文獻(xiàn)描述，且較多的，就可以相互佐證是這個標(biāo)志物了。8）通過以上篩選后的化合物進(jìn)行HMDB數(shù)據(jù)庫篩選，選出內(nèi)源性的物質(zhì)作為標(biāo)志物，并與masslynx軟件中的I-FIT功能，對所篩查到的具有顯著性差異的代謝物進(jìn)行分析，計算其可能的分子式,一般同位素匹配度越好，質(zhì)量偏差越小的化合物為正確化合物的可能性大（其實一般上述步驟篩選結(jié)束后不需要再用I-fit功能了）。這些標(biāo)志物可能有同分異構(gòu)體或者相同分子量的不同化合物，也有可能是含量較大的碎片峰，這是第3輪的標(biāo)志物。isfoundinalcoholicbeveragesisfoundinpomes/cloves/fatsandoils/fishes/nuts/corn/mushroomsisaflavouringingredientisusedasafoodadditiveisafoodflavorant/fruitflavouringisfoundincitrus/inmilkandmilkproducts/brassicas/greenvegetables/cerealsandcerealproducts/foundinanimalfoodsisfoundinherbsandspicesisderivedfrombacterialorplantsourcesisonlyfoundinindividualsthathaveusedortakenthisdrugisisolatedfromleavesofSteviarebaudiana（stevia）.isanormalurinary.../foundinnormalurineissynthetic..以上敘述的，都不用考慮，不是內(nèi)源性的物質(zhì)；還要看BiofluidLocations位置是否在尿樣，血樣或者自己所屬的樣本中。此外的看Origin是否是endogenous的。關(guān)于質(zhì)譜測定分子量與實際分子量間的差距，一般負(fù)模式下，質(zhì)譜出來的MASS，需要加上H的分子量，M（H）=1.01（具體值忘記了，總之不是1）9）將上一步所得的第三輪標(biāo)志物做UPLC-QTOF二級譜打碎，通過物質(zhì)的軟電離打碎情況去初步驗證是否為該化合物。在HMDB中去查找第3輪標(biāo)志物的結(jié)構(gòu)文件（.mol）并將血清及尿樣的標(biāo)志物分別保存在不同文件夾中，如果有同分異構(gòu)體或者不能判斷的均編相同號保存。二級打碎后，在相應(yīng)的離子通道中提取該分子量的峰，并找到其二級譜，進(jìn)過二級打碎后，母粒子的含量會減少很多，且一般不會再有二倍體峰出現(xiàn)。在masslynx的list界面中找到某一進(jìn)樣樣品，點擊chromatogram按鈕，進(jìn)入chromatogram界面，點擊菜單欄中的display，

點擊Tic...選項，處理不同的質(zhì)荷比通道，選擇你輸入的不同通道，在圖中任意位置右擊就能看見你所輸入的質(zhì)荷比通道。然后看該質(zhì)荷比在你原來色譜中出峰時間，對改峰進(jìn)行右擊拖拉出平均分子量，出來的就是二級譜圖。再在二級譜圖中，選擇Tools菜單選項下的MassFragment..選項，選擇該質(zhì)荷比的.mol文件導(dǎo)入，在線搜索出該質(zhì)荷比物質(zhì)可能的碎片結(jié)構(gòu)，嫩綠色表示可能性較大，紅色短線表示其斷裂位置，灰色表示斷掉的碎片。同分異構(gòu)可以通過這樣的方法去鑒別，匹配度越高，碎片重合越多，可能性越大。如果還有不能確定的同分異構(gòu)可在文獻(xiàn)中輸入該物質(zhì)，一般報道其為內(nèi)源性物質(zhì)的文獻(xiàn)越多，該內(nèi)源性物質(zhì)研究的文獻(xiàn)越多，那么這個質(zhì)荷比為該結(jié)構(gòu)的可能性越大。進(jìn)而最終得至第4輪標(biāo)志物。1drautiiEraA-bEl-bhufl-FISIS-SlJlileEUt9frowES]i止Helpi首國覇盼電1drautiiEraA-bEl-bhufl-FISIS-SlJlileEUt9frowES]i止Helpi首國覇盼電IBLiiLl0A〕3：?11.型：珀.打:迓■■二［了口1丿斗二Z川卜FileltaaFileEiit計國凰|術(shù)圉亀|lL刨?島團(tuán)黒務(wù)|坨11；329；313；311；526-bload-N-MSMS-322[2.179]Cm[21:23]Displayhocess如咖HelpFk:Function:2:TOFMSMSfEO:9JOlESteV3:TOFMSMS(:0-500IESI>V4.10FMSMSfKi.SaOlES-&=V5:TOFMSM